Introduction
Кишечная функционирует нервная система (ENS), которая контролирует моторику, всасывание питательных веществ, и местный кровоток, имеет важное значение для жизни 1. ЭНС формируется клеток нервного гребня (НКЦ), которые пролиферируют, мигрируют и колонизировать кишечник, где они дифференцироваться в ганглиев содержащих нейронов и глиальных клеток. Болезнь Гиршпрунга (HSCR, Интернет Законы Менделя в человеке), multigeneic врожденный порок с частотой 1 в 4000 живорожденных, можно считать прототипом для изучения болезни нарушенного образование ENS. В HSCR, НКК не мигрируют и колонизировать переменной длины дистального кишки 2. Кроме того, другие общие желудочно (GI) пороки развития в педиатрической популяции, такие как аноректальной пороками развития, кишечных atresias и нарушений моторики связаны с нарушениями в основных функций ENS, и, вероятно, связано с тонкими, недооцененных, анатомических изменений и функциональных изменений вENS 3-6. Таким образом, методы, которые позволяют нам понять детерминанты развития образования ENS может пролить свет на патогенез и потенциального лечения расстройств желудочно-кишечного тракта у детей.
После миграции и колонизации, НКК дифференцируется в нейроны с маркеров, специфических для их фенотипа нейромедиатора. Холинергических нейронов содержат приблизительно 60% кишечных нейронов 7, и могут быть обнаружены путем окрашивания по холинацетилтрансферазы (ХАТ), синтезирующего фермента на возбуждающий нейротрансмиттер ацетилхолин. Исторически, попытки визуализировать холинергические нейроны смешивать с различной антигенной специфичности антител, направленных против центральной нервной системы (ЦНС) ХАТ в сравнении периферической нервной системы (ПНС) ХАТ 8-10. Тем не менее, антитела, направленные против плаценты ChAT признать как центральную и периферическую Чат 11-13, и мы в последнее время описанные методы, которые позволяют visuaлизация из ENS холинергических нейронов с высокой чувствительностью ранее в развитии чем была достигнута с чатом репортер линий 14.
Здесь мы представляем технику для рассечения, фиксация и иммунное мышиного эмбрионального желудочно-кишечного тракта для визуализации выражение нейромедиатора ENS в нейронах. Для этих исследований, мы использовали мышей Чат CRE повязана с R26R: floxSTOP: tdTomato животных для производства Чат Cre; R26R: floxSTOP: tdTomato мышей (определенные как чат-Cre tdTomato всей рукописи). Эти животные были затем скрещивали с гомозиготных Чат-GFP репортер мышей, чтобы получить мышей, экспрессирующих обе флуоресцентные журналистам, что обнаружить ChAT выражение 14. Эти два репортер животные на линии C57BL / 6J фоне и коммерчески доступны (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Университет Висконсина уходу и использованию животных комитета утвердил все процедуры.
1. Подготовка решений
- Использование 1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) в качестве буфера рассечение и промывки раствором.
- Подготовка 30% сахарозы путем взвешивания 30 г сахарозы и место в бутылку. Добавить 99 мл 1x PBS и добавить 1 мл 10% азид натрия. Тщательно перемешать, пока все сахарозы не растворится. Хранить при 4 ° С до использования.
- Подготовьте Блокирующий раствор путем смешивания 1X PBS, 3% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,1% Тритон-X-100. Тщательно перемешать и хранить в холодильнике, пока не понадобится.
- Подготовка 8% параформальдегида (PFA) раствор в 1x PBS путем взвешивания соответствующего количества PFA в 1x PBS, а затем инкубировали при 65 ° С до тех пор, пока полностью не растворится. Магазин в 25 мл аликвотах в -20 ° C морозильнике до использования. Развести до 4% PFA в 1x PBS на день использования.
2. Эмбрион и Гут Рассекитеион
- В соответствии с институциональной уходу и использованию животных комитета утвержден протоколы, усыпить приуроченный беременную мышь и перенести в матку в 60 мм чашки Петри, содержащей ледяной 1x PBS.
- Под микроскопом рассечение, используя острые ножницы, разрезать стенки матки открытый, чтобы выставить эмбрионов. Удалить эмбрионов из матки и место в чистой 60 мм чашки Петри, содержащей ледяной холод 1x PBS.
- Эвтаназии каждый эмбрион, обезглавливание в ледяной 1x PBS. Если вы используете трансгенных мышей, содержащих флуоресцентные белки, под флуоресцентной подсветкой, определить положительные трансгенные эмбрионы.
- Рассеките желудочно-кишечного тракта от каждого эмбриона с использованием рассечение микроскоп. Использование тонких щипцов, ориентироваться эмбрион таким образом, что левая сторона стороной вверх и правой стороне на дно чашки Петри. Снимите верхнюю стенку тела из эмбрионов, чтобы выставить внутренние органы. Вставьте тонкий пинцет между спинной стенке тела и внутренних органов. Crуги щипцы друг против друга в ножницеобразный, как режущего действия, чтобы удалить внутренние органы от эмбриона.
- Кроме того суб-рассекать желудочно-кишечного тракта от окружающих органов, а затем поместить каждый желудочно-кишечного тракта в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую ледяной 1X PBS.
3. Фиксация GI урочища
- Промыть каждый желудочно-кишечного тракта 3 раза охлажденным на льду PBS 1x, а затем заменить 4% PFA. Закрепите GI участки в 1,5 мл микропробирок на качающейся платформе при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Промыть желудочно-трактов 3 раза в течение 5 мин при комнатной температуре, а затем в течение 1 часа на качалке платформы. На этой стадии, сохранять GI тракт при 4 ° С в 30% сахарозы в 1x PBS, содержащим 0,1% азида натрия до тех пор, пока это необходимо.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, хранения эмбрионов в 30% сахарозы в течение до одного года без какого-либо влияния на целостность тканей. Хранение образцов в 30% сахарозы позволяет последующую обработку образцов либо для иммунным или в октябре для крио-sectioniнг. Кроме того, приступить к протоколу иммуноокрашивания подробно ниже.
4. Протокол Иммуноокрашивание
- Если образцы были сохранены в 30% сахарозы, промыть их 3 раза в течение 20 мин в PBS 1x на платформе-качалке.
- Поместите GI участки в блокировании решения на качающейся платформе в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Удалить блокирующий раствор и инкубировать GI тракт с соответствующим количеством первичных антител разводят в блокирующем растворе для любой 4 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С на ротационном платформы. Использование 1: 1000 разбавление человеческого анти-антитела (Hu сыворотки, полученной от пациента), 1: 1000 разбавление куриного анти-зеленого флуоресцентного белка (GFP) антитела и 1: 100 разбавление козьего анти-ХАТ антитела.
Примечание: Мы используем человеческого анти-Hu антитело, которое было получено локально от пациента, однако, анти-Hu антитела коммерчески доступны, например, мышиное анти-Hu, (использование при 1: 500 разбавлении). - Промыть GI участки в 1x PBS3 раза в течение 5 мин и затем в течение 1 часа при комнатной температуре на ротационном платформы.
- Заменить 1X PBS с помощью вторичных антител, разведенных 1: 500 в блокирующем растворе на платформе-качалке для любой 4 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С. Использование осла против человеческого амина-реактивный краситель, такой как DyLight, осла против ветряной су2 и осла против козьего Cy5. При использовании мышиное анти-Ху антитела затем используют в разведении 1: 500 осла против мышиного амина-реактивный краситель 405.
ПРИМЕЧАНИЕ: интенсивность эндогенного GFP и выражения tdTomato и ясности иммуноокрашивания увеличение с возрастом развития. Как правило, мы immunostain эмбриональных кишки индивидуально в 0,2 мл пробирки с 150 мкл окрашивающего раствора, чтобы уменьшить объем используемого антитела, а также обеспечить эффективное окрашивание ткани. - Промыть GI тракт в 1X PBS 3 раза в течение 5 мин и затем в течение 1 часа при комнатной температуре на ротационном платформы.
- Поместите несколько капель флуоресценции монтажа среде с DAPI на предметное стекло. Погрузите GI траКТ в монтажной флуоресценции среды и добавить покровное стекло непосредственно на ткани. Флуоресценции монтажа средней -G является водорастворимым соединением, которое обеспечивает полупостоянного уплотнение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте флуоресценции монтажа носитель, например Vectashield что глицерин основе монтажа среду, предотвращающую выцветания и фотообесцвечивание антител. Оба из этих продуктов позволит ткани должны храниться в течение длительных периодов времени при 4 ° С. - Захват изображения каждого из флуорофора с помощью конфокальной микроскопии. Используйте для длин волн возбуждения флуорофоров и фильтров, используемых, представленных в таблице 3.
- Выполнить анализ изображения с помощью компьютера, используя соответствующее программное обеспечение в зависимости от типа используемого конфокальной захвата изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ранее мы уже описали поколение мышей, экспрессирующих GFP оба и tdTomato флуоресцентные журналистам, что обнаружить ChAT выражение 14. Вкратце, мышей Чат-Cre были скрещены с R26R: floxSTOP: tdTomato животных для производства Чат Cre; R26R: floxSTOP: tdTomato мышей (так называемые чат-Cre tdTomato). Эти животные были затем скрещивали с гомозиготных Чат-GFP репортер мышей. Эмбрионы были выделены и ткани иссекали до того, как фиксированные и иммунологически, как указано выше, с антителами, перечисленных в таблице 1. Дистальном отделе тонкой кишки (SI) и проксимальном отделе толстой кишки были проанализированы в E11, E13.5 и E16.5
В E11, Ху-позитивных нейронов присутствуют в дистальной СИ, но НКК еще не достиг проксимального кишки (рис 1). В этот момент времени, большинство из Ху-позитивных нейронов продемонстрировать иммунореактивности АХТ а также GFP положительность. Интересно, что в этот момент времени, выражениеession в tdTomato конструкции Чат Cre не обнаруживается. По E13.5, большинство Ху-положительных нейронов и ХАТ-ИК и общение-GFP положительные, так и небольшое количество ХАТ-Cre tdTomato-положительных нейронов видел. Количество Chat-Cre tdTomato-позитивных нейронов увеличивается E16.5, но по-прежнему небольшая часть числа Чат ИК нейронов.
Рисунок 1. Типичные Изображения холинергических нейронов в дистальных тонкой и толстой кишки в эмбриональный день 11. На E11, в дистальной С.И. (с надписью "СИ") и проксимальном отделе толстой кишки (помечены "Ко"), Ху-позитивных нейронов (синий) присутствуют только в SI на данном этапе. Большинство Ху-положительные нейроны совместно с иммунологически Чат ИК (белый) и чат-GFP (зеленый). Тем не менее, в этот момент времени, ни один из этих нейронов не Chat-Cre tdTomato положительный (красный). Шкалабар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Типичные изображения холинергических нейронов в дистальном отделе тонкой кишки и толстой кишки в эмбриональных дней 13,5 и 16,5. Изображение показывает холинергических нейронов в дистальном отделе тонкой кишки на E13.5 (верхние панели) и E16.5 (нижние панели). В E13.5 большинство Ху-положительных нейронов были Чат ИК и общение-GFP положительные (верхние панели). Небольшое количество этих совместно выразили Чат Cre tdTomato. По E16.5, больше ХАТ-Cre tdTomato нейроны были обнаружены в зарождающейся ганглиев (нижние панели). Масштаб бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
| Первичные антитела | |||
| Антиген | Иммуноген | Разведение | Поставщик & Подробнее |
| Ху (нейронов человеческого белка) | Ху белка | 1: 1000 | Сыворотку от больного человека (Madison, WI) |
| GFP (зеленого флуоресцентного белка) | GFP белок, IgY доля | 1: 1000 | Aves Lab, Inc. (Тигард ИЛИ), куриный поликлональные, GFP-1020 |
| Чат (холинацетилтрансферазы) | Плаценты человека фермент | 1: 100 | Millipore (Биллерика, Массачусетс), козьи поликлональные, AB144P |
| Вторичные антитела | |||
| Имя | Флуорофорные | Разведение | Поставщик & Подробнее |
| Осел античеловеческие DyLight 405 | 1: 500 | Джексон ImmunoResearch лаборатории (Западная Роща, Пенсильвания), 709-475-149 | |
| Осел анти-куриный | Су2 | 1: 500 | Джексон ImmunoResearch лаборатории (Западная Роща, Пенсильвания), 703-225-155 |
| Осел анти-Коза | Су5 | 1: 500 | Джексон ImmunoResearch лаборатории (Западная Роща, Пенсильвания), 705-175-147 |
Таблица 1. Сведения о первичных и вторичных антител, используемых в исследовании. Первичные и вторичные антитела, используемые в этом исследовании, вместе с их поставщиком и разведения используемые.
| Первичные антитела | |||||||
| Антиген | Разведение | Поставщик | Вторичное антитело | ||||
| Sox10 | 1:50 | Santa Cruz Biotechnology, ДалласТехас | Осел анти-Коза | ||||
| р75 | 1: 250 | Promega, Мэдисон Висконсин | Осел анти-кролик | ||||
| PGP9.5 | 1: 1000 | Abcam, Кембридж, Массачусетс | Осел анти-кролик | ||||
| BFABP | 1: 500 | Millipore, Billerica, Массачусетс | Осел анти-кролик | ||||
| S-100 | 1: 500 | ДАКО, Карпинтерия, Калифорния | Осел анти-кролик | ||||
| GFAP | 1: 500 | ДАКО, Карпинтерия, Калифорния | Осел анти-кролик | ||||
| ННО | 1: 500-1000 | Emson, Кембридж, Великобритания | Осел антиовечьим | ||||
| VIP (вазоактивного кишечного) | 1: 500 | Эпштейн и Полсен, Мэдисон, Висконсин | Осел анти-кролик | ||||
| Вещество Р | 1: 200-400 | DIASORIN, Stillwateг, М.Н. | Осел антиовечьим | ||||
| Вторичные антитела | |||||||
| Имя | Разведение | Поставщик & Подробнее | Флуорофорные | ||||
| Осел античеловеческие | 1: 500-1000 | Джексон ImmunoResearch лаборатории, Западная Роща, Пенсильвания | DyLight 488 | ||||
| Осел античеловеческие | 1: 1000 | Джексон ImmunoResearch лаборатории, Западная Роща, Пенсильвания | Су3 | ||||
| Осел анти-кролик | 1: 500 | Джексон ImmunoResearch лаборатории, Западная Роща, Пенсильвания | DyLight 488 | ||||
| Осел анти-кролик | 1: 500 | Джексон ImmunoResearch лаборатории, Западная Роща, Пенсильвания | Су3 | ||||
| Осел антиовечьим | 1: 500 | Джексон ImmunoResearch лаборатории, Западная Роща, Пенсильвания | Су2 | Осел антиовечьим | 1: 1500 | Джексон ImmunoResearch лаборатории, Западная Роща, Пенсильвания | Су3 |
| Осел анти-Коза | 1: 500 | Джексон ImmunoResearch лаборатории, Западная Роща, Пенсильвания | Су3 | ||||
Таблица 2. Дополнительные первичные и вторичные антитела использования в изучении развития ENS. Первичные и вторичные антитела, что мы ранее работавшие в наших исследованиях развития ENS.
| Возбуждение | Излучение | |||
| Лазерная линия | Флуорофорные Тип | Примеров | Фотоумножитель | Фильтры |
| 408 нм | Синий | Alexa Fluor 405, Каскад Синий, кумарин 30, DAPI, Hoechst, Pacific Blue, большинство квантовых точек | 1 | ВР 425-475 нм |
| 488 нм | Зеленый | Alexa Fluor 488, 488 ATTO, Кальцеин, Су2, EGFP, FITC, штат Орегон Зеленый, YO-PRO-1 | 2 | ВР 500-550 нм |
| 561 нм | Красный | Alexa Fluor 546, 555, 568, 594 и, Су3, DiI, DsRed, mCherry, Фикоэритрин (ПЭ), Пропидиум Йод (ПИ), ЗП, TAMRA, tdTomato, TRITC | 3 | ВР 570-620 нм |
| 638 нм | Далеко Красный | Alexa Fluor 633 и 647, аллофикоцианин (АРС), Су5, К-PRO-3 | 4 | ВР 663-738 нм |
Таблица 3. Конфокальные Длины волн возбуждения изображения, флуорофоры и фильтры. Длины волн возбуждения, обнаруживаемые флуорофоры, и фильтры, используемые представлены. Эта информация может быть использована при выборе комбинации вторичных антител для многоцветной immunofluoresence.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В нашей лаборатории и другие показали, что кишечные дефекты HSCR не ограничивается aganglionic толстой кишки, но распространяется в проксимальном направлении, даже в тонком кишечнике узловатый 5,15,16. Эти изменения включают изменения в ENS фенотипа нейронов плотности и нейромедиаторов и может составлять моторики, которая наблюдается у пациентов с HSCR. Мы использовали выше методы в наших усилиях, чтобы понять детерминанты формирования ENS. В частности, эти методы были использованы для визуализации нейронов синтазы окиси азота (нОАС) нейроны, нейроны вазоактивные кишечные полипептидные (VIP), а также холин ацетилтрансферазы (чат) нейроны (таблица 2) 5. Ключевым преимуществом этой техники является возможность хранить образцы в 30% сахарозы для последующей обработки, либо для иммунным или для встраивания и cryosectioning.
НКК колонизация кишечника происходит опережение волнового фронта FROM E9.5 в E14.5. Иммуноокрашивание с Ху, который идентифицирует нейроны, как описано выше, в сочетании с анализом изображений автоматизированного, позволяет количественных сравнений нейронов плотности. Снижение плотности нейронов найдены участки кишечника узловатый из HSCR 5, а также в других моделях кишечной моторики 13. Мыши с условной делеции Hand2 продемонстрировать изменения в пропорциях нейронов, выражающих различные нейромедиаторы, а также уменьшенные нейронные номера. Кроме того, животные с более экспрессии Noggin или PTEN продемонстрировали повышенный нейронов плотность вдоль их кишечника 6,17.
Баланс нейромедиаторных фенотипов среди нейронов ENS жестко регулируется, в результате чего координированному сокращению стенки кишечника для перемещения содержимого в просвете, регулирование потока крови и поглощения питательных веществ. После НКК приобрести нейронов идентичность существует узкое окно времени, когдапривязки к нейромедиатора фенотипа 14. Мы недавно показали, что иммунное идентифицирует ChAT нейромедиатора фенотип на E10.5, ранее эмбриональной стадии, чем наблюдается при генетических моделей репортер (например, чат-Cre или чат-GFP) 14. Кроме того, ЧАТ иммунореактивные нейроны достигают уровней взрослых (как доля от всех нейронов ENS) в начале развития, в результате которой предполагает, что нейроны в чате может иметь роль в регулировании дальнейшее дифференцировку нейронов в ENS.
Синтаза оксид (NOS), является основным нейромедиатором релаксации найдены в ENS, и пропорционально увеличивается в ENS нейронов вдоль кишечника в HSCR 5. Кроме того, изменения в вазоактивный кишечный пептид (VIP), нейромедиатор, который также принимает участие в опосредовании расслабление мышц и регулирования расхода крови вдоль стенки кишечника, найдены в моделях HSCR 5. Эти данные позволяют предположить, что для того, чтобы понять, как компonents о ENS регулировать свою функцию, систематическое изучение различных нейромедиаторов должны быть предприняты. Методы, представленные здесь, могут быть легко адаптированы, чтобы этот тип анализа с использованием соответствующих антител.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Байт премии американской детской хирургической ассоциации Foundation (АГ) и Национальных Институтов Здоровья K08DK098271 (АГ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
References
- Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
- Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
- Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung's disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
- Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
- Qu, Z. -D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
- Bian, X. -C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
- Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
- Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
- Koga, T., Bellier, J. -P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
- Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
- Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
- Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
- Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung's-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
- Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung's disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
- Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).
