Introduction
מערכת תפקוד מעי עצבים (ENS), השולטת בתנועתיות, מזין קליטה, וזרימת דם מקומית, היא חיונית לחיים 1. ENS נוצר על ידי תאים עצביים פסגה (NCC) שמתרבים, להעביר וליישב את הבטן, שבו הם להתמיין הנוירונים הגרעינים המכילים ותאי גלייה. מחלת הירשפרונג (תורשה של מנדל HSCR, באינטרנט באיש), הפרעה מולדת multigeneic עם שכיחות של 1 ב4,000 לידה חי, יכולה להיחשב המחלה אבטיפוס ללימוד היווצרות ENS שיבש. בHSCR, NCC לא מצליח להעביר ולליישב אורכים משתנה של המעי האחורי דיסטלי 2. בנוסף, במערכת העיכול נפוצה אחרת (GI) פגמים התפתחותיים באוכלוסיית הילדים, כגון מומים אנו-רקטליות, atresias מעיים, והפרעות תנועתיות קשורות עם הפרעות בתפקודים בסיסיים ENS, וצפויה הקשורים בשינויים קלים, אינם מוערכים, אנטומיים ושינויים תפקודיים ב3-6 ENS. לכן, טכניקות שתאפשרנה לנו להבין את הגורמים התפתחותיים של היווצרות ENS עשויות לשפוך אור על הפתוגנזה וטיפול פוטנציאלי של הפרעות בדרכי עיכול בילדים.
בעקבות הגירה והתישבות, NCC מבדיל לתוך הנוירונים עם סמנים ספציפיים לפנוטיפ העצבי שלהם. נוירונים כולינרגית מהווים כ 60% מתאי עצב מעיים 7, ויכולים להיות מזוהים על ידי מכתים לacetyltransferase כולין (צ'אט), אנזים הסינתזה להנוירוטרנסמיטר אצטילכולין מעורר. מבחינה הסטורית, מנסה לדמיין נוירונים כולינרגית היו מבולבל על ידי שונה סגוליות אנטיגן של נוגדנים המכוונים נגד מערכת עצבים מרכזית (CNS) צ'אט לעומת מערכת עצבים היקפית (PNS) צ'אט 8-10. עם זאת, נוגדנים המכוונים נגד צ'אט שליה להכיר שני צ'אט המרכזי והיקפי 11-13, ויש לנו טכניקות מתוארות לאחרונה המאפשרות לvisualization של נוירונים כולינרגית ENS עם רגישות גבוהה מוקדם יותר בפיתוח מאשר הושג עם קווי כתב צ'אט 14.
כאן, אנו מציגים טכניקה לנתח, לתקן וimmunostaining של מערכת העיכול עוברי עכברית לדמיין ביטוי עצבי ENS בתאי עצב. למחקרים אלה, שנוצלנו עכברי הצ'אט-Cre הזדווגו עם R26R: בעלי חיים tdTomato לייצר צ'אט-Cre; R26R: floxSTOP עכברי tdTomato (המוגדרים כצ'אט-Cre tdTomato ברחבי כתב היד): floxSTOP. בעלי חיים אלה ולאחר מכן היו הזדווגו עם עכברי כתב צ'אט-GFP הומוזיגוטים, להשיג עכברים להביע שני כתבי ניאון המזהים ביטוי צ'אט 14. שני בעלי חיים אלה הם כתב על רקע C57BL / 6J והם זמינים מסחריים (ג'קסון מעבדות, בר הרבור, ME).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אוניברסיטת ויסקונסין טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה אישרה את כל הנהלים.
1. הכנה של פתרונות
- השתמש פוספט 1x שנאגרו (PBS) כחיץ לנתיחה ופתרון שטיפה.
- הכן סוכרוז 30% על ידי במשקל 30 גרם של סוכרוז ומקום לבקבוק. להוסיף 99 מיליליטר של 1x PBS ולהוסיף 1 מיליליטר 10% אזיד הנתרן. מערבבים היטב עד שכל סוכרוז הוא נמס. עד נדרשת חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
- הכן חסימת פתרון על ידי ערבוב 1x PBS, 3% אלבומין בסרום שור (BSA) ושל 0.1% Triton-X-100. מערבבים היטב ולאחסן במקרר עד צורך.
- הכן 8% paraformaldehyde פתרון (PFA) ב1x PBS על ידי שקילת הכמות המתאימה של PFA לPBS 1x ולאחר מכן לדגור על 65 מעלות צלזיוס עד שהוא נמס לגמרי. חנות ב -25 aliquots מיליליטר ב-20 ° C במקפיא עד צורך. לדלל את PFA 4% ב- PBS 1x ביום שימוש.
2. העובר וגוט לנתחיון
- בהתאם למוסדי טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה אישר פרוטוקולים, להרדים עכבר בהריון בעיתוי ולהעביר את הרחם לקרח קר המכיל 60 מ"מ צלחת פטרי 1x PBS.
- תחת מיקרוסקופ לנתיחה באמצעות מספריים חדים, לחתוך את דופן הרחם הפתוחה לחשוף את העוברים. הסר את העוברים מן הרחם והמקום ל-60 מ"מ צלחת פטרי המכילה נקייה קר כקרח 1x PBS.
- להרדים כל עובר על ידי עריפת הראש ב1x קר כקרח PBS. אם אתה משתמש בעכברים מהונדסים המכילים חלבוני ניאון, תחת תאורת הקרינה, לזהות את העוברים מהונדסים החיוביים.
- לנתח את מערכת עיכול מכל עובר באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה. בעזרת מלקחיים בסדר, לכוון את העובר כך שצד השמאל פונה כלפי מעלה וצד ימין הוא נגד החלק התחתון של צלחת פטרי. הסר את קיר הגוף העליון מהעובר כדי לחשוף את האיברים הפנימיים. הכנס מלקחיים עדינים בין קיר גוף גב והאיברים הפנימיים. CrOSS מלקחיים אחד נגד השני בפעולת חיתוך כמו מספריים כדי להסיר את האיברים הפנימיים של העובר.
- בהמשך תת-לנתח את מערכת העיכול מהאיברים שמסביב ואז למקם את כל מערכת עיכול לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר המכיל קר כקרח 1x PBS.
3. קיבוע של קטעי GI
- יש לשטוף את כל מערכת עיכול 3 פעמים עם 1x קר כקרח PBS ולאחר מכן להחליף עם PFA 4%. תקן את שטחי GI בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge על פלטפורמת נדנדה ב RT תמורת 1.5 שעות. יש לשטוף את שטחי GI 3 פעמים במשך 5 דקות ב RT ולאחר מכן במשך שעה 1 על פלטפורמת הנדנדה. בשלב זה, לאחסן קטעי GI על 4 מעלות צלזיוס בסוכרוז 30% ב 1x PBS המכיל 0.1% אזיד הנתרן עד צורך.
הערה: לחלופין, לאחסן את העוברים בסוכרוז 30% לשנה עד אחת ללא כל השפעה על שלמות הרקמות. אחסון של הדגימות בסוכרוז 30% מאפשר עיבוד מאוחר יותר של הדגימות או לimmunostaining או לאוקטובר לcryo-מדור שng. לחלופין, להמשיך בפרוטוקול immunostaining מפורט להלן.
4. Immunostaining פרוטוקול
- אם דגימות אוחסנו ב -30% סוכרוז, לשטוף אותם 3 פעמים במשך 20 דקות ב1x PBS על פלטפורמת נדנדה.
- מניחים את שטחי GI לפתרון חסימה על פלטפורמת נדנדה 1h ב RT.
- הסר את פתרון חסימת דגירה שטחי GI עם הכמות המתאימה של נוגדנים עיקריים מדולל חסימת פתרון גם עבור 4 שעות ב RT או O / N ב 4 ° C על פלטפורמת נדנדה. השתמש 1: 1,000 דילול של נוגדן אנושי אנטי-הו (סרום המתקבל ממטופל), 1: 1,000 דילול של נוגדן עוף אנטי-ירוק חלבון פלואורסצנטי (GFP) ו -1: של נוגדן אנטי צ'אט עז 100 דילול.
הערה: אנו מנצלים נוגדן אנטי-הו אנושי שהושג באופן מקומי ממטופל, לעומת זאת, נוגדנים נגד הו זמינים מסחרי, למשל, עכבר אנטי-הו, (שימוש ב1: 500 דילול). - יש לשטוף את שטחי GI ב1x PBS3 פעמים במשך 5 דקות ולאחר מכן עבור שעה 1 ב RT על פלטפורמת נדנדה.
- החלף את PBS 1x עם נוגדנים משני בדילול 1: 500 בחסימת פתרון על פלטפורמת נדנדה לאו 4 שעות על RT או O / N ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש צבע אמין-reactive אנטי אנושי חמור כגון DyLight, Cy2 אנטי-עוף חמור וCy5 אנטי-העז החמור. אם נוגדן אנטי-הו העכבר באמצעות לאחר מכן להשתמש דילול 1: 500 של צבע אמין-reactive החמור אנטי עכבר 405.
הערה: עוצמת GFP אנדוגני וביטוי tdTomato והבהירות של immunostaining עלייה עם גיל התפתחותי. אנחנו בדרך כלל immunostain אומץ עוברי בנפרד ב0.2 מיליליטר צינורות עם 150 μl של פתרון מכתים במטרה לצמצם את הנפח של נוגדן המשמש וגם כדי להבטיח צביעה יעילה של הרקמות. - יש לשטוף את שטחי GI בPBS 3 פעמים 1x למשך 5 דקות ולאחר מכן עבור שעה 1 ב RT על פלטפורמת נדנדה.
- מניחים כמה טיפות של מדיום הרכבה הקרינה עם DAPI על גבי זכוכית. לטבול את tra GICT להרכבה בינוני הקרינה ולהוסיף מכסה זכוכית ישירות על גבי הרקמה. הקרינה ההרכבה -G הבינוני היא תרכובת מסיס במים המספקת חותם חצי קבוע.
הערה: הרכבה בינונית הקרינה השימוש כגון Vectashield שהוא גליצרול מבוסס הרכבה בינונית שמונע דהייה וphotobleaching של נוגדנים. שני מוצרים אלה מאפשרים רקמות להיות מאוחסנות במשך תקופות ארוכות של זמן על 4 מעלות צלזיוס. - צלם תמונות של כל אחד מfluorophore באמצעות מיקרוסקופ confocal. השתמש באורכי גל עירור לfluorophores ומסננים המועסקים מוצגת בלוח 3.
- לבצע ניתוח תמונה בעזרת מחשב באמצעות תוכנה מתאימה, בהתאם לסוג של confocal משמש ללכידת תמונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שתארנו בעבר את הדור של עכברים המבטאים את שני כתבי ניאון GFP וtdTomato המזהים ביטוי צ'אט 14. בקצרה, עכברי צ'אט-Cre זווגו עם R26R: floxSTOP: בעלי חיים tdTomato לייצר צ'אט-Cre; R26R: עכברי tdTomato (נקראים צ'אט-Cre tdTomato): floxSTOP. בעלי חיים אלה ולאחר מכן היו הזדווגו עם עכברי כתב צ'אט-GFP הומוזיגוטים. עוברים היו מבודדים ורקמות נותחו לפני שקבועות immunostained כאמור לעיל, עם הנוגדנים המופיעים בטבלה 1. המעי דק דיסטלי (SI) ומעי גס הפרוקסימלי נותחו בE11, E13.5 וE16.5
בE11, נוירונים הו-חיוביים נמצאים בתוך SI דיסטלי, אבל NCC עדיין לא הגיע למעי גס הפרוקסימלי (איור 1). בנקודה זו בזמן, רוב הנוירונים הו-חיוביים להפגין immunoreactivity צ'אט כמו גם חיובי GFP. מעניין לציין, בנקודה זו בזמן, expression של מבנה tdTomato צ'אט-Cre הוא לא לזיהוי. על ידי E13.5, רוב הנוירונים הו-חיוביים הם נראה שני צ'אט-IR ולשוחח-GFP חיובי, ומספר קטן של תאי עצב tdTomato חיובי הצ'אט-Cre. מספר עליות נוירונים tdTomato החיוביים הצ'אט-Cre ידי E16.5, אבל ממשיך להיות חלק קטן ממספר הנוירונים הצ'אט-IR.
איור 1. נציג תמונות של כולינרגית נוירונים בדיסטלי המעי הדק והמעי הגס ביום עובריים 11. בE11, בSI (שכותרתו "SI") דיסטלי והמעי הגס הפרוקסימלי (שכותרתו "שיתוף"), תאי עצב הו-חיוביים (כחול) רק הווה בתוך SI בשלב זה. רוב הנוירונים הו-חיוביים עם צ'אט-IR (לבן)-immunostained לשתף ולשוחח-GFP (ירוק). עם זאת, בנקודת זמן זו, אף אחד מתאי עצב אלו צ'אט-Cre tdTomato חיובי (אדום). בקנה מידהבר = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. תמונות נציג של כולינרגית נוירונים בדיסטלי המעי הדק ומעי גס בימים עובריים 13.5 ו -16.5. תמונה מראה נוירונים כולינרגית במעי הדק דיסטלי בE13.5 (לוחות העליונים) וE16.5 (לוחות נמוכים יותר). בE13.5 רוב הנוירונים הו-חיוביים היו צ'אט-IR ולשוחח-GFP (לוחות העליונים) חיוביים. מספר קטן של tdTomato הצ'אט-Cre-הביע שיתוף אלה. על ידי E16.5, יותר תאי עצב צ'אט-Cre tdTomato נמצאו בגרעינים המתהווים (לוחות נמוכים יותר). בר סולם = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של figur זהדואר.
| נוגדנים ראשוניים | |||
| אנטיגן | Immunogen | דילול | ספק ופרטים |
| הו (חלבון עצבי אדם) | חלבון הו | 1: 1000 | סרום ממטופל אנושי (מדיסון, ויסקונסין) |
| GFP (חלבון פלואורסצנטי הירוק) | חלבון ה- GFP, חלק IgY | 1: 1000 | עופות המעבדה, Inc (טיגארד, OR), polyclonal העוף, GFP-1020 |
| צ'אט (כולין acetyltransferase) | אנזים שליה אנושי | 1: 100 | Millipore (Billerica, MA), polyclonal עיזים, AB144P |
| נוגדנים משני | |||
| שם | Fluorophore | דילול | ספק ופרטים |
| אנטי-אדם חמור DyLight 405 | 1: 500 | ג'קסון ImmunoResearch מעבדות (מערב גרוב, הרשות הפלסטינית), 709-475-149 | |
| אנטי-עוף חמור | Cy2 | 1: 500 | ג'קסון ImmunoResearch מעבדות (מערב גרוב, הרשות הפלסטינית), 703-225-155 |
| אנטי-עיזים חמורים | Cy5 | 1: 500 | ג'קסון ImmunoResearch מעבדות (מערב גרוב, הרשות הפלסטינית), 705-175-147 |
טבלה 1. פרטים של נוגדנים ראשוניים ומשניים ששמשו במחקר. הנוגדנים הראשוניים ומשניים ששמשו במחקר זה, יחד עם הספק שלהם ודילולים מנוצלים.
| נוגדנים ראשוניים | |||||||
| אנטיגן | דילול | ספק | נוגדנים משני | ||||
| Sox10 | 01:50 | סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, דאלאס, TX | אנטי-עיזים חמורים | ||||
| p75 | 1: 250 | Promega, WI מדיסון | נגד ארנב חמור | ||||
| PGP9.5 | 1: 1000 | Abcam, Cambridge, MA | נגד ארנב חמור | ||||
| BFABP | 1: 500 | Millipore, Billerica, MA | נגד ארנב חמור | ||||
| S-100 | 1: 500 | DAKO, Carpinteria, CA | נגד ארנב חמור | ||||
| GFAP | 1: 500 | DAKO, Carpinteria, CA | נגד ארנב חמור | ||||
| nNOS | 1: 500-1,000 | אמסון, קיימברידג ', בריטניה | אנטי-כבשים חמורים | ||||
| VIP (vasoactive המעיים פוליפפטיד) | 1: 500 | אפשטיין ופאולסן, מדיסון, ויסקונסין | נגד ארנב חמור | ||||
| חומר P | 1: 200-400 | DiaSorin, Stillwater, MN | אנטי-כבשים חמורים | ||||
| נוגדנים משני | |||||||
| שם | דילול | ספק ופרטים | Fluorophore | ||||
| אנטי-אדם חמור | 1: 500-1,000 | ג'קסון ImmunoResearch מעבדות, מערב גרוב, הרשות הפלסטינית | DyLight 488 | ||||
| אנטי-אדם חמור | 1: 1000 | ג'קסון ImmunoResearch מעבדות, מערב גרוב, הרשות הפלסטינית | Cy3 | ||||
| נגד ארנב חמור | 1: 500 | ג'קסון ImmunoResearch מעבדות, מערב גרוב, הרשות הפלסטינית | DyLight 488 | ||||
| נגד ארנב חמור | 1: 500 | ג'קסון ImmunoResearch מעבדות, מערב גרוב, הרשות הפלסטינית | Cy3 | ||||
| אנטי-כבשים חמורים | 1: 500 | ג'קסון ImmunoResearch מעבדות, מערב גרוב, הרשות הפלסטינית | Cy2 | אנטי-כבשים חמורים | 1: 1500 | ג'קסון ImmunoResearch מעבדות, מערב גרוב, הרשות הפלסטינית | Cy3 |
| אנטי-עיזים חמורים | 1: 500 | ג'קסון ImmunoResearch מעבדות, מערב גרוב, הרשות הפלסטינית | Cy3 | ||||
2. נוגדני שולחן נוספים ראשוניים ומשניים של שימוש בלימוד פיתוח ENS. נוגדנים הראשוניים ומשניים שיש לנו שבעבר הועסקו במחקרים של פיתוח ENS.
| עירור | פליטה | |||
| לייזר קו | Fluorophore סוג | דוגמאות | צינור מכפיל | אפשרויות סינון |
| 408 ננומטר | כחול | אלקסה פלואוריד 405, הנקודות קוונטיות ביותר אשד כחול, 30 Coumarin, DAPI, Hoechst, פסיפיק בלו, | 1 | ננומטר BP 425-475 |
| 488 ננומטר | ירוק | אלקסה פלואוריד 488, 488 ATTO, Calcein, Cy2, eGFP, FITC, אורגון ירוקה, YO-PRO-1 | 2 | ננומטר BP 500-550 |
| 561 ננומטר | אדום | Alexa 546 פלואוריד, 555, 568, 594 ו, Cy3, DiI, DsRed, mCherry, Phycoerythrin (PE), Propidium יוד (PI), RFP, טמרה, tdTomato, TRITC | 3 | ננומטר BP 570-620 |
| 638 ננומטר | רחוק אדום | אלקסה פלואוריד 633 ו647, Allophycocyanin (APC), Cy5, TO-PRO-3 | 4 | ננומטר BP 663-738 |
טבלה 3. אורכי גל עירור ההדמיה Confocal, fluorophores ומסננים. אורכי גל העירור, fluorophores לזיהוי, והמסננים המועסקים מוצגים. מידע זה יכול לשמש בבחירת שילובים של נוגדנים משני לimmunofluoresence ססגוניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המעבדה ואחרים שלנו הראו כי ליקויים במערכת העיכול בHSCR אינם מוגבלים למעי גס aganglionic אבל הרחיבו proximally, אפילו למעי הדק ganglionated 5,15,16. שינויים אלה כוללים שינויים בפנוטיפ צפיפות והעצבי העצבי ENS ועשויים להסביר dysmotility שנצפה בחולים עם HSCR. יש לנו מנוצלים הטכניקות לעיל במאמצינו להבין את הגורמים להיווצרות ENS. באופן ספציפי, טכניקות אלה היו מועסקים לדמיין נוירונים עצביים synthase תחמוצת חנקן (nNOS), תאי עצב פוליפפטיד מעיים vasoactive (VIP), כמו גם acetyltransferase כולין (צ'אט) נוירונים (טבלה 2) 5. יתרון עיקרי של שיטה זו הוא היכולת לאחסן דגימות בסוכרוז% 30 לעיבוד מאוחר יותר, גם עבור immunostaining או להטבעה וcryosectioning.
קולוניזציה NCC של המעי מתרחשת כF Wavefront קידוםE9.5 ROM לE14.5. Immunostaining עם הו, שמזהה תאי עצב, כפי שתואר לעיל, בשילוב עם ניתוח תמונה בעזרת מחשב, מאפשר להשוואות כמותיות של צפיפות עצבית. ירידה בצפיפות עצבית נמצאות חלקים ממעי ganglionated של HSCR 5, כמו גם בדגמים אחרים של dysmotility המעיים 13. עכברים עם מחיקה מותנית של Hand2 להפגין שינויים בפרופורציות של תאי עצב המבטאים נוירוטרנסמיטורים שונים, כמו גם מספרים עצביים מופחתים. בנוסף, בעלי חיים עם ביטוי יתר של בחור! או PTEN להפגין גדלו צפיפות עצבית לאורך המעי 6,17.
יתרת פנוטיפים עצביים בין תאי עצב של ENS מוסדרת בחוזקה, וכתוצאה מכך ההתכווצות מתואמת של קיר המעי לתנועה של תוכן luminal, הסדרת זרימת דם ומזין קליטה. ברגע שNCC לרכוש זהות עצבית, יש חלון צר של זמן עד שהתחייבות לפנוטיפ הנוירוטרנסמיטר 14. הראינו לאחרונה כי immunostaining מזהה פנוטיפ צ'אט מוליך עצבי בE10.5, שלב עוברי מוקדם יותר מאשר נצפה עם מודלים כתב גנטיים (למשל, צ'אט-Cre או צ'אט-GFP) 14. בנוסף, צ'אט נוירונים immunoreactive להגיע לרמות מבוגרות (כאחוז מסך כל הנוירונים ENS) בשלב מוקדם בהתפתחות, תוצאה שמצביעה על כך שייתכן שיש לי נוירונים צ'אט תפקיד בויסות בידול עצבי נוסף בENS.
synthase Nitric Oxide (NOS) הוא מוליך עצבי ההרפיה העיקרי נמצא בENS, והוא גדל באופן יחסי בנוירונים ENS לאורך המעי בHSCR 5. בנוסף, שינויים בפפטיד vasoactive המעיים (VIP), מוליך עצבי שמשתתף גם בתיווך הרפיית שרירים וויסות זרימת דם לאורך קיר המעי, נמצאים במודלי HSCR 5. נתונים אלה מראים כי, על מנת להבין כיצד components של ENS מווסת את תפקודה, בחינה שיטתית של נוירוטרנסמיטורים השונים צריכה להתבצע. הטכניקות שהוצגו כאן ניתן להתאים בקלות כדי לאפשר סוג זה של ניתוח על ידי שימוש בנוגדנים המתאימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על איגוד כירורגי ילדים אמריקאי פרס קרן (AG) והמכון הלאומי לבריאות K08DK098271 (AG) bythe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
References
- Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
- Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
- Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung's disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
- Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
- Qu, Z. -D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
- Bian, X. -C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
- Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
- Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
- Koga, T., Bellier, J. -P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
- Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
- Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
- Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
- Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung's-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
- Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung's disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
- Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).
