Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Murine आंतों का तंत्रिका प्रणाली विकास की कल्पना करने के Immunostaining

doi: 10.3791/52716 Published: April 29, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

गतिशीलता, पोषक तत्व अवशोषण, और स्थानीय रक्त के प्रवाह को नियंत्रित करता है जो एक से कार्य आंतों का तंत्रिका तंत्र (सत्ता), जीवन 1 करने के लिए आवश्यक है। सत्ता, विस्थापित और वे गैन्ग्लिया युक्त न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं में अंतर जहां आंत, उपनिवेश पैदा करना है कि तंत्रिका शिखा कोशिकाओं (एनसीसी) द्वारा बनाई है। हिर्स्चस्प्रुंग रोग (मनुष्य में HSCR, ऑनलाइन मेंडेलियाई भाग), 1 4000 में जीवित जन्मों की एक घटना के साथ एक multigeneic जन्मजात विकार, बाधित सत्ता गठन के अध्ययन के लिए prototypic रोग माना जा सकता है। HSCR में एनसीसी की ओर पलायन और बाहर का पश्चांत्र 2 के चर लंबाई उपनिवेश स्थापित करने में विफल। साथ ही, दूसरे आम जठरांत्र (सैनिक) ऐसे anorectal विकृतियां, आंतों atresias, और गतिशीलता विकार के रूप में बाल चिकित्सा आबादी में विकास संबंधी दोषों, बुनियादी सत्ता कार्यों में गड़बड़ी के साथ जुड़े रहे हैं, और संभावना सूक्ष्म, underappreciated, शारीरिक परिवर्तन और कार्यात्मक परिवर्तन के साथ जुड़े रहे हैंसत्ता 3-6। इसलिए, हमें सत्ता गठन की विकासात्मक निर्धारकों को समझने के लिए अनुमति देते हैं कि तकनीक रोगजनन और बाल चिकित्सा सैनिक पथ विकारों के संभावित उपचार पर प्रकाश डाला सकता है।

प्रवास और उपनिवेशन के बाद, एनसीसी उनके न्यूरोट्रांसमीटर phenotype के लिए विशिष्ट मार्कर के साथ न्यूरॉन्स में differentiates। Cholinergic न्यूरॉन्स आंतों का न्यूरॉन्स 7 की लगभग 60% शामिल है, और कोलीन acetyltransferase (चैट), उत्तेजक neurotransmitter acetylcholine के लिए synthesizing एंजाइम के लिए धुंधला से पता लगाया जा सकता है। ऐतिहासिक रूप से, कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के प्रतिजन विशिष्टता भिन्न से चकित थे कल्पना करने के लिए प्रयास करता है (सीएनएस) 8-10 चैट परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन) बनाम चैट। हालांकि, अपरा चैट के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी दोनों मध्य और परिधीय चैट 11-13 पहचान है, और हम visua के लिए अनुमति देते हैं कि हाल ही में वर्णित तकनीक हैउच्च संवेदनशीलता के साथ सत्ता कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स की lization पहले विकास में चैट संवाददाता लाइनों के साथ 14 हासिल किया गया है।

यहाँ, हम, विदारक न्यूरॉन्स में सत्ता न्यूरोट्रांसमीटर अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए murine भ्रूण सैनिक पथ के फिक्सिंग और immunostaining के लिए एक तकनीक मौजूद है। निर्माण करने के लिए tdTomato जानवरों चैट-Cre; R26R: floxSTOP: इन अध्ययनों के लिए, हम R26R के साथ mated चैट-Cre चूहों का उपयोग किया है floxSTOP: (पांडुलिपि भर में चैट-Cre tdTomato के रूप में परिभाषित) tdTomato चूहों। इन जानवरों को फिर चैट अभिव्यक्ति 14 का पता लगाने कि फ्लोरोसेंट संवाददाताओं दोनों व्यक्त चूहों प्राप्त करने के लिए, समयुग्मक चैट-GFP संवाददाता चूहों के साथ mated किया गया। इन दो रिपोर्टर जानवरों एक C57BL / 6J पृष्ठभूमि पर हैं और व्यावसायिक रूप से (जैक्सन प्रयोगशालाओं, बार हार्बर, एमई) उपलब्ध हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

विस्कॉन्सिन पशु की देखभाल और उपयोग समिति विश्वविद्यालय के सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी।

समाधान की 1. तैयारी

  1. विच्छेदन बफर और rinsing समाधान के रूप में 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) का प्रयोग करें।
  2. एक बोतल में सुक्रोज और जगह की 30 ग्राम वजन से 30% सूक्रोज तैयार करें। 1x पीबीएस के 99 मिलीलीटर जोड़ें और 1 मिलीलीटर 10% सोडियम azide जोड़ें। सुक्रोज के सभी भंग कर रहा है जब तक अच्छी तरह से मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर तक की आवश्यकता है।
  3. 1x पीबीएस, 3% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और 0.1% ट्राइटन X-100 के मिश्रण से अवरुद्ध समाधान तैयार करें। अच्छी तरह मिक्स और जब तक जरूरत फ्रिज में स्टोर।
  4. 1x पीबीएस में पीएफए ​​की उचित मात्रा में वजन द्वारा 1x पीबीएस में 8% paraformaldehyde (पीएफए) समाधान तैयार है और यह पूरी तरह से भंग कर रहा है तो जब तक 65 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में 25 मिलीलीटर aliquots में स्टोर की जरूरत तक। उपयोग की दिन पर 1X पीबीएस में 4% पीएफए ​​के लिए पतला।

2. भ्रूण और पेट काटनाआयन

  1. संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के अनुसार प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी, समय गर्भवती माउस euthanize और पीबीएस 1x एक 60 मिमी पेट्री डिश युक्त बर्फ ठंड में गर्भाशय हस्तांतरण।
  2. तेज कैंची का उपयोग कर एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, भ्रूण बेनकाब करने के लिए खुला गर्भाशय की दीवार काट दिया। पीबीएस 1x बर्फ के ठंडे युक्त स्वच्छ 60 मिमी पेट्री डिश में गर्भाशय और जगह से भ्रूण निकालें।
  3. ठंडा 1X पीबीएस में कत्ल के द्वारा प्रत्येक भ्रूण euthanize। आप फ्लोरोसेंट प्रोटीन युक्त ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग कर रहे हैं, प्रतिदीप्ति रोशनी के तहत, सकारात्मक ट्रांसजेनिक भ्रूण की पहचान।
  4. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रत्येक भ्रूण से सैनिक पथ काटना। ठीक संदंश का प्रयोग, बाईं ओर ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है और सही दिशा पेट्री डिश के नीचे के खिलाफ ऐसी है कि भ्रूण पूरबी। आंतरिक अंगों को बेनकाब करने के लिए भ्रूण से शरीर के ऊपरी हिस्से की दीवार निकालें। पृष्ठीय शरीर दीवार और आंतरिक अंगों के बीच ठीक संदंश डालें। सीआरभ्रूण से आंतरिक अंगों को निकालने के लिए एक कैंची की तरह काटने कार्रवाई में एक दूसरे के खिलाफ संदंश ओ.एस.एस.।
  5. इसके अलावा आसपास के अंगों से दूर सैनिक पथ उप-टुकड़े करना और फिर ठंडा 1x पीबीएस युक्त एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में प्रत्येक सैनिक पथ जगह है।

सैनिक इलाकों के 3. फिक्सेशन

  1. ठंडा 1x पीबीएस के साथ प्रत्येक सैनिक पथ 3 बार कुल्ला और फिर 4% पीएफए ​​के साथ बदलें। 1.5 घंटे के लिए आरटी पर एक कमाल मंच पर 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में सैनिक इलाकों को ठीक करें। कमाल मंच पर 1 घंटे के लिए तो आरटी पर सैनिक इलाकों 5 मिनट के लिए 3 बार कुल्ला और। इस स्तर पर, जब तक जरूरत 1x पीबीएस 0.1% सोडियम azide युक्त में 30% sucrose में 4 डिग्री सेल्सियस पर सैनिक इलाकों की दुकान।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, ऊतकों की अखंडता पर कोई प्रभाव के बिना अप करने के लिए एक वर्ष के लिए 30% sucrose में भ्रूण की दुकान। 30% sucrose में नमूने के संग्रहण immunostaining के लिए या अक्टूबर में क्रायो sectioni के लिए या तो नमूने के बाद के प्रसंस्करण की अनुमति देता हैएनजी। वैकल्पिक रूप से, नीचे विस्तृत immunostaining के प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें।

4. Immunostaining प्रोटोकॉल

  1. नमूने 30% sucrose में संग्रहित किया गया है, एक कमाल मंच पर उन्हें 1X पीबीएस में 20 मिनट के लिए 3 बार कुल्ला।
  2. आरटी पर 1 के लिए एक कमाल मंच पर अवरुद्ध समाधान में सैनिक इलाकों रखें।
  3. अवरुद्ध समाधान निकालें और एक कमाल मंच पर 4 डिग्री सेल्सियस पर आर टी या हे / एन में 4 घंटे के लिए या तो अवरुद्ध समाधान में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी की उचित राशि के साथ सैनिक इलाकों सेते हैं। (रोगी से प्राप्त सीरम) मानव विरोधी हू एंटीबॉडी के 1,000 कमजोर पड़ने, 1: चिकन विरोधी हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) प्रतिरक्षी के 1,000 कमजोर पड़ने और 1: बकरी विरोधी चैट एंटीबॉडी के 100 कमजोर पड़ने 1 का प्रयोग करें।
    नोट: हम एक रोगी से स्थानीय रूप से प्राप्त हुई थी कि एक मानव विरोधी हू एंटीबॉडी का उपयोग, हालांकि, विरोधी हू एंटीबॉडी उदाहरण के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, माउस विरोधी हू, (1 में उपयोग: 500 कमजोर पड़ने)।
  4. 1X पीबीएस में सैनिक इलाकों कुल्ला3 बार 5 मिनट के लिए और फिर एक कमाल मंच पर आरटी पर 1 घंटे के लिए।
  5. 1 पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 1x पीबीएस बदलें: 500 4 डिग्री सेल्सियस पर आर टी या हे / एन पर या तो 4 घंटे के लिए एक कमाल मंच पर अवरुद्ध समाधान में। ऐसे DyLight, गधा विरोधी चिकन Cy2 और गधा विरोधी बकरी Cy5 के रूप में गधा विरोधी मानव एमाइन प्रतिक्रियाशील डाई का प्रयोग करें। गधा विरोधी माउस एमाइन प्रतिक्रियाशील डाई 405 की 500 कमजोर पड़ने का उपयोग करने के लिए माउस विरोधी हू एंटीबॉडी तो एक 1 का उपयोग करते हैं।
    नोट: अंतर्जात GFP और tdTomato अभिव्यक्ति और विकासात्मक उम्र के साथ बढ़ immunostaining की स्पष्टता की तीव्रता। हम आम तौर पर ऊतक के कुशल धुंधला सुनिश्चित करने के लिए भी इस्तेमाल किया एंटीबॉडी की मात्रा को कम करने और क्रम में व्यक्तिगत रूप से धुंधला समाधान के 150 μl के साथ 0.2 मिलीलीटर ट्यूबों में भ्रूण हिम्मत immunostain।
  6. 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस 3 बार में सैनिक इलाकों कुल्ला और फिर एक कमाल मंच पर आरटी पर 1 घंटे के लिए।
  7. एक गिलास स्लाइड पर DAPI के साथ प्रतिदीप्ति बढ़ते मध्यम की कुछ बूँदें रखें। सैनिक टीआरए विसर्जितप्रतिदीप्ति बढ़ते मध्यम में सीटी और ऊतक के शीर्ष पर सीधे एक गिलास को कवर जोड़ें। मध्यम जी बढ़ते प्रतिदीप्ति एक अर्द्ध स्थायी मुहर प्रदान करता है कि एक पानी में घुलनशील यौगिक है।
    नोट: इस तरह के Vectashield के रूप में प्रयोग करें प्रतिदीप्ति बढ़ते मध्यम लुप्त होती और एंटीबॉडी की photobleaching से बचाता है कि बढ़ते मध्यम आधारित एक ग्लिसरॉल है। इन उत्पादों के दोनों ऊतकों 4 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय के लिए भंडारित किया जा सकें।
  8. एक confocal खुर्दबीन का उपयोग फ्लोरोफोरे में से प्रत्येक की छवियों पर कब्जा। तालिका 3 में प्रस्तुत fluorophores और कार्यरत फिल्टर के लिए उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का प्रयोग करें।
  9. छवियों पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल कोंफोकल के प्रकार के आधार पर उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कंप्यूटर एडेड छवि विश्लेषण करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

हम पहले चैट अभिव्यक्ति 14 का पता लगाने कि GFP और tdTomato फ्लोरोसेंट संवाददाताओं दोनों व्यक्त चूहों की पीढ़ी का वर्णन किया है। FloxSTOP: संक्षेप में, चैट-Cre चूहों R26R के साथ mated गया निर्माण करने के लिए tdTomato जानवरों चैट-Cre; R26R: floxSTOP: (चैट-Cre tdTomato कहा जाता है) tdTomato चूहों। इन जानवरों को तो समयुग्मक चैट-GFP संवाददाता चूहों के साथ mated किया गया। भ्रूण अलग थे और ऊतकों तय किया जा रहा करने के लिए पहले विच्छेदित और 1 टेबल में सूचीबद्ध एंटीबॉडी के साथ, ऊपर के रूप में immunostained थे। डिस्टल छोटी आंत (एसआई) और समीपस्थ पेट के E11, E13.5 और E16.5 पर विश्लेषण किया गया

E11 पर, हू-सकारात्मक न्यूरॉन्स बाहर का एसआई के भीतर मौजूद हैं, लेकिन एनसीसी अभी तक समीपस्थ बृहदान्त्र (चित्रा 1) तक पहुँच नहीं है। इस समय बिंदु पर, हू-सकारात्मक न्यूरॉन्स के बहुमत चैट immunoreactivity के रूप में अच्छी तरह से GFP सकारात्मकता दिखाना है। दिलचस्प है, इस समय बिंदु पर, exprचैट-Cre tdTomato निर्माण के ession पता लगाने योग्य नहीं है। E13.5 करके, हू-सकारात्मक न्यूरॉन्स के बहुमत चैट आईआर और चैट-GFP सकारात्मक है, और चैट-Cre tdTomato पॉजिटिव न्यूरॉन्स की एक छोटी संख्या में देखा जाता है, दोनों ही कर रहे हैं। E16.5 से चैट-Cre tdTomato पॉजिटिव न्यूरॉन्स की संख्या बढ़ जाती है, लेकिन चैट आईआर न्यूरॉन्स की संख्या का एक छोटा सा अंश होना जारी है।

चित्र 1
बाहर का एसआई (लेबल "एसआई") और समीपस्थ पेट में E11 में भ्रूण दिन 11. पर दूरस्थ छोटी आंत और पेट में cholinergic न्यूरॉन्स की चित्रा 1. प्रतिनिधि छवियों, हू-सकारात्मक न्यूरॉन्स (नीला) ("कंपनी" लेबल) इस चरण में एसआई के भीतर ही मौजूद हैं। अधिकांश हू पॉजिटिव न्यूरॉन्स चैट आईआर (सफेद) के साथ immunostained सह और चैट-GFP (हरा) कर रहे हैं। हालांकि, इस समय बिंदु पर, इन न्यूरॉन्स में से कोई भी चैट-Cre tdTomato सकारात्मक (लाल) कर रहे हैं। स्केलबार = 100 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
भ्रूण दिन में चित्रा दूरस्थ छोटी आंत में cholinergic न्यूरॉन्स की 2. प्रतिनिधि छवियाँ और पेट के 13.5 और 16.5। छवि कोलीनर्जिक E13.5 पर बाहर छोटी आंत में न्यूरॉन्स (ऊपरी पैनल) और E16.5 (कम पैनल) से पता चलता है। E13.5 में हू-सकारात्मक न्यूरॉन्स के बहुमत चैट आईआर और चैट-GFP सकारात्मक (ऊपरी पैनल) थे। इन सह व्यक्त चैट-Cre tdTomato की एक छोटी संख्या। E16.5 करके, अधिक चैट-Cre tdTomato न्यूरॉन्स नवजात गैन्ग्लिया (कम पैनल) में पाए गए। स्केल बार = 100 माइक्रोन। इस figur का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंई।

प्राथमिक एंटीबॉडी
एंटीजन Immunogen घोला प्रदायक और विवरण
हू (मानव न्यूरोनल प्रोटीन) हू प्रोटीन 1: 1,000 मानव रोगी से सीरम (मैडिसन, WI)
GFP (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) GFP प्रोटीन, IgY अंश 1: 1,000 एविस लैब, इंक (Tigard, या), चिकन पॉलीक्लोनल, GFP-1020
चैट (Choline acetyltransferase) मानव अपरा एंजाइम 1: 100 MILLIPORE (Billerica, एमए), बकरी पॉलीक्लोनल, AB144P
माध्यमिक एंटीबॉडी
नाम Fluorophore घोला प्रदायक और विवरण
गधा विरोधी मानव DyLight 405 1: 500 जैक्सन ImmunoResearch लेबोरेटरीज (पश्चिम ग्रोव, देहात), 709-475-149
गधा विरोधी चिकन Cy2 1: 500 जैक्सन ImmunoResearch लेबोरेटरीज (पश्चिम ग्रोव, देहात), 703-225-155
गधा विरोधी बकरी Cy5 1: 500 जैक्सन ImmunoResearch लेबोरेटरीज (पश्चिम ग्रोव, देहात), 705-175-147

तालिका 1. अपने सप्लायर के साथ अध्ययन में इस्तेमाल प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी का विवरण। इस अध्ययन में इस्तेमाल प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी, और उपयोग dilutions के।

प्राथमिक एंटीबॉडी
एंटीजन घोला प्रदायक माध्यमिक एंटीबॉडी
Sox10 1:50 सांताक्रूज जैव प्रौद्योगिकी, डलास, टेक्सास गधा विरोधी बकरी
P75 1: 250 Promega, मैडिसन WI गधा विरोधी खरगोश
PGP9.5 1: 1,000 Abcam, कैम्ब्रिज, एमए गधा विरोधी खरगोश
BFABP 1: 500 Millipore, Billerica, एमए गधा विरोधी खरगोश
एस -100 1: 500 Dako, Carpinteria, सीए गधा विरोधी खरगोश
GFAP 1: 500 Dako, Carpinteria, सीए गधा विरोधी खरगोश
nNOS 1: 500-1,000 Emson, कैंब्रिज, ब्रिटेन गधा विरोधी भेड़
वीआईपी (Vasoactive आंतों पॉलीपेप्टाइड) 1: 500 एपस्टीन और Paulsen, मैडिसन, WI गधा विरोधी खरगोश
पदार्थ पी 1: 200-400 DIASORIN, Stillwateआर, एम.एन. गधा विरोधी भेड़
माध्यमिक एंटीबॉडी
नाम घोला प्रदायक और विवरण Fluorophore
गधा विरोधी मानव 1: 500-1,000 जैक्सन ImmunoResearch प्रयोगशालाओं, पश्चिम ग्रोव, देहात DyLight 488
गधा विरोधी मानव 1: 1,000 जैक्सन ImmunoResearch प्रयोगशालाओं, पश्चिम ग्रोव, देहात Cy3
गधा विरोधी खरगोश 1: 500 जैक्सन ImmunoResearch प्रयोगशालाओं, पश्चिम ग्रोव, देहात DyLight 488
गधा विरोधी खरगोश 1: 500 जैक्सन ImmunoResearch प्रयोगशालाओं, पश्चिम ग्रोव, देहात Cy3
गधा विरोधी भेड़ 1: 500 जैक्सन ImmunoResearch प्रयोगशालाओं, पश्चिम ग्रोव, देहात Cy2 गधा विरोधी भेड़ 1: 1,500 जैक्सन ImmunoResearch प्रयोगशालाओं, पश्चिम ग्रोव, देहात Cy3
गधा विरोधी बकरी 1: 500 जैक्सन ImmunoResearch प्रयोगशालाओं, पश्चिम ग्रोव, देहात Cy3

सत्ता के विकास का अध्ययन करने में उपयोग की तालिका 2 अतिरिक्त प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी। हम पहले से सत्ता के विकास के हमारे अध्ययन में कार्यरत है कि प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी।

उत्तेजना एमिशन
लेजर लाइन Fluorophore प्रकार उदाहरण Photomultiplier ट्यूब फ़िल्टर विकल्प
408 एनएम नीला एलेक्सा Fluor 405, झरना ब्लू, Coumarin 30, DAPI, हेक्स्ट, प्रशांत ब्लू, सबसे क्वांटम डॉट्स 1 बीपी 425-475 एनएम
488 एनएम ग्रीन एलेक्सा Fluor 488, ATTO 488, calcein, Cy2, EGFP, FITC, ओरेगन ग्रीन, यो-प्रो 1 2 बीपी 500-550 एनएम
561 एनएम लाल एलेक्सा Fluor 546, 555, 568, और 594, Cy3, DiI, DsRed, mCherry, phycoerythrin (पीई), Propidium आयोडीन (पीआई), आरएफपी, Tamra, tdTomato, TRITC 3 बीपी 570-620 एनएम
638 एनएम सुदूर लाल एलेक्सा Fluor 633 और 647, Allophycocyanin (एपीसी), Cy5, करने के लिए प्रो-3 4 बीपी 663-738 एनएम

तालिका 3. confocal इमेजिंग उत्तेजना तरंग दैर्ध्य, fluorophores और फिल्टर। उत्तेजना तरंग दैर्ध्य, पहचाने fluorophores, और कार्यरत फिल्टर प्रस्तुत कर रहे हैं। यह जानकारी बहुरंगा immunofluoresence के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के संयोजन के चयन में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

हमारी प्रयोगशाला और दूसरों HSCR में आंतों दोष भी ganglionated छोटी आंत 5,15,16 में, aganglionic पेट के लिए प्रतिबंधित है, लेकिन proximally बढ़ाया नहीं कर रहे हैं कि पता चला है। इन परिवर्तनों सत्ता न्यूरोनल घनत्व और न्यूरोट्रांसमीटर phenotype में परिवर्तन शामिल हैं और HSCR के साथ रोगियों में देखा गया है कि dysmotility के लिए खाते सकता है। हम सत्ता के गठन के निर्धारकों को समझने के लिए हमारे प्रयासों में उपरोक्त तकनीक का उपयोग किया है। विशेष रूप से, इन तकनीकों न्यूरोनल नाइट्रिक ऑक्साइड सिन्थेज़ (nNOS) न्यूरॉन्स, vasoactive आंतों पॉलीपेप्टाइड न्यूरॉन्स (वीआईपी), साथ ही कोलीन acetyltransferase (चैट) न्यूरॉन्स (तालिका 2) 5 कल्पना करने के लिए नियोजित किया गया है। इस तकनीक का एक प्रमुख लाभ immunostaining के लिए या एम्बेड और cryosectioning के लिए, या तो बाद में प्रसंस्करण के लिए 30% sucrose में नमूने स्टोर करने की क्षमता है।

पेट की एनसीसी बसाना एक को आगे बढ़ाने के लिए wavefront च के रूप में होती हैE14.5 करने के लिए ROM E9.5। न्यूरॉन्स को दिखाता है जो हू, साथ Immunostaining, ऊपर वर्णित के रूप में, कंप्यूटर एडेड छवि विश्लेषण के साथ मिलकर, न्यूरोनल घनत्व के मात्रात्मक तुलना के लिए अनुमति देता है। न्यूरोनल घनत्व में कमी HSCR 5 की ganglionated आंत्र के कुछ भागों, साथ ही आंतों dysmotility 13 के अन्य मॉडलों में पाए जाते हैं। Hand2 की शर्तों को हटाएँ साथ चूहे अलग न्यूरोट्रांसमीटर के रूप में अच्छी तरह के रूप में कम न्यूरोनल संख्या व्यक्त न्यूरॉन्स के अनुपात में परिवर्तन प्रदर्शित करता है। इसके अतिरिक्त, नोगिन या PTEN की अधिक अभिव्यक्ति के साथ जानवरों को उनके आंत्र 6,17 साथ न्यूरोनल घनत्व में वृद्धि हुई प्रदर्शित करता है।

सत्ता के न्यूरॉन्स के बीच न्यूरोट्रांसमीटर phenotypes का संतुलन कसकर luminal सामग्री, रक्त प्रवाह और पोषक तत्व अवशोषण के नियमन की आवाजाही के लिए आंत्र दीवार के समन्वित संकुचन, जिसके परिणामस्वरूप में नियंत्रित किया जाता है। एनसीसी एक neuronal पहचान का अधिग्रहण करने के बाद, समय की एक संकीर्ण खिड़की से पहले वहाँ हैएक neurotransmitter फेनोटाइप 14 के लिए करने से। हमने हाल ही में immunostaining के E10.5 पर एक चैट न्यूरोट्रांसमीटर फेनोटाइप, आनुवंशिक संवाददाता मॉडल (जैसे, चैट-रचनात्मक या चैट GFP) 14 के साथ मनाया की तुलना में पहले के एक भ्रूण चरण की पहचान करता है कि पता चला है। इसके अतिरिक्त, immunoreactive न्यूरॉन्स प्रारंभिक विकास में, चैट न्यूरॉन्स सत्ता में आगे neuronal भेदभाव को विनियमित करने में एक भूमिका हो सकती पता चलता है कि एक परिणाम है जो (सभी सत्ता न्यूरॉन्स के अनुपात के रूप में) वयस्क के स्तर तक पहुंच चैट।

नाइट्रिक ऑक्साइड सिन्थेज़ (ओपन स्कूल) सत्ता में पाया प्राथमिक विश्राम neurotransmitter है, और आनुपातिक HSCR 5 में मल के साथ सत्ता न्यूरॉन्स में वृद्धि हुई है। इसके अतिरिक्त, vasoactive आंतों पेप्टाइड (वीआईपी) में परिवर्तन, भी मांसपेशी छूट मध्यस्थता और आंत्र दीवार के साथ रक्त के प्रवाह को विनियमित करने में भाग लेता है कि एक neurotransmitter, HSCR मॉडल 5 में पाए जाते हैं। इन आंकड़ों के क्रम में कैसे कंप्यूटर अनुप्रयोग को समझने के लिए, सुझाव है किसत्ता की onents अपने कार्य को विनियमित, अलग न्यूरोट्रांसमीटर का एक व्यवस्थित परीक्षा शुरू किया जाना चाहिए। यहाँ प्रस्तुत तकनीक आसानी से उपयुक्त एंटीबॉडी के उपयोग के द्वारा विश्लेषण के इस प्रकार की अनुमति के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

इस काम अमेरिकन बाल चिकित्सा सर्जिकल एसोसिएशन फाउंडेशन अवार्ड (एजी) और स्वास्थ्य K08DK098271 के राष्ट्रीय संस्थान (एजी) bythe का समर्थन किया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline Oxoid BR0014G
Sucrose Fisher S2
Sodium azide Fisher BP9221
Bovine serum albumin Fisher BP1605
Triton X-100 Sigma X100
Paraformaldehyde Sigma 158127
60 mm Petri dishes Fisher FB0875713A
Fluorescence microscope Nikon SMZ-18 stereoscope
Dissection microscope Nikon SMZ-18 stereoscope
Fine forceps Fine science tools 11252-20
1.5 ml Eppendorf tubes VWR 20170-038
Fluoromount-G SouthernBiotech, Birmingham, AL 0100-01
Glass slides Fisher 12-550-15
Cover glass VWR 16004-330
Confocal microscope Nikon Nikon A1
Nikon Elements Nikon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33, (10), 446-456 (2010).
  2. Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45, (1), 1-14 (2008).
  3. Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184, (1), 132-137 (2013).
  4. Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20, (3), 620-632 (2011).
  5. Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung's disease. Neurogastroenterol Motil. (2013).
  6. Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141, (2), 588-598 (2011).
  7. Qu, Z. -D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334, (2), 147-161 (2008).
  8. Bian, X. -C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15, (2), 161-171 (2003).
  9. Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46, (3), 968-976 (1986).
  10. Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17, (4), 217-226 (2000).
  11. Koga, T., Bellier, J. -P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46, (2), 59-64 (2013).
  12. Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251, (2), 185-199 (1998).
  13. Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138, (21), 4789-4800 (2011).
  14. Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26, (6), 874-884 (2014).
  15. Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung's-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24, (12), 1271-1277 (1989).
  16. Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung's disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32, (8), 1206-1210 (1997).
  17. Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119, (12), 3586-3596 (2009).
Murine आंतों का तंत्रिका प्रणाली विकास की कल्पना करने के Immunostaining
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barlow-Anacker, A. J., Erickson, C. S., Epstein, M. L., Gosain, A. Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development. J. Vis. Exp. (98), e52716, doi:10.3791/52716 (2015).More

Barlow-Anacker, A. J., Erickson, C. S., Epstein, M. L., Gosain, A. Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development. J. Vis. Exp. (98), e52716, doi:10.3791/52716 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter