ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
protokol görüntü işleme tekniklerine dayanan, detay kontrollü ve sürekli kayma hızı altında Eritrosit (RBC) agrega ölçmek için deneysel bir prosedür tarif. Bu protokolün amacı, kontrollü bir mikroakışkan bir ortamda gelen kayma oranı RBC agrega boyutları ilişkilendirmek olduğunu.
Abstract
Kan, bir Newtonian olmayan biyo-sıvı olarak, Hemorheology alanında birçok çalışmalar odağı temsil eder. Kan bileşenleri, kırmızı kan hücreleri, kan plazması içinde süspansiyon haline getirilmiş olan, beyaz kan hücreleri ve trombositler bulunmaktadır. Nedeniyle eritrosit bolluğu (kan hacminin% 40 ila 45%), onların davranışları, özellikle mikrosirkülasyondaki kanın reolojik davranışını belirler. Çok düşük kesme hızlarında, eritrositler monte görülmektedir ve form kişiler kan Newtonian olmayan davranışa neden olan agrega denir. Bu mikrosirkülasyondaki kan reolojisini kavrayabilme agrega oluşum koşullarını anlamak çok önemlidir. Burada açıklanan protokol görüntü işleme dayalı, sürekli kayma hızı altında kantitatif mikrosirkülasyonda RBC büyüklüklerinin belirlenmesi deneysel prosedür ayrıntıları. Bu amaçla, RBC-süspansiyonlar test edilmiş ve 120 x 60 mm poli-dimetil-siloksan (PDMS) mikrokanallar analiz. RBC-süspansiyonlar ent vardırKan katmanı içinde bir doğrusal hız profilini elde etmek ve böylelikle sabit bir kesme oranları geniş bir aralığını elde etmek için, ikinci bir sıvı ile yağmur. RBC agrega yüksek hızlı bir kamera kullanılarak görüntülendi sırasında kesme hızı, mikro görüntüleme ölçümleri (μPIV) sistemi kullanılarak belirlenir. RBC agrega çekilen videoları görüntüleri şiddetleri dayalı toplam boyutlarını belirlemek amacıyla görüntü işleme teknikleri kullanılarak analiz edilmektedir.
Introduction
Kırmızı kan hücreleri (eritrositler) kanın reolojik davranışlarını belirleyen çok önemli bir rol oynamaktadır. Neredeyse tek başına, in vitro ve in vivo olarak kan belli özelliklere sorumludur. Fizyolojik koşullar altında, eritrositler kan hacminin% 40 45% işgal. Mikrosirkülasyondaki, eritrositler nedeniyle sadece küçük damar çapları ve etkisi 1 kaymağını plazmaya kan hacminin% 20 kadar işgal. Mikrosirkülasyon plazma azalma Bu olgu Fåhræus etkisi olarak bilinir. Düşük kesme hızlarında, RBC bu nedenle kan Newtonian olmayan davranışlar katkıda birlikte köprü ve "Rouleaux" ya da agregalar olarak adlandırılan tek boyutlu veya üç boyutlu yapıları oluşturmak mümkündür. Bununla birlikte, rbc toplanması mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir. İki teori eritrosit agregasyonunu model vardır: Hücreler teorisinin köprüleme nedeniyle makromoleküllerin 2 çapraz bağlanması ve kuvvet attrac içintion teorisi nedeniyle osmotik gradyan 3 moleküllerin tükenmesi neden oldu.
Tipik haliyle, insan kanı, agrega 1 ila 10 saniye -1 kadar çok düşük kesme oranlarında 4 de oluşturur. Bu aralığın üstünde, RBCs bölmekte ve damar içinde ayrı akış eğilimindedir.
Agrega oluşum koşullarını anlamak kanın reolojik davranışını tanımlayan açısından Hemorheology alanına büyük önem taşımaktadır. Bu agregalar genellikle makrodolaşım düzeyde (> 300 um çapında) 5 görülür. Bu ölçekte, kan, bir Newton tipi sıvı ve homojen bir karışım olarak kabul edilir. Bununla birlikte, bu agregaların nadir kılcal seviyesi (çapı 4-10 um) görülür ve genellikle diyabet 6 ve obezite gibi patolojik durumların bir göstergesidir. Rbc toplanması enflamatuar veya enfeksiyon durumları içerir değiştirebilir diğer patolojik durumlar,hipertansiyon veya ateroskleroz, genetik bozukluklar ve kronik hastalıklar 7 kardiyovasküler hastalıklar. Bu nedenle, RBC toplama mekanizmasının anlaşılması ve (bu agrega ve akış koşullarının büyüklüğü arasında bir ilişki tanımlayarak) bu varlıkları analiz kanın microrheological davranışının anlaşılmasına yol açabilir ve dolayısıyla klinik uygulamalara bunu ilgilidir.
RBC agregaları gibi hematokrit (kanda eritrositler hacmi), kayma hızı, damar çapı, RBC membran sertlik ve süspansiyon ortamı bileşim 8-10 gibi çeşitli faktörler tarafından değiştirilebilir. Bu nedenle, kontrollü şartlar etkin RBC agrega analiz etmek için gereklidir. Çeşitli yöntemler kan davranışları hakkında gerekli bilgileri sunuyor statik toplama ölçümleri (toplama indeksi) sağlayarak toplam oluşumunu analiz edebiliyoruz. Bu yöntemler, diğerlerinin yanı sıra, eritrosit sedimantasyon hızı dahilyöntem 11 ışık geçirgenliği yöntemi 12, ışık yansıma yöntemi 13 ve düşük kayma viskozitesi yöntemi 14.
Birkaç çalışma RBC toplanmasını çalışma ve kontrollü akış şartlarında 15-17 toplulaştırma derecesini belirlemek için çalışmışlardır. Ancak bu çalışmalar dolaylı olarak toplama derecesi yanı sıra yerel viskozite ilgili bilgi veren mikroskobik kan görüntülerde dayalı ölçülen kesme sisteminde işgal alanı oranını belirleyerek RBC toplam boyutlarını araştırmak.
Bu nedenle doğrudan RBC kontrollü ve sürekli kayma oranlarının altında, dinamik, mikrosirkülasyonda agrega ölçmek için yeni bir prosedür mevcut. Bir fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi bu nedenle, kan tabakasında bir kesme akışı oluşturma, (Şekil 1 'de gösterildiği gibi) RBC-süspansiyonlar iki Y mikrokanaldaki, sürüklenir. Bu kan içinde sabit Shea katmanr oranı elde edilebilir. RBC-süspansiyonlar farklı hematokrit (H) düzeyleri (% 5,% 10 ve% 15) ve farklı kesme hızlarında (2-11 sn -1) altında test edilmiştir. Kan hızı ve kesme hızı akışı yüksek hızlı kamera ile görüntülenmiştir ise mikro Parçacık Görüntü Akımları (μPIV) sistemi kullanılarak belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar daha sonra eritrositlerde tespit ve toplam boyutlarını belirlemek için görüntü şiddetleri göre MATLAB kodu ile işlenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kan Ottawa Üniversitesi (H11-13-06) etik kurul onayı ile sağlıklı bireylerden tahsil edilir.
1. Microchannel Fabrikasyon
Mikrokanallar standart fotolitografi yöntemleri 18 dayalı üretilmektedir.
- Bilgisayar Destekli Tasarım (CAD) yazılımı kullanılarak mikrokanal geometrisi Tasarım ve şeffaflık foto maske yapılandırmayı yazdırın. Onlar fabrikasyon sürecinde ışık yolu dikte beri bu maskeler çok önemlidir. Bu durumda, mikrokanal boyutları derinlemesine kalınlığı 120 um, 60 um ve uzunluğu 7 mm.
- Bir temiz oda, sıkma kaplama epoksi negatif göre arzu edilen mikro derinliği (60 um) elde etmek için 30 saniye boyunca 2000 rpm'de bir silikon foto-karşı dirençlidir.
- Gofret ve 650 mJ / 70 sn cm 2 bir UV lamba altında fotoğraf maskesi Açığa. Sadece saydam alanlar açığa olunUV-ışık fotoğraf maskesi. saydam alanların maruz bir sertleşmesiyle elde edilen zincirleri polimerizasyonu için bir foto-karşı dirençlidir. Fazlalığını ortadan kaldırmak için bir geliştirici içine silikon parçası daldırın fotoğrafın-direnmek.
- Poli-dimetil-siloksan (PDMS) ihtiva eden bir çözelti oluşturmak için 1: kalıp imal edildikten sonra, 10 arasında bir oranda bir silikon bazlı elastomer ve bir sertleştirme ajanı karıştırılır. Gaz çıkışına bir vakum odasına PDMS çözeltisi koyun. Kalıp içine dökün ve 90 dakika mikrokanallar oluşturmak için, 60 ° C'de ısıtın. Daha sonra 90 saniye boyunca oksijen plazma bağlaması kullanılarak cam bir slayta, bireysel kanallar bağ.
NOT: PDMS gazını proses karıştırma işlemi yol açtığı hava kabarcıklarını yok etmek için yapılmıştır. - Mikrokanal boyutları başarılı test için izin emin olun. Bu protokol, mikrokanallar 120 x 60 mm, dikdörtgen bir enine kesite sahiptir. Buna karşılık, bir ortalama eritrosit 8 um bir çapa ve 2 um arasında bir kalınlığa sahiptir.refore, mikrokanal genişliği uygun toplanmasını gözlemlemek ve doğru bir hız profillerinin belirlenmesi için yeterlidir.
2. Kan hazırlanması
- Bir etik kurul onayından sonra, sağlıklı gönüllü vericilerden kan toplayın. Toplama tüpleri içinde mevcut etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile kan (kanın 4 ml 7.2 mg EDTA) tedavi edin.
NOT: EDTA kan pıhtılaşma önlemek için kullanılır. - Kan bileşenleri ayırmak üzere 1,400 xg (3,000 rpm) kan örnekleri 10 dakika boyunca üç kez santrifüjleyin. Santrifüj sonucu olarak, üç farklı tabaka dikkate alınmalıdır.
Not: üç kat (borunun alt kısmında bulunur) RBC tabaka (RBC tabakanın üstünde yer alan, beyaz kan hücreleri ve trombositler oluşan) ince beyaz tabaka ve plazma tabakası (diğer üst kısmında bulunan bileşenler).- İlk Santrifüj işleminden sonra, kan bir pipet kullanarak kan plazması toplanır. Herhangi c kaçınınBuffy ceket ile ontact.
- Toplayın ve% 10 sulandırılmış çamaşır suyu ile bir kapta buffy coat atmayın.
- Kalan RBC tabakası ile tüplerin her PBS pH 7.4 içinde 3 ml ilave edilir ve santrifüjün uygun bir dengenin sağlanması. Yavaşça 10 dakika boyunca 1.400 xg (3000 rpm) yine tüpleri ve santrifüj karıştırın.
NOT: Onlar hücre yapışmasını değiştirebilir beri PBS solüsyonu herhangi Magnezyum veya Kalsiyum içermediğinden emin olun. - İkinci santrifüj sonrası tüplerde PBS atınız ve varsa kalan buffy coat çıkarın. Tekrarlayın üçüncü santrifüj temiz eritrositlerde elde etmek için 2.2.3 ve 2.2.4 numaralı adımları.
- Tekabül eden (% 5 RBC-süspansiyonlar elde etmek için% 10 ve% 15 1 ml bir tüp içinde plazma (0.95, 0.9 ve 0.85 mi) temiz eritrositlerde gerekli miktar (0.05, 0.1 ve 0.15 ml) karıştırın ) hematokrit. Bir mikrosantrifüj ile hematokrite edin.
3. Sıvılar Hazırlık
- Floresan izleyici partikülleri solüsyonu 60 ul ekleyin (% 1 katı, d parçacık = 0. 86 mikron, λ = 542 nm abs ve 1 ml RBC-Süspansiyon tüplere λ emisyon = 612 nm).
NOT: (dahili polistiren tanecikleri boyalı) floresan izleyici parçacıkları mikrokanalın içinde akış hızını ölçmek için kullanılır. Lazer ışınının (λ = 542 nm), karşılık gelen dalga boyuna maruz kaldığında bu parçacıklar floresan. - PBS pH 7.4 çözeltisi hazırlayın ve PBS çözeltisi 1 ml aynı floresanlı işaretleyici partikülleri solüsyonu 60 ul ekle.
4. Agrega Boyut Ölçümleri
- Mikrokanalda sıvıları (RBC-süspansiyonlar ve PBS) eklemek için, 25 ul ve 100 ul iki cam şırınga kullanın. Bu iradeSistemin uygunluğu azaltmaya yardımcı olur. Tüp ve giriş delikleri montaj konnektörleri yoluyla şırınga mikrokanalı bağlayın. Sıvı haznesi ve şırınga arasında varolan basınç farkı kullanılarak cam şırıngalar doldurun. Hava kabarcığı sisteminde mevcut olduğundan emin olun. Alternatif bir yöntem olarak, mikrokanal hem de sıvı sürmek için bir basınç kontrol sistemi kullanır.
- Yüksek hızlı kamera ve μPIV sistemine bağlı bir ters mikroskop sahnede mikrokanalı yerleştirin. Programı (PBS Q = 8 ul / saatlik bir akış hızı sokarken kan örneğin, Q = 2 ul / saat) arzu edilen akış oranları şırınga pompası.
NOT: Sadece bir şırınga pompası kullanılır. Iki farklı iç çaplara sahip iki farklı cam şırınga kullanılarak, Y-mikrokanalın her dalı giren akış oranına değiştirmek mümkündür. - Gösterildiği gibi farklı bir giriş şubesi ve farklı akış oranlarında çift Y-mikrokanalda hem sıvıları her takın
NOT: oranı kan tabakası içinde doğrusal hız profili elde önemlidir. - Yüksek hızlı kamera kullanarak eritrositlerde gözünüzde canlandırın. Sıvı akışının görüntülerini kontrol, kayıt ve kaydetmek için bir bilgisayara bağlayın. İki sıvı akar kararlı duruma ulaştıktan sonra, kaydetmeye başlayın.
- Daha iyi sonuçlar için işlem birkaç görüntü elde edin. Agrega net görüntü için optimal bir kameranın açıklık süresi belirler.
NOT: Bu durumda kamera pozlama süresi 0,5 milisaniye idi. Her çerçeve arasındaki zaman aralığının seçimi kamera çerçeve hızı ve t debisine dayanmaktadırO mikrokanal. Bu prosedürde işlenen her çerçeve arasındaki süre 60 msn idi. Bu nedenle, saniyede 18 kare kayıt yapabilen bir kamera yeterlidir.
NOT: Hatalı ölçümlere yol açabilecek tüp ve şırınga, kan oturmasını kaçının.
- Daha iyi sonuçlar için işlem birkaç görüntü elde edin. Agrega net görüntü için optimal bir kameranın açıklık süresi belirler.
- Görüntü işleme teknikleri (bu durumda MATLAB programı) kullanılarak aşağıdaki gibi (Şekil 4'te gösterilen) piksel yoğunlukları göre görüntülerin her agregatlar saptandı, görüntü kalitesini iyileştirmek için:
- Görüntüleri her kare için daha iyi bir görüntü kalitesi elde etmek histogram ekolayzır yöntemini kullanarak kontrast geliştirin.
- Ikili görüntülere gri tonlama görüntüleri dönüştürün. Bu amaç için, her bir piksel dönüşümünü belirler 0-1 arasında değişen bir eşik değerini, ayarlayın. Eşik daha büyük değerlere sahip pikseller beyaz piksel olarak tespit edilecek süre eşik değerin altında görüntüdeki herhangi bir piksel, siyah bir piksel olarak algılanacaktır.
- DoldurmakDaha iyi sonuçlar için, bir bütün içinde boşluklara tekabül eden delikler (bulunan ve gerekirse).
- Komşu hücreler agregatlar halinde ilişkili olan, böylece ikili görüntüdeki komşu beyaz pikseller belirleyerek hücreleri algılar.
- Algılandı farklı agrega Etiket ve daha iyi görüntülenmesi için bir kırmızı-yeşil-mavi (RGB) görüntü içine ikili görüntü dönüştürmek. Görüntü işleme tekniğinin etkinliğini doğrulamak ve Şekil 5'te gösterildiği gibi tüm hücreleri dikkate alınmasını sağlamak için gelen işlenmiş görüntülerin her orijinal kare birleştirin. Gerçekleştirin adımlar 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 Yakalanan tüm çerçeveler için, 4.5.4 ve 4.5.5.
- Tespit edilen piksel sayısına göre çerçeve içinde algılanan her bir agreganın alanını hesaplar. Kullanılan mercek büyütme dayanarak, bir kalibrasyon retiküle kullanarak, dönüşüm faktörünü hesaplamak ve um 2 sonuçları dönüştürmek. Her bir tespit agrega boyutları ortalamaÇerçeve ve sonra RBC-süspansiyonlar her kayıt için ortalama agrega boyutu elde etmek için tüm karelerin sonuçları ortalama.
- Algılanan her agreganın içinde eritrosit temsilcisi tahmini sayısını belirlemek için tek RBC alanını hesaplayın. Şekil 6'da gösterildiği gibi, bu sonuçlar kullanılarak, (her bir agrega hücre tahmini sayısı ile temsil edilen) toplu boyutlarda bir fonksiyonu olarak her agreganın olan eritrosit yüzdesi dağılımını hesaplar.
NOT: RBC agrega ölçmek için, ImageJ yazılımı her karede aynı görevleri gerçekleştirmek için (yerine MATLAB) kullanılabilir.
5. Sıvı Hız ve Kayma Hızı Ölçümleri
Akışkan hızı ve μPIV sistemini kullanarak dolayısıyla kayma oranını belirlemek.
- Veri, yüksek hızlı kamera kullanılarak elde edilir sonra, μPIV sistemi için kullanılan çift darbeli kameraya geçin. Görüntü ac için bir görüntüleme yazılımı kullanınhız alanı belirlenmesi için akış ve görüntü işleme edinirken.
- Lazer açmadan önce, lazer sınıfına bağlı olarak, tüm önlemler gerekli atın. Sonra sistemde, kamera ve lazer açın.
- Kullanılan mercek büyütme dayalı kamerayı ayarlayın. Bu amaçla, bir mikroskop altında 10 um hassas bir bir Mikro kullanımı ve görüntüde 1 piksel boyutunu ayarlamak.
- Lazer başlatın ve her iki sıvılarında parçacıkları görselleştirmek. Akımında hızlı parçacıkların odaklanarak mikrokanalın orta düzlemi bul (yani, en hızlı parçacıklar parlak olmalıdır).
- Parçacığın düzgün deplasman sağlamak için dt (iki ardışık kareler arasındaki zaman aralığı) ayarlayın. En hızlı parçacıklar her iki görüntü arasında yaklaşık 5 ila 10 piksel taşımak gerekir.
- Akış kaydetmeye başlayın. Görüntülerin 100 çift, ayrı 5 milisaniye kazanmak için yazılımı ayarlayın. Tüm dif için adımları 5.4, 5.5 ve 5.6 gerçekleştirinferent RBC-süspansiyonlar ve farklı kayma oranları için.
NOT: metodoloji Daha fazla bilgi Pitts ve Fenech 20 çalışmasında verilmiştir. - Görüntüleme yazılımı ile çapraz korelasyon yöntemi kullanılarak elde edilen kayıtları işleyin.
NOT: Bu önceden belirlenen büyüklükteki küçük pencereler halinde görüntülerin çifti kesikli oluşur denilen korelasyon pencere ve her pencerede partiküllerin deplasman aşağıdaki gibidir (sıvı akışı ve kullanıcı tarafından seçilen zaman aralığına göre).- Edinilen görüntüler daha iyi veri işleme (arka plan çıkarma, "baz kırpma" 21 veya görüntü 22,23 örtüşen dahil) ön işleme ihtiyaç Öncelikle belirlemek.
- Daha sonra korelasyon pencere boyutu ve şekli, hem de bir üst üste binen görüntülerin yüzdesi seçin. Detaylı bir çalışma Pitts ve arkadaşları tarafından yapıldı. 24 kan için optimum parametreleri ve görüntü ön işleme teknikleri belirlemek içinfarklı kanal yapılandırmalarında akış. 100 görüntü çiftleri ve hızının Root Mean Square (RMS) hata hesaplanan ortalama hız alanı olarak sonuçları ifade eder.
- Şekil 7 'de gösterildiği gibi. Işlenmiş verileri kanal çıkışındaki bir hız profilini ekstrakte daha iyi bir profil için, boşluk hız alanı ortalama.
NOT: hız profili oluşturan çubuklar kanal genişliği göre seçilen korelasyon pencere boyutuna karşılık gelmektedir. Hız RMS hata, deney hızı tahmini hata temsil Şekil 7'de gösterilmektedir. - Tüm ölçümleri ve işleme yapılmaktadır kez lazer kapatın ,. Yazılım, kameralar, hareketli sahne, bilgisayar ve lazer: Tüm sistemin bileşenlerini kapatın.
- Kayma oranını hesaplamak için, ilk olarak algılamak ve yüksek hızlı kamera kayıt dayalı mikrokanaldaki kan kalınlığını tahmin ediyoruz. Bu amaçla, tüm ortalamaBelirli kayıt çerçeveler videonun bir arka plan görüntüsü elde etmek. (% 5,% 10 ve% 15 hematokrit asılı olduğunda 10 ul / sa oranında akan bir RBC-süspansiyonlar için, Şekil 8'de gösterildiği gibi), kan tabakası sınırlandırmak. İlgili kan tabaka kalınlığı için hız değerini elde ve kan tabaka kalınlığı ile hız değeri bölerek kesme oranını hesaplamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çift-Y-mikrokanal içinde iki sıvı akımının bir örneği,% 5,% 10 ve% 15 hematokrit ile süspanse edildi ve 10 ul / sa oranında akan bir insan eritrositlerde, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Şekil 3, toplam boyutları ne zaman farkı göstermektedir kanalda akış% 10 Hematokrit için 5 ul / saat için 10 ul / saat arasında azaltılır. Hematokrit ve kesme hızı değişen bu agrega boyutlarının niteliksel kavramını verir., Üst üste üç çerçeveler için, 5 dört insan RBC agrega yerinden takip Şekil kamera kare hızı gereklidir ve niteliksel kavramının niteliksel bir ölçü sağlayan Her çerçeve içinde dağılımını toplar. Orta agregalar, sırasıyla yeşil ve kırmızı ile gösterilmiştir ve büyük agregalar (30'dan daha büyük eritrositlerde tahmini) (9-30 kadar eritrositlerde tahmin edilen) ise Şekil 5 (8 ya da daha az tahmini eritrositlerde) ile, küçük agregatlar, mavi ile gösterilmiştir.
Şekil 7'de gösterildi sırasıyla. Ayrıca, her RBC-süspansiyon için Şekil 7'de gösterilen hız RMS hataları, hız ölçümlerinin hassasiyetini belirten hızı değerleri ile karşılaştırıldığında nispeten küçüktür ve bu nedenle düşük makaslama. arayüz yerleri 'E' olarak gösterilir ve aynı şekilde düz çizgiler olarak gösterilmiştir.
(hız profilleri ve kan tabaka kalınlığına göre) farklı bir RBC-süspansiyonlar için uygun kesme hızları, Tablo 1 'de gösterilmiştir. RBC-süspansiyonların her biri için belirlenen ortalama agrega boyutları tespit etmek için bir görüntü işleme yöntemine göre RBC agregatların alanı, bir fonksiyonu olarak, Şekil 9'da gösterilmektedirkarşılık gelen kesme oranı iyon. Her bir agrega olan eritrosit yüzdesi dağılımın bir örneği Şekil 6'da gösterilmektedir. Agrega boyutları agregalardaki RBC tahmini sayısı olarak temsil edilir.
1. Çift Y-mikrokanal yapılandırma ve giriş sıvıları Şekil. PBS Q = 8 ul / hr ikinci şubesini girerken kan Q = 2 ul / saat ilk şubesini girer. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Farklı hematokrit İnsan RBC-süspansiyon. Figür Q = 10 ul / saat akan insan RBC-süspansiyon Yakalanan çerçeveleri temsil (A)% 5 (B)% 10 ve (C)% 15 hematokrit. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Farklı akış oranlarında İnsan RBC-süspansiyon. Şekil (A) Q = 10 ul / saat ve (B) Q = 5 ul / saat akan% 10 hematokrit H askıya insan eritrositlerde Yakalanan çerçeveleri temsil eder. tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.
Agrega tespiti için kullanılan görüntü işleme programı Şekil 4. Akış çizelgesi. Kullanılan temel metodoloji tarif gösterilen adımlar. Görüntü kalitesi c olması geliştirilmiştir bir ikili görüntü onverted. agregalar algılanır ve kendi boyutlarına göre işaretlenmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. RGB renk ve birkaç insan RBC net hareketi üç ardışık çerçeveler için toplanır. Şekil dört (A) t = 0 ms, (B), t = 60 ms üç ardışık çerçeve tespit agrega ve net hareketini göstermektedir (C), t = 120 msn. Büyük agrega (> 30 eritrositlerde tahmini), orta agrega (9-30 tahmini eritrositler) ve küçük agrega (<8 eritrositlerde tahmini), kırmızı, yeşil ve mavi sırasıyla gösterilmiştir. Tespit edilen agrega her siyah bir daire ile işaretlenir."_blank> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Farklı akış oranları için% 10 H RBC-süspansiyon Şekil 6. RBC toplam boyut dağılımı.% 10 H askıya kan örnekleri için Agrega boyut dağılımı, = 10 ve 5 ul / saat Q akan. büyük halini görmek için tıklayınız Bu rakamın.
Farklı hematokrit Şekil 7. Hız profili karşılaştırması. Hız profilleri için% 5 H (Kırmızı),% 10 H (mavi),% 15 H (yeşil) ve simülasyon 19 (düz çizgi) asılı plazma içinde eritrositler için gösterilmiştir Q = 10 ul / saat ile 120 x 60 mm çift Y-mikrokanal. arayüz yeri için E ile gösterilirdeneyler. Farklı hız profillerinin gelen RMS hatalar görüntülenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Kan tabaka kalınlığının farklı RBC-süspansiyonlar ve sınırlandırılması için Şekil 8. Görüntü arka plan. Şekil 10 ul akan RBC-süspansiyonlar kan tabakası kalınlığı sınırlandırmasını gösterir / saat (A)% 5, (B askıya )% 10 ve (C)% 15, H. , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Figu9 Yeniden. İlgili kesme oranları bir fonksiyonu olarak ortalama agrega boyutları. Sonuçlar% 5 (A),% 10 (B) ve% 15 H (C) Q = 10 ul / saat akan farklı RBC-süspansiyonlar için elde edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Hematokrit | Akış oranı (ul / saat) | Kayma hızı (sn -1) |
| % 5 | 10 | 11.02 |
| % 5 | 5 | 5.36 |
| % 10 | 10 | 8.17 |
| % 10 | 5 | 4.47 |
| % 15 | 10 | 7.41 |
| % 15 | 5 | 2.51 |
Farklı kan akımı durumlar için Tablo 1. Kayma hızı değerleri. Kayma hızı değerleri Q = 10 ul / saat akan,% 5,% 10 ve% 15 H ile farklı RBC-süspansiyonlar için μPIV veri ve görüntü işleme sonuçları kullanılarak elde edilir ve Q = 5 ul / saat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut metodoloji kullanarak, niteliksel analiz etmek mümkündür ve kantitatif RBC farklı akış koşulları ve hematokrit altında toplanır. Başarılı test ve agrega tespiti için, mikro girişinde iki akışkanlar arasında uygun hız oranını belirlemek için çok önemlidir. Bu oran, hız profili 19 yarı lineer bir optimal kan tabaka kalınlığının elde edilmesi için çok önemlidir.
Başarılı test için bir başka önemli faktör iyi bir görüntü kalitesi. Yöntem görüntü işleme dayanmaktadır beri Aslında, bu görüntü arka (kanal içinde sıvı) ve tespit edilecek parçacıklar arasında bir kontrast olması çok önemlidir. Şekiller 2 ve 3'te gösterildiği gibi, burada, tanecikler, toplam saptanmasında yardımcı olur arka plan, daha koyu görünmektedir. görüntü işleme tekniği için dikkat edilmesi gereken en önemli parametre threshold değer. Bu nedenle, tersine göre, Şekil 5'te gösterildiği gibi, tüm gruplar, dikkate alınacak uygun eşik değerini seçmek için çok önemlidir elde edilmiştir. Bu çalışma için kullanılan mevcut olan görüntü ayrıştırması, yaygın olarak, hücre tespiti ve sayımı için kullanılan İstediğiniz ve küresel eşik değeri uygun değil gibi görüntü kalitesi değilse 25- 27., böyle bir Otsu yöntemi 28 veya uyarlanabilir bir eşik yöntemine (görüntü kesikli ve optimal eşik değerini belirlemek için farklı bir algoritma kullanabilirsiniz ) her discretized pencere için yerel bir eşik elde edilir.
Dikkate alınması gereken bir diğer faktör um piksel uygun bir dönüşüm için ölçek faktörüdür.
Uygun dönüşüm faktörü kullanılarak, tek çap ve agrega boyutu dağılımını belirlemek için görev yapacak biri RBC kalınlığını belirleyebilirsiniz (tahmini numbe dayalıHer toplu eritrosit r). Agrega yönüne bağlı olarak, düzgün biri RBC (frontal ya da yan görünüm) bölgeyi hesaplar. Bölüm 4 (adım 4.4.1) 'de belirtildiği gibi, agrega dinamik özellikleri her ardışık çerçeve arasında yakalanır sağlamak için uygun kamera pozlama süresini ve kare hızını belirlemek için önemlidir. Bu değer ölçümleri satın alırken kullanılan akış hızına dayanmaktadır. Çeşitli diğer faktörler μPIV sistemi kullanılarak sonuçlar elde dikkate alınması gerekmektedir ve Pitts ve Fenech 20 çalışmada açık bir şekilde ele alınmaktadır.
metodoloji farklı hematokrit akan birkaç RBC-süspansiyonlar başarıyla test edildi. Ancak, görüntü işleme tekniği ve görüntü arka planı ve agrega arasındaki kontrast eksikliği sınırlaması nedeniyle, RBC (% 20 den% 45) daha yüksek hematokrit agregatlar tespit etmek zordur. Nitekim olarak bahsedilmektedirDaha önce, görüntü kalitesi bu metodolojinin için çok önemlidir.
Bu protokol kullanılarak, RBC agrega boyutları kontrollü mikroakışkan cihaz ölçülebilir ve bu nedenle fizyolojik kesme oranlarında bir dizi için eritrosit yığın ebatları mikrosirkülasyonda dinamik rbc toplanması ile ilgili bilgi elde etmek ve elde etmek mümkündür. Kan reolojisinin sayısal ve deneysel çalışmaları tamamlayıcı ve klinik ve patolojik çalışmalar agrega boyutları ve davranışlarını ilişkilendirmek mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu eser Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir. Mikroüretim McGill Üniversitesi'nde McGill nanoTools MICROFAB imkan ve Carleton Üniversitesi Elektronik Bölümü desteğiyle gerçekleştirildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU8-50 epoxy based negative Photo-resist | MicroChem Corp. | ||
| SU8-50 developer | MicroChem Corp. | ||
| Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184 | Dow-Corning | 3097358-1004 | |
| PE-50 series Plasma system | Plasma Etch | PE-50 series | |
| Blood collection tubes with K2-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | FisherSci | B367861 | |
| Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 | Thermo Scientific | 004260F | |
| Poshpate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Tracer fluorescent particles solution (15 ml) | FisherSci | R800 | |
| Aggregometer | RheoMeditech | Rheo Scan AnD300 | |
| Glass syringes (50 µl) | Hamilton | 80965 | |
| Tubing (Tygon) | FisherSci | AAA00001 | |
| High speed camera (Basler) | Graftek Imaging Inc. | basler acA2000-340km | A camera capable of recording 18 frames per second could be used. |
| Double pulsed camera | LaVision | Imager Intense | |
| Microscope MITAS | LaVision | MITAS | |
| Nd:YAG laser | New Wave Research | Solo-II | |
| Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus) | Chemyx Inc. and Harvard Apparatus | Nexus3000 and PicoPlus | |
| DaVis software | LaVision | Davis |
References
- Perkkio, J., Keskinen, R. Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming. Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).
- Chien, S., Jan, K. Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation. Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).
- Neu, B., Meiselman, H. J. Depletion-mediated red blood cell aggregation in polymer solutions. Biophys. J. 83 (5), 2482-2490 (2002).
- Schmid-Schönbein, H., Gaehtgens, P., Hirsch, H. On the shear rate dependence of red cell aggregation in vitro. J. Clin. Invest. 47 (6), 1447-1454 (1968).
- Pries, A. R., Secomb, W. Rheology of the microcirculation. Clin. Hemorheol. Microcirc. 29 (3-4), 143-148 (2003).
- Baskurt, O. K., Neu, B., Meiselman, H. J. Red Blood Cell Aggregation. , Taylor and Francis. Florida. (2011).
- Cho, Y. I., Mooney, M. P., Cho, D. J. Hemorheological disorders in diabetes mellitus. J. Diabetes Sci. Technol. 2 (6), 1130-1138 (2008).
- Baskurt, O. K., Hardeman, M. R., Rampling, M. W., Meiselman, H. J. Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. , IOS Press. Netherlands. (2007).
- Lindqvist, T. The viscosity of the blood in narrow capillary tubes. Am. J. Physiol.-Legacy Content. 96, 562-568 (1931).
- Goldsmith, H. L., Cokelet, G. R., Gaehtgens, P. R. Fåhraeus: Evolution of his concepts in cardiovascular physiology. Am. J. Physiol. 257 (3), H1005-H1015 (1989).
- Fåhraeus, R. The suspension stability of the blood. Physiol. Rev. 9 (2), 241-274 (1929).
- Bauersachs, R. M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J. Determination of specific red blood cell aggregation indices via an automated system. Clin. Hemorheol. 9 (1), 1-25 (1989).
- Hardeman, M. R., Dobbe, J. G., Ince, C. The laser-assisted optical rotational cell analyzer (lorca) as red blood cell aggregometer. Clin. Hemorheol. Microcirc. 25 (1), 1-11 (2001).
- Rampling, M. W. Red cell aggregation and yield stress. Clinical Blood Rheology. , CRC Press. Boca Raton, Florida. (1988).
- Dusting, J., Kaliviotis, E., Balabani, S., Yianneskis, M. Coupled human erythrocyte velocity field and aggregation measurements at physiological haematocrit levels. J. Biomech. 42 (10), 1438-1443 (2009).
- Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity: modelling using shear fields measured by a µPIV based technique. Med. Eng. Phys. 33 (7), 824-831 (2011).
- Sherwood, J. M., Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity and velocity distributions of aggregating and non-aggregating blood in a bifurcating microchannel. Biomech. Model. Mechan. 13 (2), 259-273 (2014).
- Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14 (4), 497-508 (1994).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie International Edition England. , 551-577 (1998).
- Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Design of a microfluidic system for red blood cell aggregation investigation. J. Biomech. Eng. 136 (6), 064501-1-064501-5 (2014).
- Pitts, K. L., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry for velocity profile measurements of micro blood flows. J. Vis. Exp. (74), e50314 (2013).
- Bitsch, L., Oleson, L. H., Westergaard, C. H., Bruus, H., Klank, H., Kutter, J. P. Micro particle-image velocimetry of bead suspensions and blood flows. Exp. Fluids. 39 (3), 507-513 (2005).
- Wereley, S. T., Gui, L., Meinhart, C. D. Advanced algorithms for microscale particle image velocimetry. AIAA J. 40 (6), 1047-1105 (2002).
- Nguyen, C. V., Fouras, A., Carberry, J. Improvement of measurement accuracy in micro PIV by image overlapping. Exp. Fluids. 49 (3), 701-712 (2010).
- Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods. Meas. Sci. Technol. 23 (10), 105302 (2012).
- Bhamare, M. G., Patil, D. S. Automatic blood cell analysis by using digital image processing: a preliminary study. Int. J. Eng. Res. Tech. 2 (9), 3135-3141 (2013).
- Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform. Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).
- Jambhekar, N. D. Red blood cells classification using image processing. Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
Tags
Biyomühendislik Sayı 100 Kırmızı kan hücreleri toplama mikrosirkülasyon Mikroakiskan mikro parçacık görüntü velosimetri kan rheologyErratum
Formal Correction: Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation
Posted by JoVE Editors on 11/30/2015.
Citeable Link.
An erratum was issue for Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation. The introduction section was updated.
The introduction was updated from:
Few studies have attempted to study RBC aggregation and determine the degree of aggregation in controlled flow conditions15-17. However, these studies indirectly investigate RBC aggregate sizes by determining the ratio of the occupied space in a shearing system measured based on microscopic blood images providing information on the degree of aggregation as well as the local viscosity.
We therefore present a new procedure to directly quantify RBC aggregates in microcirculation, dynamically, under controlled and constant shear rates. RBC-suspensions are entrained, in a double Y-microchannel (as illustrated in Figure 1), with a Phosphate Buffered Saline (PBS) solution hence creating a shear flow in the blood layer. Within this blood layer a constant shear rate can be obtained. The RBC-suspensions are tested at different hematocrit (H) levels (5%, 10% and 15%) and under different shear rates (2-11 sec-1). The blood velocity and shear rate are determined using a micro Particle Image Velocimetry (µPIV) system while the flow is visualized using a high speed camera. The results obtained are then processed with a MATLAB code based on the image intensities in order to detect the RBCs and determine aggregate sizes.
to:
Few studies have attempted to study RBC aggregation and determine the degree of aggregation in controlled flow conditions15-17. However, these studies indirectly investigate RBC aggregate sizes by determining the ratio of the occupied space in a shearing system measured based on microscopic blood images providing information on the degree of aggregation as well as the local viscosity. Chen et al.18 presented a direct measurement technique for RBC aggregate sizes and provided RBC aggregate size distribution for different shear stresses by varying the flowrate of the suspensions while monitoring the pressure drop across a flow chamber. The shear stresses are calculated based on the monitored pressure using Stokes equation18.
We therefore present a new procedure to directly quantify RBC aggregates in a controlled microfluidic environment, dynamically, under specific, constant and measurable shear rates. The blood flow in the shear system is directly observed (perpendicularly to the flow direction), providing a different angle on flow investigation compared to previous studies15,18 and a visualization of the full domain of interest. RBC-suspensions are entrained, in a double Y-microchannel (as illustrated in Figure 1), with a Phosphate Buffered Saline (PBS) solution hence creating a shear flow in the blood layer. Within this blood layer a constant shear rate can be obtained. The RBC-suspensions are tested at different hematocrit (H) levels (5%, 10% and 15%) and under different shear rates (2-11 sec-1). The blood velocity and shear rate are determined using a micro Particle Image Velocimetry (µPIV) system while the flow is visualized using a high speed camera. The results obtained are then processed with a MATLAB code based on the image intensities in order to detect the RBCs and determine aggregate sizes.
Reference 18 was updated to:
18. Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14, (4), 497-508 (1994).
All subsequent citations were also updated.
