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Bioengineering

लाल रक्त कोशिका एकत्रीकरण के गतिशील जांच के लिए नियंत्रित Microfluidic पर्यावरण

Published: June 4, 2015 doi: 10.3791/52719
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Mechanical Engineering, University of Ottawa

ERRATUM NOTICE

Summary

प्रोटोकॉल इमेज प्रोसेसिंग तकनीक पर आधारित है, विवरण एक नियंत्रित और स्थिर कतरनी दर के तहत लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) समुच्चय यों के लिए एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन किया। इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के लिए एक नियंत्रित microfluidic के वातावरण में इसी कतरनी दर को आरबीसी कुल आकार से संबंधित है।

Abstract

रक्त, एक गैर न्यूटोनियन biofluid के रूप में, hemorheology क्षेत्र में कई अध्ययनों का ध्यान केंद्रित का प्रतिनिधित्व करता है। रक्त घटक लाल रक्त कोशिकाओं, रक्त प्लाज्मा में निलंबित कर रहे हैं कि सफेद रक्त कोशिकाओं और प्लेटलेट्स शामिल हैं। कारण लाल रक्त कोशिकाओं की बहुतायत (रक्त की मात्रा का 40% से 45%) करने के लिए, उनके व्यवहार को विशेष रूप से microcirculation में रक्त की rheological व्यवहार पैदा करती है। बहुत कम कतरनी दरों पर, लाल रक्त कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए देखा जाता है और फार्म संस्थाओं खून की गैर-न्यूटन का व्यवहार का कारण बनता है, जो समुच्चय कहा जाता है। यह microcirculation में रक्त rheology समझने के लिए समुच्चय के गठन की शर्तों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल छवि प्रसंस्करण पर आधारित है, लगातार कतरनी दर के तहत मात्रात्मक microcirculation में आरबीसी समुच्चय निर्धारित करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया का विवरण है। इस प्रयोजन के लिए, आरबीसी, निलंबन परीक्षण कर रहे हैं और 120 X 60 माइक्रोन पाली डाइमिथाइल-siloxane (PDMS) microchannels में विश्लेषण किया गया। आरबीसी निलंबन ent रहे हैंरक्त परत के भीतर एक रेखीय वेग प्रोफ़ाइल प्राप्त है और इस तरह लगातार कतरनी दरों की एक विस्तृत श्रृंखला को प्राप्त करने के क्रम में एक दूसरे तरल पदार्थ का उपयोग कर बारिश। आरबीसी समुच्चय एक उच्च गति कैमरे का उपयोग कल्पना कर रहे हैं, जबकि कतरनी दर, एक सूक्ष्म कण छवि velocimetry (μPIV) प्रणाली का उपयोग करते हुए निर्धारित होता है। आरबीसी समुच्चय के कब्जा कर लिया वीडियो छवियों तीव्रता के आधार पर कुल आकार निर्धारित करने के लिए इमेज प्रोसेसिंग तकनीक का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं।

Introduction

लाल रक्त कोशिकाओं (लाल रक्त कोशिकाओं) रक्त की rheological व्यवहार का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। वे लगभग अकेले इन विट्रो में और vivo में रक्त का विशेष गुण के लिए जिम्मेदार हैं। शारीरिक शर्तों के तहत, लाल रक्त कोशिकाओं रक्त की मात्रा का 40% से 45% पर कब्जा। Microcirculation में, लाल रक्त कोशिकाओं के कारण ही छोटे पोत व्यास और प्रभाव 1 उड़े प्लाज्मा को रक्त की मात्रा का 20% तक कब्जा करना था। Microcirculation में प्लाज्मा कमी की यह घटना Fåhræus प्रभाव के रूप में जाना जाता है। कम कतरनी दरों पर, लाल रक्त कोशिकाओं इसलिए खून की गैर-न्यूटन का व्यवहार करने के लिए योगदान, एक साथ पाटने और "rouleaux" या समुच्चय बुलाया आयामी एक या एक से तीन आयामी संरचना बनाने में सक्षम हैं। हालांकि, आरबीसी एकत्रीकरण का तंत्र पूरी तरह से समझ नहीं है। दो सिद्धांतों लाल रक्त कोशिकाओं के एकत्रीकरण मॉडल करने के लिए मौजूद हैं: कोशिकाओं सिद्धांत का सेतु की वजह से बड़े अणुओं 2 के पार से जोड़ने और बल आकर्षक करने के लिएtion के सिद्धांत के कारण आसमाटिक ढाल से 3 अणुओं की कमी की वजह से।

आमतौर पर, मानव रक्त के लिए, समुच्चय 1 से 10 सेकंड -1 को लेकर बहुत कम कतरनी दरों 4 बजे के रूप में। इस सीमा से ऊपर, लाल रक्त कोशिकाओं disaggregate और पोत के भीतर अलग से प्रवाह के लिए करते हैं।

समुच्चय के गठन की शर्तों को समझना रक्त का रियोलॉजिकल व्यवहार को परिभाषित करने के मामले में hemorheology क्षेत्र के लिए एक बहुत महत्व का है। ये समुच्चय अक्सर macrocirculation स्तर (> 300 माइक्रोन व्यास) 5 पर देखा जाता है। इस पैमाने पर, रक्त एक न्यूटोनियन तरल पदार्थ और एक समरूप मिश्रण के रूप में माना जाता है। हालांकि, इन समुच्चय शायद ही कभी केशिका स्तर (व्यास में 4-10 माइक्रोन) में देखा जाता है और आम तौर पर इस तरह के मधुमेह 6 और मोटापे के रूप में रोग की स्थिति का संकेत कर रहे हैं। आरबीसी एकत्रीकरण भड़काऊ या संक्रामक शर्तें शामिल बदल सकता है कि अन्य रोग की स्थिति,ऐसे उच्च रक्तचाप या atherosclerosis, आनुवंशिक विकारों और पुराने रोगों के रूप में 7 हृदय रोगों। इसलिए, आरबीसी एकत्रीकरण तंत्र को समझने और (इन समुच्चय और प्रवाह की स्थिति के आकार के बीच एक संबंध को परिभाषित द्वारा) इन संस्थाओं का विश्लेषण करने के खून की microrheological व्यवहार को समझने के लिए ले जा सकता है और इसलिए नैदानिक ​​आवेदन करने के लिए संबंधित हैं।

आरबीसी समुच्चय ऐसे हेमाटोक्रिट (रक्त में लाल रक्त कोशिकाओं की मात्रा), कतरनी दर, पोत व्यास, आरबीसी झिल्ली कठोरता और निलंबित मध्यम रचना 8-10 के रूप में कई कारकों से बदला जा सकता है। इसलिए, नियंत्रित परिस्थितियों को प्रभावी ढंग से आरबीसी समुच्चय का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक हैं। कई तरीकों रक्त व्यवहार के बारे में प्रासंगिक जानकारी प्रदान करता है कि स्थिर एकत्रीकरण माप (एकत्रीकरण सूचकांक) उपलब्ध कराने के द्वारा कुल गठन का विश्लेषण करने में सक्षम हैं। इन विधियों, अन्य बातों के साथ, एरिथ्रोसाइट अवसादन दर शामिलविधि 11, प्रकाश संचरण विधि 12, प्रकाश प्रतिबिंब विधि 13 और कम कतरनी चिपचिपापन विधि 14।

कुछ अध्ययनों आरबीसी एकत्रीकरण का अध्ययन करने और नियंत्रित प्रवाह की स्थिति 15-17 में एकत्रीकरण की डिग्री का निर्धारण करने का प्रयास किया। हालांकि, इन अध्ययनों से परोक्ष रूप से एकत्रीकरण की डिग्री के साथ ही स्थानीय चिपचिपाहट के बारे में जानकारी उपलब्ध कराने के सूक्ष्म रक्त छवियों के आधार पर मापा जाता है एक बाल काटना प्रणाली में कब्जा अंतरिक्ष के अनुपात का निर्धारण करके आरबीसी कुल आकार की जाँच।

इसलिए हम सीधे आरबीसी नियंत्रित और स्थिर कतरनी दरों के तहत, गतिशील, microcirculation में समुच्चय यों के लिए एक नई प्रक्रिया को प्रस्तुत करते हैं। एक बफर फॉस्फेट (पीबीएस) खारा समाधान इसलिए रक्त परत में एक कतरनी प्रवाह पैदा करने के साथ, (चित्रा 1 में सचित्र के रूप में) आरबीसी निलंबन एक डबल वाई-microchannel में, entrained कर रहे हैं। इस रक्त के भीतर एक निरंतर एक प्रकार का वृक्ष परतआर दर प्राप्त की जा सकती है। आरबीसी निलंबन अलग हेमाटोक्रिट (एच) के स्तर (5%, 10% और 15%) में और अलग अलग कतरनी दर (2-11 सेकंड -1) के तहत जांच की जाती है। रक्त वेग और कतरनी दर प्रवाह एक उच्च गति कैमरे का उपयोग कर कल्पना की है, जबकि एक सूक्ष्म कण छवि velocimetry (μPIV) प्रणाली का उपयोग करते हुए निर्धारित कर रहे हैं। प्राप्त परिणामों तो लाल रक्त कोशिकाओं का पता लगाने और कुल आकार निर्धारित करने के लिए छवि तीव्रता के आधार पर एक MATLAB कोड के साथ कार्रवाई कर रहे हैं।

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Protocol

रक्त ओटावा विश्वविद्यालय (H11-13-06) की आचार समिति के अनुमोदन के साथ स्वस्थ व्यक्तियों से एकत्र किया जाता है।

1. Microchannel निर्माण

microchannels के मानक photolithography विधियों 18 के आधार पर निर्मित कर रहे हैं।

  1. एक कम्प्यूटर एडेड डिजाइन (सीएडी) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर microchannel ज्यामिति डिजाइन और एक पारदर्शिता फोटो मुखौटा पर विन्यास मुद्रित करें। वे निर्माण की प्रक्रिया के दौरान प्रकाश पथ हुक्म के बाद से इन मास्क महत्वपूर्ण हैं। इस मामले में, microchannel के आयाम गहराई में मोटाई में 120 माइक्रोन, 60 माइक्रोन और लंबाई में 7 मिमी हैं।
  2. एक cleanroom में, स्पिन कोट एक epoxy नकारात्मक आधारित वांछित microchannel गहराई (60 माइक्रोन) प्राप्त करने के लिए 30 सेकंड के लिए 2,000 rpm पर एक सिलिकॉन वेफर पर तस्वीर का विरोध।
  3. वेफर और 650 MJ / 70 सेकंड के लिए 2 सेमी में एक यूवी दीपक के नीचे फोटो मुखौटा बेनकाब। का केवल पारदर्शी क्षेत्रों को बेनकाब करने के लिए सुनिश्चित करेंयूवी प्रकाश के लिए फोटो मुखौटा। पारदर्शी क्षेत्रों के लोगों तक पहुंचाने के लिए एक सख्त में जिसके परिणामस्वरूप श्रृंखला के polymerization के लिए अनुमति देता है फोटो का विरोध। से अधिक दूर करने के लिए एक डेवलपर में सिलिकॉन टुकड़ा विसर्जित तस्वीर का विरोध।
  4. पाली-डाइमिथाइल-siloxane (PDMS) के एक समाधान बनाने के लिए 1: ढालना निर्मित है एक बार, 10 के अनुपात में एक सिलिकॉन आधारित elastomer और एक इलाज एजेंट मिश्रण। देगास करने के लिए एक निर्वात चैम्बर में PDMS समाधान रखो। मोल्ड में डालो और 90 मिनट microchannels बनाने के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर गरम। तो 90 सेकंड के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा संबंध का उपयोग कर एक गिलास स्लाइड करने के लिए अलग-अलग चैनलों बांड।
    नोट: PDMS देगास प्रक्रिया मिश्रण प्रक्रिया द्वारा engendered हवाई बुलबुले को खत्म करने के क्रम में किया जाता है।
  5. Microchannel के आयाम सफल परीक्षण के लिए अनुमति सुनिश्चित करें। इस प्रोटोकॉल में, microchannels के 120 X 60 माइक्रोन का एक आयताकार पार अनुभाग है। इसकी तुलना में, एक औसत आरबीसी 8 माइक्रोन की एक व्यास और 2 माइक्रोन की मोटाई है।refore, microchannel चौड़ाई उचित एकत्रीकरण का निरीक्षण और इसे सही वेग प्रोफाइल निर्धारित करने के लिए पर्याप्त है।

2. रक्त की तैयारी

  1. एक आचार समिति के अनुमोदन के बाद, स्वस्थ स्वयंसेवक दाताओं से खून ले लीजिए। संग्रह ट्यूबों में मौजूद ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के साथ खून (रक्त के 4 मिलीलीटर में 7.2 मिलीग्राम EDTA) समझो।
    नोट: EDTA के रक्त के थक्के से बचने के लिए प्रयोग किया जाता है।
  2. रक्त के घटकों को अलग करने के क्रम में 1400 XG (3000 आरपीएम) में रक्त के नमूनों को 10 मिनट के लिए तीन बार अपकेंद्रित्र। Centrifugation का एक परिणाम के रूप में, तीन अलग परतों निरीक्षण करते हैं।
    नोट: तीन परतों (ट्यूब के नीचे स्थित) आरबीसी परत, (आरबीसी परत के शीर्ष पर स्थित सफेद रक्त कोशिकाओं और प्लेटलेट्स से मिलकर) Buffy कोट कर रहे हैं और प्लाज्मा परत (सभी दूसरे के शीर्ष पर स्थित घटक)।
    1. पहले centrifugation के बाद, एक रक्त पिपेट का उपयोग रक्त प्लाज्मा इकट्ठा। किसी भी सी से बचेंबफी कोट के साथ ontact।
    2. लीजिए और 10% पर पतला ब्लीच के साथ एक कंटेनर में Buffy कोट के निपटान के।
    3. शेष आरबीसी परत के साथ ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए पीबीएस पीएच 7.4 से 3 मिलीलीटर जोड़ें और सेंट्रीफ्यूज का उचित संतुलन सुनिश्चित करते हैं। धीरे 10 मिनट के लिए 1400 XG (3000 आरपीएम) पर एक बार फिर ट्यूब और अपकेंद्रित्र मिश्रण।
      नोट: वे कोशिका आसंजन को बदल सकता है के बाद से पीबीएस समाधान किसी भी मैगनीशियम या कैल्शियम शामिल नहीं करता है सुनिश्चित करें।
    4. दूसरा centrifugation के बाद ट्यूब में पीबीएस के निपटाने और अगर वर्तमान शेष buffy कोट को हटा दें। दोहराएँ तीसरे centrifugation के स्वच्छ लाल रक्त कोशिकाओं की उपज के लिए के लिए 2.2.3 और 2.2.4 कदम।
  3. , इसी (5% के साथ आरबीसी निलंबन को प्राप्त करने के क्रम में 10% और 15% 1 मिलीलीटर ट्यूब में प्लाज्मा (0.95, 0.9 और 0.85 मिलीग्राम) के साथ स्वच्छ लाल रक्त कोशिकाओं के लिए आवश्यक राशि (0.05, 0.1 और 0.15 मिलीग्राम) मिक्स ) हेमाटोक्रिट। एक microcentrifuge साथ hematocrits की जाँच करें।

3. तरल पदार्थ तैयारी

  1. फ्लोरोसेंट ट्रेसर कणों समाधान के 60 μl जोड़ें (1% ठोस, ​​डी कण = 0। 86 माइक्रोन, λ = 542 एनएम पेट और 1 मिलीलीटर आरबीसी निलंबन ट्यूबों में λ उत्सर्जन = 612 एनएम)।
    नोट: (आंतरिक रूप से polystyrene के कणों रंगे) फ्लोरोसेंट ट्रेसर कणों microchannel के भीतर प्रवाह के वेग को मापने के लिए किया जाता है। लेजर बीम (λ = 542 एनएम) की इसी तरंगदैर्ध्य के संपर्क में जब ये कण प्रतिदीप्ति।
  2. एक पीबीएस 7.4 पीएच समाधान तैयार है और पीबीएस समाधान के 1 मिलीलीटर में एक ही फ्लोरोसेंट ट्रेसर कणों समाधान के 60 μl जोड़ें।

4. समुच्चय आकार माप

  1. Microchannel में तरल पदार्थ (आरबीसी, निलंबन और पीबीएस) सम्मिलित करने के लिए, 25 μl और 100 μl के दो गिलास सीरिंज का उपयोग करें। यह करेगाप्रणाली का अनुपालन कम करने में मदद। ट्यूबिंग और प्रवेश छेद ढाले connectors के माध्यम से सीरिंज को microchannel कनेक्ट करें। द्रव कंटेनर और सिरिंज के बीच मौजूदा दबाव अंतर का उपयोग कांच सीरिंज भरें। कोई बुलबुले प्रणाली में मौजूद हैं सुनिश्चित करें। एक वैकल्पिक विधि के रूप में, microchannel में दोनों तरल पदार्थ ड्राइव करने के लिए एक प्रेशर नियंत्रित प्रणाली का उपयोग करें।
  2. एक उच्च गति कैमरा और एक μPIV प्रणाली से जुड़े एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर microchannel रखें। कार्यक्रम (पीबीएस के लिए क्यू = 8 μl / घंटा की flowrate engendering रक्त के लिए उदाहरण के लिए, क्यू = 2 μl / घंटा) वांछित प्रवाह दर को सिरिंज पंप।
    नोट: केवल एक ही सिरिंज पंप किया जाता है। दो अलग अलग आंतरिक व्यास के साथ दो अलग कांच सीरिंज का प्रयोग, यह वाई-microchannel की प्रत्येक शाखा में प्रवेश flowrate के लिए अलग अलग करने के लिए संभव है।
  3. में दिखाया गया के रूप में एक अलग प्रविष्टि शाखा से और अलग अलग flowrates पर डबल वाई-microchannel में दोनों तरल पदार्थ प्रत्येक डालने (आंकड़े 2 और 3) दो शाखाएं 19 के बीच (इस मामले में 4) एक ही उचित अनुपात को बनाए रखता है। माप प्राप्त करने से पहले स्थिर अवस्था तक पहुँचने के लिए प्रवाह के लिए प्रतीक्षा करें: नेत्रहीन एक निर्बाध प्रवाह के लिए उच्च गति कैमरा छवियों का निरीक्षण किया।
    नोट: अनुपात रक्त परत के भीतर एक रेखीय वेग प्रोफ़ाइल प्राप्त करने में महत्वपूर्ण है।
  4. उच्च गति कैमरे का उपयोग कर लाल रक्त कोशिकाओं कल्पना। द्रव का प्रवाह की छवियों को नियंत्रित, रिकॉर्ड और बचाने के लिए एक कंप्यूटर के लिए कैमरा कनेक्ट करें। दो तरल प्रवाह स्थिर अवस्था तक पहुँच जाने के बाद, रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं।
    1. बेहतर प्रोसेसिंग परिणामों के लिए कई छवियों मोल। समुच्चय के एक साफ छवि के लिए एक इष्टतम कैमरा जोखिम समय निर्धारित करते हैं।
      नोट: इस मामले के लिए कैमरा जोखिम समय 0.5 मिसे था। प्रत्येक फ्रेम के बीच समय अंतराल के चुनाव को कैमरे के फ्रेम दर और टी में प्रवाह की दर के आधार पर किया जाता हैवह microchannel। इस प्रक्रिया में कार्रवाई की प्रत्येक फ्रेम के बीच का समय 60 मिसे था। इसलिए प्रति सेकंड 18 फ्रेम रिकॉर्डिंग में सक्षम एक कैमरे के लिए पर्याप्त है।
      नोट: गलत मापन के लिए ले जा सकता है, जो ट्यूब और सिरिंज में रक्त जमाव से बचें।
  5. इमेज प्रोसेसिंग तकनीक (इस मामले में एक MATLAB कार्यक्रम) का प्रयोग के रूप में निम्नानुसार (चित्रा 4 में सचित्र) पिक्सेल तीव्रता के आधार पर छवियों में से प्रत्येक में समुच्चय का पता लगाने, छवि गुणवत्ता को सुधारने के लिए:
    1. छवियों प्रत्येक फ्रेम के लिए एक बेहतर छवि गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए हिस्टोग्राम बराबरी पद्धति का उपयोग करके इसके विपरीत में वृद्धि।
    2. द्विआधारी छवियों में greyscale छवियों कन्वर्ट। इस उद्देश्य के लिए, प्रत्येक पिक्सेल का रूपांतरण पैदा करती है कि 0 से 1 से लेकर एक सीमा मूल्य, सेट। दहलीज से बड़ा मूल्यों के साथ पिक्सल सफेद पिक्सेल के रूप में पता लगाया जाएगा, जबकि सीमा मूल्य नीचे की छवि में किसी भी पिक्सेल, एक काले पिक्सेल के रूप में पता लगाया जाएगा।
    3. भरनाबेहतर परिणाम के लिए एक समग्र भीतर अंतराल के लिए इसी छेद (वर्तमान और यदि आवश्यक हो तो)।
    4. सन्निकट कक्षों समुच्चय के रूप में जुड़े रहे हैं इसलिए कि द्विआधारी छवि में पड़ोसी सफेद पिक्सल का निर्धारण करने से कोशिकाओं का पता लगाने।
    5. पता चला अलग समुच्चय लेबल और बेहतर दृश्य के लिए एक लाल-हरे-नीले रंग (आरजीबी) छवि में द्विआधारी छवि बदल सकते हैं। इमेज प्रोसेसिंग तकनीक की दक्षता को सत्यापित करने और चित्रा 5 में दिखाया गया के रूप में सभी कोशिकाओं को ध्यान में रखा जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए इसी संसाधित छवियों से प्रत्येक के साथ मूल फ्रेम का मिश्रण। सम्पन्न चरणों 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 पर कब्जा कर लिया सभी फ्रेम के लिए, 4.5.4 और 4.5.5।
    6. पता चला पिक्सेल की संख्या के आधार पर फ्रेम में पता चला प्रत्येक कुल क्षेत्रफल की गणना। इस्तेमाल किया लेंस बढ़ाई के आधार पर, एक अंशांकन reticule का उपयोग करते हुए, रूपांतरण कारक की गणना, और माइक्रोन 2 के लिए परिणाम बदल सकते हैं। प्रत्येक में पाया कुल आकार औसतफ्रेम और फिर आरबीसी निलंबन की प्रत्येक रिकॉर्डिंग के लिए औसत कुल आकार प्राप्त करने के लिए सभी फ्रेम के लिए परिणाम औसत।
    7. प्रत्येक का पता चला कुल भीतर लाल रक्त कोशिकाओं के एक प्रतिनिधि अनुमानित संख्या निर्धारित करने के लिए एक आरबीसी के क्षेत्र की गणना करें। चित्रा 6 में दिखाया गया है कि इन परिणामों का उपयोग करना, (प्रत्येक कुल में कोशिकाओं की अनुमानित संख्या का प्रतिनिधित्व) कुल आकार के एक समारोह के रूप में प्रत्येक कुल भीतर लाल रक्त कोशिकाओं का प्रतिशत के वितरण की गणना।
      नोट: आरबीसी समुच्चय मापने के लिए, ImageJ सॉफ्टवेयर हर फ्रेम पर एक ही कार्य करने के लिए (बजाय MATLAB का) का इस्तेमाल किया जा सकता है।

5. द्रव वेग और कतरनी दर माप

द्रव वेग और एक μPIV प्रणाली का उपयोग इसलिए कतरनी दर निर्धारित करते हैं।

  1. डेटा उच्च गति कैमरे का उपयोग कर प्राप्त कर लिया है, एक बार μPIV प्रणाली के लिए इस्तेमाल डबल स्पंदित कैमरा स्विच। छवि एसी के लिए एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग करेंवेग क्षेत्र निर्धारण के लिए प्रवाह और इमेज प्रोसेसिंग के quisition।
  2. लेजर चालू करने से पहले, लेजर की श्रेणी पर निर्भर करता है, सभी सावधानियों आवश्यक लो। तो फिर सिस्टम, कैमरा और लेजर पर बारी।
  3. इस्तेमाल किया लेंस बढ़ाई पर आधारित कैमरे जांचना। इस प्रयोजन के लिए माइक्रोस्कोप के तहत 10 माइक्रोन परिशुद्धता के एक microscale का उपयोग करें और छवि में 1 पिक्सेल का आकार निर्धारित किया है।
  4. लेजर आरंभ और दोनों तरल पदार्थ में कणों कल्पना। प्रवाह में सबसे तेजी से कणों पर ध्यान केंद्रित करके microchannel के बीच विमान को खोजने के लिए (यानी, सबसे तेजी से कणों प्रतिभाशाली होना चाहिए)।
  5. कण का उचित विस्थापन सुनिश्चित करने के लिए डीटी (लगातार दो फ्रेम के बीच समय अंतराल) निर्धारित करें। सबसे तेजी से कणों दोनों छवियों के बीच के बारे में 5 से 10 पिक्सल बढ़ना चाहिए।
  6. प्रवाह शुरू रिकॉर्डिंग। छवियों के 100 जोड़े, के अलावा 5 मिसे प्राप्त करने के लिए सॉफ्टवेयर सेट करें। सब अलग चरणों के लिए 5.4, 5.5 और 5.6 सम्पन्नअलग आरबीसी, निलंबन और विभिन्न कतरनी दरों के लिए।
    नोट: कार्यप्रणाली की अधिक जानकारी पिट्स और Fenech 20 के अध्ययन में दिया जाता है।
  7. इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ पार से संबंध विधि का उपयोग कर हासिल रिकॉर्डिंग की प्रक्रिया।
    नोट: यह पूर्व निर्धारित आकार की छोटी सी खिड़की में छवियों की जोड़ी discretizing के होते बुलाया सहसंबंध खिड़कियां और एक खिड़की में कणों के विस्थापन के बाद (द्रव का प्रवाह और उपयोगकर्ता द्वारा चुना समय अंतराल के आधार पर)।
    1. अधिग्रहीत छवियों बेहतर डाटा प्रोसेसिंग के लिए (पृष्ठभूमि घटाव, "आधार-कतरन" 21 या छवि 22,23 ओवरलैपिंग सहित) पूर्व प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है तो सबसे पहले, निर्धारित करते हैं।
    2. तब सहसंबंध खिड़की के आकार और आकार, के रूप में अच्छी तरह से की ओवरलैपिंग छवियों का प्रतिशत का चयन करें। एक विस्तृत अध्ययन पिट्स एट अल द्वारा किया गया था। 24 खून के लिए इष्टतम मानकों और छवि पूर्व प्रसंस्करण तकनीकों का निर्धारण करने के लिएअलग चैनल विन्यास में प्रवाह। 100 छवि जोड़े और वेग में रूट मीन स्क्वायर (आरएमएस) त्रुटि से गणना की एक औसत वेग क्षेत्र के रूप में परिणाम व्यक्त करें।
  8. चित्रा 7 में दिखाया गया है। संसाधित डेटा से, चैनल आउटलेट पर एक वेग प्रोफाइल निकालने एक बेहतर प्रोफाइल के लिए, अंतरिक्ष में वेग क्षेत्र औसत।
    नोट: वेग प्रोफाइल रचना सलाखों चैनल चौड़ाई के सापेक्ष चुना सहसंबंध खिड़की के आकार के अनुरूप हैं। वेग में आरएमएस त्रुटि भी प्रयोगात्मक वेग आकलन में त्रुटि का प्रतिनिधित्व 7 चित्र में दिखाया गया है।
  9. सभी मापन और प्रसंस्करण प्रदर्शन कर रहे हैं एक बार लेजर बंद करें ,. सॉफ्टवेयर, कैमरा, चलती मंच, कंप्यूटर और लेजर: सभी प्रणाली के घटकों को बंद कर दें।
  10. कतरनी दर की गणना करने के लिए, पहली बार पता लगाने और उच्च गति कैमरा रिकॉर्डिंग के आधार पर microchannel में रक्त मोटाई का अनुमान है। इस प्रयोजन के लिए, सभी औसतविशिष्ट रिकॉर्डिंग में फ्रेम वीडियो की एक पृष्ठभूमि छवि प्राप्त करने के लिए। (5%, 10% और 15% हेमाटोक्रिट पर निलंबित कर दिया जब 10 μl / घंटा पर बह आरबीसी निलंबन के लिए 8 चित्रा में दिखाया गया है) रक्त परत परिसीमित। इसी रक्त परत मोटाई के लिए वेग मूल्य प्राप्त करें और रक्त परत मोटाई द्वारा वेग मूल्य विभाजित करके कतरनी दर की गणना।

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Representative Results

डबल वाई-microchannel में दो-द्रव का प्रवाह का एक उदाहरण 5%, 10% और 15% हेमाटोक्रिट पर निलंबित कर दिया और 10 μl / घंटा पर बह मानव लाल रक्त कोशिकाओं के लिए चित्रा 2 में दिखाया गया है। 3 चित्रा कुल आकार जब में अंतर से पता चलता है चैनल में प्रवाह 10% की एक हेमाटोक्रिट के लिए 5 μl / घंटा के लिए 10 μl / घंटा से कम है। हेमाटोक्रिट और कतरनी दर अलग-अलग है जब यह समुच्चय के आकार के एक गुणात्मक धारणा देता है। लगातार तीन फ्रेम के लिए, 5 चार मानव आरबीसी समुच्चय के विस्थापन का अनुसरण करता चित्रा कैमरे के फ्रेम दर की जरूरत है और गुणात्मक धारणा के एक गुणात्मक उपाय प्रदान प्रत्येक फ्रेम के भीतर वितरण समुच्चय। मध्यम समुच्चय क्रमश हरे और लाल रंग में दिखाया जाता है और बड़े समुच्चय (अधिक से अधिक 30 लाल रक्त कोशिकाओं) का अनुमान (9-30 लेकर लाल रक्त कोशिकाओं) का अनुमान है, जबकि चित्रा 5 में, (8 या उससे कम का अनुमान लाल रक्त कोशिकाओं के साथ) छोटे समुच्चय, नीले रंग में दिखाया गया है।

7 चित्रा, में प्रदर्शित कर रहे हैं क्रमशः। यह भी एक आरबीसी निलंबन के लिए 7 चित्रा में प्रदर्शित वेग के आरएमएस त्रुटियों, वेग माप की शुद्धता का संकेत है, वेग मूल्यों की तुलना में अपेक्षाकृत छोटे हैं, और इसलिए दरों कतरनी। इंटरफ़ेस स्थान 'ई' के रूप में चिह्नित है और एक ही आकृति में ठोस लाइनों के रूप में दिखाया जाता है।

(वेग प्रोफाइल और रक्त परत मोटाई के आधार पर) अलग आरबीसी निलंबन के लिए इसी कतरनी दरों तालिका 1 में दिखाया जाता है। आरबीसी निलंबन से प्रत्येक के लिए निर्धारित औसत कुल आकार, पता लगाने के लिए छवि प्रसंस्करण पद्धति पर आधारित आरबीसी समुच्चय के क्षेत्र, एक funct के रूप में, 9 चित्रा में दिखाए जाते हैंइसी कतरनी दर के आयन। प्रत्येक कुल भीतर लाल रक्त कोशिकाओं का प्रतिशत के वितरण का एक उदाहरण चित्रा 6 में दिखाया गया है। कुल आकार समुच्चय में आरबीसी की अनुमानित संख्या के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं।

चित्र 1
1. डबल वाई-microchannel के विन्यास और प्रवेश तरल पदार्थ चित्रा। पीबीएस क्यू = 8 μl / घंटा में दूसरी शाखा में प्रवेश करती है, जबकि रक्त क्यू = 2 μl / घंटा में पहली शाखा में प्रवेश करती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 अलग हेमाटोक्रिट पर मानव आरबीसी निलंबन। आंकड़ा पर क्यू = 10 μl / घंटा पर बह मानव आरबीसी निलंबन के तख्ते पर कब्जा कर लिया प्रतिनिधित्व करता है (ए) 5% (बी)10% और (सी) 15% हेमाटोक्रिट। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. विभिन्न flowrates पर मानव आरबीसी निलंबन। आंकड़ा (ए) क्यू = 10 μl / घंटा और (बी) क्यू = 5 μl / घंटा बह रही 10% हेमाटोक्रिट ज में निलंबित मानव लाल रक्त कोशिकाओं के तख्ते पर कब्जा कर लिया प्रतिनिधित्व करता है। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 4
कुल का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया इमेज प्रोसेसिंग प्रोग्राम के चित्रा 4. फ्लो चार्ट। इस्तेमाल किया बुनियादी पद्धति का वर्णन दिखाया कदम। छवि की गुणवत्ता सी होने के लिए बढ़ाया है एक द्विआधारी छवि को onverted। समुच्चय पता लगाया है और उनके संबंधित आकार के आधार पर चिह्नित कर रहे हैं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. आरजीबी रंग और कई मानव आरबीसी का शुद्ध गति लगातार तीन फ्रेम के लिए समुच्चय। आंकड़ा चार (ए) = 0 टी मिसे, (बी) टी = 60 मिसे में लगातार तीन फ्रेम में पता चला समुच्चय और का शुद्ध गति से पता चलता है (सी) टी = 120 मिसे। बड़े समुच्चय (> 30 लाल रक्त कोशिकाओं का अनुमान), मध्यम समुच्चय (9-30 अनुमान के अनुसार लाल रक्त कोशिकाओं) और छोटे समुच्चय (<8 लाल रक्त कोशिकाओं का अनुमान), लाल, हरे और नीले रंग क्रमशः में दिखाए जाते हैं। पता चला समुच्चय में से प्रत्येक एक काले रंग चक्र के साथ चिह्नित कर रहे हैं।"_blank> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
विभिन्न प्रवाह दरों के लिए 10% एच आरबीसी निलंबन के लिए 6 चित्रा आरबीसी कुल आकार वितरण। 10% ज में निलंबित रक्त के नमूने लिए कुल आकार वितरण, = 10 और 5 μl / घंटा क्यू पर बह रही है। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े की।

चित्रा 7
अलग हेमाटोक्रिट के लिए 7 चित्रा वेग प्रोफाइल तुलना। वेग प्रोफाइल के लिए 5% एच (लाल), 10% एच (नीला), 15% एच (हरा) और सिमुलेशन 19 (ठोस लाइन) पर निलंबित कर दिया प्लाज्मा में लाल रक्त कोशिकाओं के लिए दिखाए जाते हैं एक क्यू = 10 μl / घंटा के साथ 120 x 60 माइक्रोन डबल वाई-microchannel। इंटरफ़ेस स्थान के लिए ई द्वारा निरूपित किया जाता हैप्रयोगों। अलग वेग प्रोफाइल की इसी आरएमएस त्रुटियों को प्रदर्शित कर रहे हैं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
रक्त परत मोटाई के विभिन्न आरबीसी, निलंबन और परिसीमन के लिए 8 चित्रा छवि पृष्ठभूमि। आंकड़ा 10 μl में बह रही आरबीसी निलंबन के खून परत मोटाई के परिसीमन से पता चलता है / घंटा (ए) 5%, (बी पर निलंबित ) 10% और (सी) 15% एच यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

9 चित्रा
Figu9 रहे हैं। इसी कतरनी दरों के एक समारोह के रूप में औसत कुल आकार। परिणामों 5% (ए), 10% (बी) और 15% एच (सी) में क्यू = 10 μl / घंटा पर बह रही विभिन्न आरबीसी निलंबन के लिए प्राप्त कर रहे हैं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Hematocrit दर प्रवाह (μl / घंटा) कतरनी दर (एसईसी -1)
5% 10 11.02
5% 5 5.36
10% 10 8.17
10% 5 4.47
15% 10 7.41
15% 5 2.51

विभिन्न रक्त के प्रवाह के मामलों के लिए तालिका 1. कतरनी दर मूल्यों। कतरनी दर मूल्यों क्यू = 10 μl / घंटा पर बह रही है, 5%, 10% और 15% एच के साथ अलग आरबीसी निलंबन के लिए μPIV डेटा और छवि प्रसंस्करण परिणामों का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं और क्यू = 5 μl / घंटा।

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Discussion

वर्तमान पद्धति का प्रयोग, यह गुणात्मक विश्लेषण करने के लिए संभव है और मात्रात्मक आरबीसी अलग प्रवाह की स्थिति और hematocrits तहत समुच्चय। सफल परीक्षण और कुल का पता लगाने के लिए, यह microchannel के प्रवेश पर दो तरल पदार्थ के बीच उचित वेग अनुपात निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस अनुपात वेग प्रोफाइल 19 अर्ध रैखिक है, जहां एक इष्टतम रक्त परत मोटाई प्राप्त करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है।

सफल परीक्षण के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण कारक एक अच्छी छवि गुणवत्ता है। विधि छवि प्रसंस्करण पर आधारित है, क्योंकि वास्तव में, यह छवि पृष्ठभूमि (चैनल के अंदर तरल पदार्थ) और पता लगाया जा कणों के बीच एक विपरीत पास करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। आंकड़े 2 और 3 के रूप में दिखाया यहाँ, कणों कुल का पता लगाने में मदद करता है जो पृष्ठभूमि, अधिक गहरा हो दिखाई देते हैं। इमेज प्रोसेसिंग तकनीक के लिए विचार करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर टी हैhreshold मूल्य। इसलिए, इसके विपरीत पर आधारित यह चित्रा 5 में दिखाया गया के रूप में सभी समुच्चय को ध्यान में रखा जाएगा जहां इष्टतम दहलीज मूल्य का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है प्राप्त की। इस अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता उपस्थित छवि विभाजन, व्यापक रूप से सेल का पता लगाने और गिनती के लिए प्रयोग किया जाता है वांछित है और एक वैश्विक दहलीज मूल्य उचित नहीं है के रूप में छवि की गुणवत्ता नहीं है, तो 25- 27।, ऐसे ही एक Otsu की विधि 28 या एक अनुकूली thresholding विधि (छवि discretizing और के रूप में इष्टतम दहलीज मूल्य निर्धारित करने के लिए एक अलग कलन विधि का उपयोग कर सकते हैं ) प्रत्येक discretized खिड़की के लिए एक स्थानीय सीमा से प्राप्त करने के।

खाते में लेने के लिए एक और पहलू है माइक्रोन के लिए पिक्सल से एक उचित रूपांतरण के लिए पैमाने कारक है।

उचित रूपांतरण कारक का उपयोग करना, एक व्यास और कुल आकार वितरण निर्धारित करने के लिए की सेवा करेंगे कि एक आरबीसी की मोटाई निर्धारित कर सकते हैं (अनुमानित कट्टरपंथी घुड़दौड़ का घोड़ा पर आधारितप्रत्येक कुल में लाल रक्त कोशिकाओं की आर)। समुच्चय के उन्मुखीकरण पर निर्भर करता है, ठीक से एक आरबीसी (ललाट या साइड देखें) पर क्षेत्र की गणना। धारा 4 (चरण 4.4.1) में उल्लेख किया है, यह समुच्चय के गतिशील गुण प्रत्येक लगातार फ्रेम के बीच कब्जा कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए उचित कैमरा जोखिम समय और फ्रेम दर निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह मान माप प्राप्त करते थे जब प्रवाह की दर के आधार पर की जाती है। कई अन्य कारकों μPIV प्रणाली का उपयोग कर परिणाम प्राप्त करने के लिए जब ध्यान में रखा जाना चाहिए और पिट्स और Fenech 20 के अध्ययन में स्पष्ट रूप से चर्चा कर रहे हैं।

कार्यप्रणाली अलग हेमाटोक्रिट में बह रही कई आरबीसी निलंबन पर सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया था। हालांकि, इमेज प्रोसेसिंग तकनीक और छवि पृष्ठभूमि और समुच्चय के बीच इसके विपरीत की कमी की वजह से सीमा के लिए, यह आरबीसी (20% से 45% तक) उच्च hematocrits के लिए समुच्चय का पता लगाने के लिए मुश्किल है। दरअसल के रूप में उल्लेख किया हैइससे पहले, छवि गुणवत्ता इस पद्धति के लिए महत्वपूर्ण है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, आरबीसी कुल आकार एक नियंत्रित microfluidic युक्ति में मापा जा सकता है और इसलिए यह शारीरिक कतरनी दरों की एक सीमा के लिए आरबीसी कुल आकार microcirculation में गतिशील आरबीसी एकत्रीकरण के बारे में जानकारी प्राप्त करने और प्राप्त करने के लिए संभव है। यह रक्त rheology के संख्यात्मक और प्रायोगिक अध्ययन के पूरक हैं और नैदानिक ​​और रोग के अध्ययन के लिए कुल आकार और व्यवहार से संबंधित भी संभव है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम के प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल द्वारा समर्थित किया गया। Microfabrication मैकगिल विश्वविद्यालय में मैकगिल Nanotools MicroFab सुविधा और कार्लटन विश्वविद्यालय में इलेक्ट्रानिक्स विभाग के सहयोग से किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SU8-50 epoxy based negative Photo-resist MicroChem Corp.
SU8-50 developer MicroChem Corp.
Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184 Dow-Corning 3097358-1004
PE-50 series Plasma system  Plasma Etch PE-50 series
Blood collection tubes with K2-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) FisherSci B367861
Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 Thermo Scientific 004260F
Poshpate buffered saline (PBS) Sigma Aldrich P5368-10PAK
Tracer fluorescent particles solution (15 ml) FisherSci R800
Aggregometer RheoMeditech Rheo Scan AnD300
Glass syringes (50 µl) Hamilton 80965
Tubing (Tygon) FisherSci AAA00001
High speed camera (Basler) Graftek Imaging Inc. basler acA2000-340km A camera capable of recording 18 frames per second could be used.
Double pulsed camera  LaVision Imager Intense
Microscope MITAS LaVision MITAS
Nd:YAG laser New Wave Research Solo-II
Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus) Chemyx Inc. and Harvard Apparatus Nexus3000 and PicoPlus
DaVis software LaVision Davis

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References

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Tags

बायोइन्जिनियरिंग अंक 100 लाल रक्त कोशिकाओं एकत्रीकरण microcirculation में microfluidics सूक्ष्म कण छवि velocimetry रक्त rheology

Erratum

Formal Correction: Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation
Posted by JoVE Editors on 11/30/2015. Citeable Link.

An erratum was issue for Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation. The introduction section was updated.

The introduction was updated from:

Few studies have attempted to study RBC aggregation and determine the degree of aggregation in controlled flow conditions15-17. However, these studies indirectly investigate RBC aggregate sizes by determining the ratio of the occupied space in a shearing system measured based on microscopic blood images providing information on the degree of aggregation as well as the local viscosity.

We therefore present a new procedure to directly quantify RBC aggregates in microcirculation, dynamically, under controlled and constant shear rates. RBC-suspensions are entrained, in a double Y-microchannel (as illustrated in Figure 1), with a Phosphate Buffered Saline (PBS) solution hence creating a shear flow in the blood layer. Within this blood layer a constant shear rate can be obtained. The RBC-suspensions are tested at different hematocrit (H) levels (5%, 10% and 15%) and under different shear rates (2-11 sec-1). The blood velocity and shear rate are determined using a micro Particle Image Velocimetry (µPIV) system while the flow is visualized using a high speed camera. The results obtained are then processed with a MATLAB code based on the image intensities in order to detect the RBCs and determine aggregate sizes.

to:

Few studies have attempted to study RBC aggregation and determine the degree of aggregation in controlled flow conditions15-17. However, these studies indirectly investigate RBC aggregate sizes by determining the ratio of the occupied space in a shearing system measured based on microscopic blood images providing information on the degree of aggregation as well as the local viscosity. Chen et al.18 presented a direct measurement technique for RBC aggregate sizes and provided RBC aggregate size distribution for different shear stresses by varying the flowrate of the suspensions while monitoring the pressure drop across a flow chamber. The shear stresses are calculated based on the monitored pressure using Stokes equation18.

We therefore present a new procedure to directly quantify RBC aggregates in a controlled microfluidic environment, dynamically, under specific, constant and measurable shear rates. The blood flow in the shear system is directly observed (perpendicularly to the flow direction), providing a different angle on flow investigation compared to previous studies15,18 and a visualization of the full domain of interest. RBC-suspensions are entrained, in a double Y-microchannel (as illustrated in Figure 1), with a Phosphate Buffered Saline (PBS) solution hence creating a shear flow in the blood layer. Within this blood layer a constant shear rate can be obtained. The RBC-suspensions are tested at different hematocrit (H) levels (5%, 10% and 15%) and under different shear rates (2-11 sec-1). The blood velocity and shear rate are determined using a micro Particle Image Velocimetry (µPIV) system while the flow is visualized using a high speed camera. The results obtained are then processed with a MATLAB code based on the image intensities in order to detect the RBCs and determine aggregate sizes.

Reference 18 was updated to:

18. Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14, (4), 497-508 (1994).

All subsequent citations were also updated.

लाल रक्त कोशिका एकत्रीकरण के गतिशील जांच के लिए नियंत्रित Microfluidic पर्यावरण
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Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. … More

Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation. J. Vis. Exp. (100), e52719, doi:10.3791/52719 (2015).

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