Introduction
Un funcionamiento del sistema nervioso entérico (ENS), que controla la motilidad, la absorción de nutrientes, y el flujo sanguíneo local, es esencial para la vida 1. El ENS está formado por células de la cresta neural (NCC) que proliferan, migran y colonizar el intestino, donde se diferencian en neuronas de los ganglios que contiene y células gliales. Enfermedad de Hirschsprung (herencia mendeliana HSCR, en línea en el hombre), un trastorno congénito multigeneic con una incidencia de 1 en 4.000 nacidos vivos, se puede considerar la enfermedad prototípico para el estudio de la formación de ENS interrumpido. En HSCR, NCC dejan de migrar y colonizar a longitudes variables del intestino posterior distal 2. Además, otra gastrointestinal común (GI) defectos en el desarrollo de la población pediátrica, como malformaciones anorrectales, atresias intestinales y trastornos de la motilidad se asocian con alteraciones en las funciones básicas de la ENS, y es probable que, asociados con cambios anatómicos subestimados sutiles y cambios funcionales enel 3-6 ENS. Por lo tanto, las técnicas que nos permitan comprender los determinantes del desarrollo de la formación ENS pueden arrojar luz sobre la patogénesis y el tratamiento potencial de trastornos del tracto GI pediátricos.
A raíz de la migración y colonización, NCC se diferencia en neuronas con marcadores específicos para su fenotipo neurotransmisor. Las neuronas colinérgicas representan aproximadamente el 60% de las neuronas entéricas 7, y pueden ser detectados por tinción para la colina acetiltransferasa (ChAT), la enzima sintetizadora de la acetilcolina del neurotransmisor excitatorio. Históricamente, los intentos de visualizar las neuronas colinérgicas fueron confundidos por los diferentes antígenos especificidad de anticuerpos dirigidos contra el sistema nervioso central (SNC) Chat contra el sistema nervioso periférico (SNP) Chat 8-10. Sin embargo, los anticuerpos dirigidos contra ChAT placentaria reconocer tanto ChAT central y periférico 11-13, y tenemos técnicas recientemente descritos que permiten visualización de las neuronas colinérgicas ENS con alta sensibilidad anteriormente en el desarrollo que se ha logrado con líneas reportero ChAT 14.
A continuación, presentamos una técnica de disección, la fijación y la inmunotinción de la murino tubo digestivo embrionario visualizar ENS expresión neurotransmisor en las neuronas. Para estos estudios, hemos utilizado ratones chat-Cre se aparearon con R26R: animales tdTomato para producir chat-Cre; R26R:: floxSTOP ratones tdTomato (definidos como Chat-Cre tdTomato todo el manuscrito): floxSTOP. Estos animales fueron entonces aparearon con ratones reportero GFP-ChAT homocigotos, para obtener ratones que expresan ambos reporteros fluorescentes que detectan la expresión de ChAT 14. Estos dos animales reportero están en un fondo C57BL / 6J y están disponibles comercialmente (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).
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Protocol
La Universidad de Wisconsin Cuidado de Animales y el empleo Comisión aprobó todos los procedimientos.
1. Preparación de soluciones
- Utilice fosfato 1x solución salina tamponada (PBS) como tampón de disección y solución de lavado.
- Preparar 30% de sacarosa pesando 30 g de sacarosa y el lugar en una botella. Añadir 99 ml de 1x PBS y añadir 1 ml 10% de azida de sodio. Mezclar bien hasta que toda la sacarosa se disuelve. Almacenar a 4 ° C hasta que sea necesario.
- Preparar la solución de bloqueo mediante la mezcla de 1x PBS, 3% de albúmina de suero bovino (BSA) y 0,1% de Triton-X-100. Mezclar bien y guardar en la nevera hasta que se necesite.
- Preparar 8% de paraformaldehído solución (PFA) en PBS 1x pesando la cantidad apropiada de PFA en PBS 1x y luego se incuba a 65 ° C hasta que se disuelva completamente. Almacenar en alícuotas de 25 ml en el congelador a -20ºC hasta que se necesite. Diluir hasta 4% PFA en PBS 1x en el día de uso.
2. Embriones y Gut Dissection
- De conformidad con el animal de Atención Institucional y el empleo Comisión protocolos aprobados, la eutanasia del ratón embarazada cronometrado y transferir al útero en un 60 mm placa de Petri que contiene hielo frío PBS 1x.
- Bajo un microscopio de disección con tijeras afiladas, corte la pared uterina abierta para exponer los embriones. Retire los embriones del útero y el lugar en una limpia de 60 mm placa de Petri que contiene hielo frío PBS 1x.
- La eutanasia a cada embrión por decapitación en 1x PBS helado. Si está utilizando ratones transgénicos que contienen proteínas fluorescentes, con iluminación de fluorescencia, identificar los embriones transgénicos positivos.
- Diseccionar el tracto GI de cada embrión utilizando un microscopio de disección. Usando unas pinzas finas, orientar el embrión de tal manera que el lado izquierdo está mirando hacia arriba y el lado derecho está en contra de la parte inferior de la placa de Petri. Retire la pared superior del cuerpo del embrión para exponer los órganos internos. Inserte pinzas finas entre la pared dorsal del cuerpo y los órganos internos. CrOSS los fórceps uno contra el otro en una acción de corte de tijera para eliminar los órganos internos del embrión.
- Además sub-diseccionar el tracto GI lejos de los órganos circundantes y luego colocar cada tracto gastrointestinal en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contiene helada 1x PBS.
3. Fijación de GI Tracts
- Enjuague cada tracto GI 3 veces con 1x PBS helado y luego vuelva a colocar con 4% PFA. Fijar los tractos gastrointestinales en los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml en una plataforma oscilante a temperatura ambiente durante 1,5 hr. Enjuagar los tractos GI 3 veces durante 5 min a RT y luego durante 1 hr en la plataforma oscilante. En esta etapa, almacenar los tractos GI a 4 ° C en 30% de sacarosa en 1x PBS que contiene 0,1% de azida de sodio hasta que se necesite.
NOTA: Como alternativa, almacenar los embriones en el 30% de sacarosa hasta por un año sin ningún efecto sobre la integridad de los tejidos. Almacenamiento de las muestras en 30% de sacarosa permite el procesamiento posterior de las muestras o bien para inmunotinción o en PTU para su crio-SECCIng. Como alternativa, proceda con el protocolo de inmunotinción se detalla a continuación.
4. Protocolo Inmunoticción
- Si las muestras se han almacenado en el 30% de sacarosa, enjuagarlos 3 veces durante 20 minutos en 1x PBS en una plataforma oscilante.
- Coloque los tractos GI en solución de bloqueo en una plataforma oscilante durante 1 hora a RT.
- Eliminar la solución de bloqueo e incubar los tractos GI con la cantidad apropiada de anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo, ya sea para 4 horas a RT o O / N a 4 ° C en una plataforma oscilante. Utilice 1: 1000 dilución de anticuerpo humano anti-Hu (suero obtenido de paciente), 1: 1000 dilución de pollo anti-proteína verde fluorescente (GFP) de anticuerpos y dilución 1: 100 de anticuerpo de cabra anti-chat.
NOTA: Utilizamos un anticuerpo anti-Hu humano que fue obtenida localmente a partir de un paciente, sin embargo, los anticuerpos anti-Hu están disponibles comercialmente, por ejemplo, de ratón anti-Hu, (uso en dilución 1: 500). - Enjuague los tractos gastrointestinales en 1x PBS3 veces durante 5 min y luego durante 1 hora a RT en una plataforma oscilante.
- Vuelva a colocar la PBS 1x con anticuerpos secundarios diluidos 1: 500 en solución de bloqueo en una plataforma oscilante, ya sea para 4 horas a RT o O / N a 4 ° C. Utilice burro tinte amina reactiva antihumano como DyLight, Cy2 anti-pollo burro y burro anti-cabra Cy5. Si se utiliza el ratón anti-Hu luego use una dilución 1: 500 de burro anti-ratón-amina reactiva de colorante 405.
NOTA: La intensidad de la GFP y la expresión endógena tdTomato y la claridad de la inmunotinción aumento con la edad de desarrollo. Por lo general inmunotinción tripas embrionarias individualmente en tubos de 0,2 ml con 150 l de solución de tinción con el fin de reducir el volumen de anticuerpo utilizado y también para asegurar la tinción eficiente del tejido. - Enjuagar los tractos GI en 1X PBS 3 veces durante 5 min y luego durante 1 hora a RT en una plataforma oscilante.
- Coloque unas pocas gotas de medio de montaje de fluorescencia con DAPI en un portaobjetos de vidrio. Sumerja los tra GIct en el medio de montaje de fluorescencia y añadir una cubierta de vidrio directamente en la parte superior del tejido. El medio de montaje -G fluorescencia es un compuesto soluble en agua que proporciona un sello semi-permanente.
NOTA: El uso medio de montaje de fluorescencia como Vectashield que es un glicerol basado medio que previene la decoloración y fotoblanqueo de anticuerpos de montaje. Ambos productos permiten a los tejidos para ser almacenados por largos períodos de tiempo a 4 ° C. - Capturar imágenes de cada uno de fluoróforo utilizando un microscopio confocal. Utilice longitudes de onda de excitación de los fluoróforos y filtros empleados se presentan en la Tabla 3.
- Realizar análisis de imagen asistido por ordenador usando el software apropiado dependiendo del tipo de confocal utilizado para capturar imágenes.
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Representative Results
Hemos descrito previamente la generación de ratones que expresan tanto las buenas prácticas agrarias y tdTomato reporteros fluorescentes que detectan la expresión de ChAT 14. En pocas palabras, los ratones chat-Cre se aparearon con R26R: floxSTOP: animales tdTomato para producir chat-Cre; R26R: ratones tdTomato (llamados chat-Cre tdTomato): floxSTOP. Estos animales fueron entonces aparearon con ratones reportero GFP-ChAT homocigotos. Se aislaron embriones y tejidos se diseccionaron antes de ser fijo y se inmunotiñeron como anteriormente, con los anticuerpos listados en la Tabla 1. El intestino delgado distal (SI) y el colon proximal se analizaron en E11, E13.5 y E16.5
En E11, las neuronas Hu-positivos están presentes dentro de la SI distal, pero NCC aún no han alcanzado el colon proximal (Figura 1). En este punto de tiempo, la mayoría de las neuronas Hu-positivas demuestran la inmunorreactividad ChAT así como positividad GFP. Curiosamente, en este punto de tiempo, expresión del constructo tdTomato chat-Cre no es detectable. Por E13.5, la mayoría de las neuronas Hu-positivas son a la vez chat-IR y chat-GFP positivos, y un pequeño número de neuronas tdTomato positivos chat-Cre se ven. El número de Chat-Cre neuronas tdTomato positivos aumenta en E16.5, pero sigue siendo una pequeña fracción del número de neuronas ChAT-IR.
Figura 1. Imágenes representativas de colinérgica neuronas en el Distal intestino delgado y colon en Embryonic Día 11. En E11, en el distal SI (con la etiqueta "SI") y el colon proximal (etiquetados como "Co"), las neuronas Hu-positivos (azul) sólo están presentes dentro de la SI en esta etapa. La mayoría de las neuronas Hu-positivas son co-immunostained con Chat-IR (blanco) y chat-GFP (verde). Sin embargo, en este punto del tiempo, ninguna de estas neuronas son ChAT-Cre tdTomato positivo (rojo). Escalabar = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Imágenes representativas de colinérgica neuronas en el Distal intestino delgado y colon en embrionarias Días 13,5 y 16,5. La imagen muestra las neuronas colinérgicas en el intestino delgado distal en E13.5 (paneles superiores) y E16.5 (paneles inferiores). En E13.5 la mayoría de las neuronas Hu-positivos fueron chat-IR y chat-GFP (paneles superiores) positivos. Un pequeño número de estos co-expresada chat-Cre tdTomato. Por E16.5, más neuronas ChAT-Cre tdTomato se encuentran en los ganglios de la naciente (paneles inferiores). Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figure.
| Anticuerpos primarios | |||
| Antígeno | Inmunógeno | Dilución | Proveedor y detalles |
| Hu (proteína neuronal humano) | Proteína Hu | 1: 1000 | El suero de paciente humano (Madison, WI) |
| GFP (proteína verde fluorescente) | Proteína GFP, fracción IgY | 1: 1000 | Aves Lab, Inc. (Tigard, OR), pollo policlonal, GFP-1020 |
| Chat (La colina acetiltransferasa) | Enzima placentario humano | 1: 100 | Millipore (Billerica, MA), policlonal de cabra, AB144P |
| Los anticuerpos secundarios | |||
| Nombre | Fluoróforo | Dilución | Proveedor y detalles |
| Anti-humano Burro DyLight 405 | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 709-475-149 | |
| Anti-pollo burro | Cy2 | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 703-225-155 |
| Burro anti-cabra | Cy5 | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 705-175-147 |
Tabla 1. Detalles de anticuerpos primarios y secundarios utilizados en el estudio. Los anticuerpos primarios y secundarios utilizados en este estudio, junto con su proveedor y las diluciones utilizadas.
| Anticuerpos primarios | |||||||
| Antígeno | Dilución | Proveedor | Anticuerpo secundario | ||||
| SOX10 | 1:50 | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX | Burro anti-cabra | ||||
| p75 | 1: 250 | Promega, Madison WI | Anti-conejo de burro | ||||
| PGP9.5 | 1: 1000 | Abcam, Cambridge, MA | Anti-conejo de burro | ||||
| BFABP | 1: 500 | Millipore, Billerica, MA | Anti-conejo de burro | ||||
| S-100 | 1: 500 | DAKO, Carpinteria, CA | Anti-conejo de burro | ||||
| GFAP | 1: 500 | DAKO, Carpinteria, CA | Anti-conejo de burro | ||||
| nNOS | 1: 500-1000 | Emson, Cambridge, Reino Unido | Anti-Ovejas Burro | ||||
| VIP (polipéptido intestinal vasoactivo) | 1: 500 | Epstein y Paulsen, Madison, WI | Anti-conejo de burro | ||||
| La sustancia P | 1: 200-400 | DiaSorin, Stillwater, MN | Anti-Ovejas Burro | ||||
| Los anticuerpos secundarios | |||||||
| Nombre | Dilución | Proveedor y detalles | Fluoróforo | ||||
| Anti-humano Burro | 1: 500-1000 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | DyLight 488 | ||||
| Anti-humano Burro | 1: 1000 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 | ||||
| Anti-conejo de burro | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | DyLight 488 | ||||
| Anti-conejo de burro | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 | ||||
| Anti-Ovejas Burro | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy2 | Anti-Ovejas Burro | 1: 1500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 |
| Burro anti-cabra | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 | ||||
Tabla 2. anticuerpos adicionales primarios y secundarios de uso en el estudio del desarrollo ENS. Los anticuerpos primarios y secundarios que hemos previamente empleados en nuestros estudios de desarrollo Ens.
| Excitación | Emisión | |||
| Laser Line | Fluoróforo Tipo | Ejemplos | Tubo fotomultiplicador | Opciones de filtro |
| 408 nm | Azul | Alexa Fluor 405, Cascada Azul, cumarina 30, DAPI, Hoechst, Pacific Blue, la mayoría de los puntos cuánticos | 1 | BP 425-475 nm |
| 488 nm | Verde | Alexa Fluor 488, ATTO 488, Calceína, Cy2, eGFP, FITC, Oregon Green, YO-PRO-1 | 2 | BP 500-550 nm |
| 561 nm | Rojo | Alexa Fluor 546, 555, 568, y 594, Cy3, Dil, DsRed, mCherry, ficoeritrina (PE), yodo propidio (PI), RFP, TAMRA, tdTomato, TRITC | 3 | BP 570-620 nm |
| 638 nm | Lejos Red | Alexa Fluor 633 y 647, Aloficocianina (APC), Cy5, TO-PRO-3 | 4 | BP 663-738 nm |
Tabla 3. Confocal de longitudes de onda de excitación de formación de imágenes, fluoróforos y filtros. Se presentan las longitudes de onda de excitación, fluoróforos detectables, y los filtros utilizados. Esta información puede ser utilizada en la elección de combinaciones de anticuerpos secundarios para inmunofluorescencia multicolor.
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Discussion
Nuestro laboratorio y otros han demostrado que los defectos intestinales en HSCR no se limitan al colon aganglionar pero extenderse proximalmente, incluso en el intestino delgado ganglionar 5,15,16. Estas alteraciones incluyen cambios en la densidad y ENS fenotipo neuronal neurotransmisor y puede dar cuenta de dismotilidad que se ha observado en pacientes con HSCR. Hemos utilizado las técnicas anteriores en nuestros esfuerzos para comprender los determinantes de la formación de la ENS. En concreto, estas técnicas se han empleado para visualizar neuronas óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS), las neuronas de polipéptidos intestinales vasoactivos (VIP), así como la colina acetiltransferasa (ChAT) neuronas (Tabla 2) 5. Una ventaja clave de esta técnica es la capacidad de almacenar las muestras en 30% de sacarosa para su posterior procesamiento, ya sea para inmunotinción o para incrustar y cryosectioning.
NCC colonización del intestino se produce como un frente de onda de avance From E9.5 a E14.5. La inmunotinción con Hu, que identifica las neuronas, como se describió anteriormente, junto con análisis de imagen asistido por ordenador, permite comparaciones cuantitativas de densidad neuronal. Las reducciones en la densidad neuronal se encuentran porciones del intestino ganglionar de HSCR 5, así como en otros modelos de dismotilidad intestinal 13. Los ratones con una supresión condicional de Hand2 demuestran los cambios en las proporciones de las neuronas que expresan diferentes neurotransmisores, así como un número reducido neuronales. Además, los animales con sobre-expresión de PTEN Noggin o muestran una mayor densidad neuronal a lo largo de su intestino 6,17.
El saldo de fenotipos neurotransmisores entre las neuronas de la ENS está estrechamente regulada, lo que resulta en la contracción coordinada de la pared intestinal para el movimiento del contenido luminal, la regulación del flujo sanguíneo y la absorción de nutrientes. Una vez NCC adquirir una identidad neuronal, hay una estrecha ventana de tiempo antes decomprometerse con un fenotipo neurotransmisor 14. Recientemente hemos demostrado que la inmunotinción identifica un fenotipo neurotransmisor ChAT en E10.5, un estado embrionario antes de lo observado con los modelos reportero genéticos (por ejemplo, chat-Cre o chat-GFP) 14. Además, chatear neuronas inmunorreactivas alcanzan niveles adultos (como proporción de todas las neuronas ENS) temprano en el desarrollo, un resultado que sugiere que las neuronas ChAT pueden tener un papel en la regulación de una mayor diferenciación neuronal en la ENS.
El óxido nítrico sintasa (NOS) es el neurotransmisor relajación primaria que se encuentra en la ENS, y se incrementará proporcionalmente en las neuronas ENS a lo largo del intestino en HSCR 5. Además, las alteraciones en el péptido intestinal vasoactivo (VIP), un neurotransmisor que participa también en la mediación de la relajación muscular y la regulación del flujo sanguíneo a lo largo de la pared intestinal, se encuentran en modelos HSCR 5. Estos datos sugieren que, con el fin de entender cómo el borradoronents de la ENS regulan su función, debe llevarse a cabo un examen sistemático de los diferentes neurotransmisores. Las técnicas presentadas aquí pueden adaptarse fácilmente para permitir este tipo de análisis mediante el uso de los anticuerpos apropiados.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado byThe Premio American Pediatric Surgical Association Foundation (AG) y los Institutos Nacionales de Salud K08DK098271 (AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
References
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