Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Контролируемая Микрожидкостных Окружающая среда для динамического исследования эритроцитов агрегации

Published: June 4, 2015 doi: 10.3791/52719
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Mechanical Engineering, University of Ottawa

ERRATUM NOTICE

Summary

Протокол, описанный подробности экспериментальную процедуру количественного Красный клеток крови (эритроцитов) агрегаты в контролируемой и постоянной скоростью сдвига, на основе методов обработки изображений. Целью данного протокола является отношение RBC размеры агрегатные к соответствующей скорости сдвига в контролируемой среде микрожидком.

Abstract

Кровь, как неньютоновской биожидкости, представляет собой фокус многочисленных исследований в области гемореологии. Компонентов крови включают красные кровяные клетки, белые кровяные клетки и тромбоциты, которые взвешенных в плазме крови. Из-за обилия эритроцитов (от 40% до 45% от объема крови), их поведение диктует реологические свойства крови, особенно в микроциркуляции. При очень низких скоростях сдвига, эритроциты видел, чтобы собрать и форма лица называется агрегатов, что приводит к неньютоновской поведение крови. Важно понять условия формирования агрегатов понять реологические свойства крови в микроциркуляции. Протокол, описанный здесь подробно экспериментальную процедуру, чтобы определить количественно агрегатов эритроцитов в микроциркуляции под постоянной скорости сдвига, на основе обработки изображений. Для этой цели RBC-суспензии испытаны и проанализированы в 120 х 60 мкм поли-диметил-силоксан (PDMS) микроканалов. РБК-суспензий ЛОРдождь с использованием второй текучей среды, чтобы получить линейный профиль скорости в слое крови и, таким образом, достичь широкого спектра постоянных скоростях сдвига. Скорость сдвига определяется с помощью микро Velocimetry Particle Image (μPIV) системы, в то время как РБК агрегаты визуализированы с помощью высокоскоростной камеры. В видеозаписи, сделанные из агрегатов эритроцитов проанализированы с использованием методов обработки изображений, чтобы определить совокупные размеры, основанные на интенсивности изображений.

Introduction

Красные клетки крови (эритроцитов) играют решающую роль в определении реологические свойства крови. Они почти сингулярно ответственность за особых свойств крови в пробирке и в естественных условиях. В физиологических условиях, эритроциты занимают от 40% до 45% от объема крови. В микроциркуляции, только БС занимать до 20% объема крови за счет меньшего диаметра сосудов и плазме скользя эффекта 1. Это явление снижения плазмы в микроциркуляции известно как эффект Fåhræus. При низких скоростях сдвига, эритроциты способны преодолеть вместе и образуют одномерное или трехмерные структуры, называемые "неустойчивых агрегатов эритроцитов" или агрегаты, следовательно, вносит свой вклад в неньютоновской поведение крови. Тем не менее, механизм агрегации эритроцитов не полностью изучены. Две теории существуют для моделирования агрегацию эритроцитов: мостиковых теории клеток из-за сшивки макромолекул 2 и сила привлеТеория ние вызвано истощение молекул в результате осмотическому градиенту 3.

Как правило, для человеческой крови, агрегаты образуются при очень низких скоростях сдвига 4 в пределах от 1 до 10 с -1. Выше этого диапазона, эритроциты, как правило, дезагрегации и потока отдельно в сосуде.

Понимание условий образования агрегатов имеет большое значение для области гемореологии с точки зрения определения реологических свойств крови;. Эти агрегаты часто видели на уровне макроциркуляционного (> диаметром 300 мкм) 5. В этом масштабе, кровь считается ньютоновской жидкости и однородной смеси. Тем не менее, эти агрегаты редко можно увидеть в капиллярном уровне (4-10 мкм в диаметре) и, как правило, свидетельствует о патологических состояний, таких как диабет и ожирение 6. Другие патологические состояния, которые могут изменить агрегации РБК включают воспалительные или инфекционные условия,сердечно-сосудистые заболевания, такие как гипертония или атеросклероз, генетических нарушений и хронических заболеваний. 7 Таким образом, понимая, что механизм агрегации эритроцитов и анализа этих объектов (путем определения отношения между размером этих агрегатов и условий потока) может привести к пониманию микрореологических поведения крови и, следовательно, отношение его к клинической практике.

RBC агрегаты могут быть изменены с помощью нескольких факторов, таких как гематокрита (объема эритроцитов в крови), скорость сдвига, диаметра сосуда, в жесткости мембраны эритроцитов и суспендирующей среды состава 8-10. Таким образом, контролируемые условия необходимы для того, чтобы эффективно анализировать агрегаты РБК. Некоторые методы способны анализировать совокупную образование путем предоставления статических измерений агрегации (индекс агрегации), который предлагает соответствующую информацию о поведении крови. Эти методы включают в себя, в частности, скорость оседания эритроцитовМетод 11, способ передачи света 12, метод отражения света 13 и 14 Способ вязкость низкой скорости сдвига.

Несколько исследований пытались изучать агрегацию эритроцитов и определить степень агрегации в контролируемых условиях потока 15-17. Тем не менее, эти исследования косвенно исследовать РБК совокупные размеры, определяя отношение занятого пространства в системе сдвига измеряется на основе микроскопических изображений, обеспечивающих крови информацию о степени агрегации, а также местного вязкости.

Поэтому мы представляем новую процедуру непосредственно количественно РБК агрегатов микроциркуляции, динамично, в контролируемых и постоянных скоростях сдвига. RBC-суспензии увлекаются, в двойной Y-микроканала (как показано на рисунке 1), с фосфатным буферным солевым раствором (PBS), решение, следовательно, создания сдвигового течения в слое крови. В этой крови слой постоянный Шиаг ставка может быть получена. В RBC-суспензии тестировали при различной гематокрита (H) уровней (5%, 10% и 15%) и при различных скоростях сдвига (2-11 сек -1). Скорость крови и скорость сдвига определяется с использованием микро Velocimetry частиц изображения (μPIV) системы, а поток визуализировали с использованием высокоскоростной камеры. Полученные результаты затем обрабатываются с помощью кода MATLAB на основе интенсивности изображения для обнаружения БС и определять совокупные размеры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Кровь собирают от здоровых лиц с одобрения комитета по этике Университета Оттавы (H11-13-06).

1. Изготовление Микроканальные

В микроканалы изготовлены на основе стандартных методов фотолитографии 18.

  1. Дизайн геометрию микроканального используя дизайн программного обеспечения системы автоматизированного (CAD) и распечатать конфигурацию на прозрачности фото-маски. Эти маски имеют решающее значение, так как они определяют путь света во время процесса изготовления. В этом случае размеры микроканалов 120 мкм в толщину, 60 мкм по глубине и длиной 7 мм.
  2. В чистом помещении, спина покрытие на основе эпоксидной смолы отрицательное фоторезиста на кремниевой пластине при 2000 оборотах в минуту в течение 30 сек, чтобы получить желаемую глубину микроканальной (60 мкм).
  3. Expose пластины и фото-маску под УФ-лампой в 650 мДж / см 2 в течение 70 сек. Убедитесь, чтобы выставить только прозрачные областифото-маска с УФ-света. Экспозиции прозрачных областей позволяет полимеризации цепей, в результате ужесточения фото-сопротивляться. Погрузитесь кремния кусок в разработчика для удаления избытка фото-сопротивляться.
  4. После пресс-формы изготавливают, смешать эластомера на основе кремния и отвердитель в соотношении 10: 1, чтобы создать раствор поли-диметил-силоксан (PDMS). Поместите решение PDMS в вакуумной камере для дегазации. Налейте его в форму и нагревают его при 60 ° С в течение 90 мин для создания микроканалов. Затем связать отдельные каналы в стекле с помощью плазменного связывания кислорода в течение 90 сек.
    Примечание: процесс дегазации PDMS выполняется для того, чтобы устранить пузырьки воздуха, порождаемые в процессе смешивания.
  5. Убедитесь, что размеры микроканальные позволяют для успешного тестирования. В этом протоколе, микроканалы имеют прямоугольное поперечное сечение 120 х 60 мкм. Для сравнения, в среднем эритроцитов имеет диаметр 8 мкм и толщину 2 мкм.refore, ширина микроканальный достаточно заметить, надлежащее агрегирование и точно определить профили скорости.

2. Подготовка крови

  1. Собрать кровь от здоровых доноров-добровольцев, после утверждения комитетом по этике. Рассматривать кровь с этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), присутствующих в пробирок (7,2 мг EDTA в 4 мл крови).
    ПРИМЕЧАНИЕ: ЭДТА используется, чтобы избежать свертывания крови.
  2. Центрифуга образцов крови три раза в течение 10 мин при 1400 х г (3000 оборотов в минуту) для того, чтобы отделить компоненты крови. В результате центрифугирования, наблюдается три отдельных слоя.
    Примечание: три слоя слой эритроцитов (расположен в нижней части трубки), лейкоцитарную пленку (состоящая из белых клеток крови и тромбоцитов, расположенных в верхней части слоя RBC) и плазменный слой (расположено в верхней части всех других составляющие).
    1. После первого центрифугирования собирают плазму крови с помощью пипетки в крови. Избегайте Cонтакт с лейкоцитарной пленки.
    2. Сбор и распоряжаться кровяного сгустка в контейнер с хлорной разбавленной на 10%.
    3. Добавьте 3 мл PBS, рН 7,4 с каждой из трубок с оставшейся RBC слое и обеспечить надлежащий баланс центрифуги. Тщательно перемешать в пробирки и центрифугируют снова при 1400 х г (3000 оборотов в минуту) в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что решение PBS, не содержит магний или кальций, так как они могут изменить клеточную адгезию.
    4. Утилизацию PBS в трубах после второго центрифугирования и удаления оставшейся поглощающее покрытие, если присутствует. Повторите шаги 2.2.3 и 2.2.4 для третьей центрифугирования с получением чистых эритроцитов.
  3. Смешайте необходимое количество (0,05, 0,1 и 0,15 мл) чистого эритроцитов с плазмой (0,95, 0,9 и 0,85 мл) в 1 мл пробирку, чтобы получить RBC-суспензий с соответствующей (5%, 10% и 15% ) гематокрита. Проверьте гематокрита с микроцентрифуге.

3. Жидкости Подготовка

  1. Добавить 60 мкл раствора флуоресцентного трассирующие частиц (1% твердого вещества, д частиц = 0. 86 мкм, λ = 542 абс нм и λ эмиссии = 612 нм) в 1 мл РБК-подвески труб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: люминесцентные частицы трассирующими (внутри окрашенные частицы полистирола) используются для измерения скорости потока в микроканальных. Эти частицы флуоресцируют при воздействии соответствующей длине волны лазерного луча (λ = 542 нм).
  2. Готовят раствор PBS, рН 7,4 и добавляют 60 мкл той же флуоресцентной раствора трассирующие частиц в 1 мл раствора PBS.

4. Агрегаты Размер Измерения

  1. Чтобы вставить жидкостей (РБК-суспензий и PBS) в микроканале, используйте две стеклянные шприцы 25 мкл и 100 мкл. Это будетпомочь уменьшить соответствие системы. Подключите микроканал в шприцах с помощью труб и соединителей, установленных входных отверстий. Заполните стеклянные шприцы с использованием разности давлений, существующей между контейнером для жидкости и шприца. Убедитесь, никаких пузырей не присутствуют в системе. В качестве альтернативного способа, используют систему регулируемым давлением для привода обоих жидкостей в микроканала.
  2. Поместите микроканал на перевернутой столике микроскопа, соединенного с высокой скоростью и камеры системы μPIV. Программа шприцевой насос с требуемыми расходами (например, Q = 2 мкл / ч в течение крови порождая расхода Q = 8 мкл / ч для PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Только один шприцевой насос используется. Использование двух различных стеклянные шприцы, с двумя различными внутренними диаметрами, можно варьировать расходу поступающей каждую ветвь Y-микроканала.
  3. Вставьте оба жидкостей в двойной Y-микроканале каждый из другой ветви входа и на разных скоростях потока, как показано на 19 (фиг.2 и 3). Подождите потока для достижения устойчивого состояния до приобретения измерения: осмотрите изображения с камеры высокой скорости для плавного потока.
    Примечание: Отношение имеет решающее значение в получении линейный профиль скорости в слое крови.
  4. Представьте БС, используя высокоскоростной камеры. Подключите камеру к компьютеру для контроля, записи и сохранения изображений потока жидкости. После того, как два жидкость течет достичь устойчивого состояния, начать запись.
    1. Приобретать несколько изображений для улучшения результатов обработки. Определить оптимальное время экспозиции камеры для получения четкого изображения агрегатов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: время экспозиции камеры в этом случае составляет 0,5 мс. Выбор временного интервала между кадрами на основе частоты кадров камеры и скорости потока в тон микроканале. Время между каждым кадром обработанной в этой процедуре было 60 мсек. Поэтому камера способна записывать 18 кадров в секунду достаточно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте оседание крови в пробирку и шприц, которые могли бы привести к ошибочным измерениям.
  5. Использование методов обработки изображений (программы MATLAB в данном случае), чтобы улучшить качество изображения, обнаруживать агрегатов в каждом из изображений на основе интенсивности пикселей (показанных на рисунке 4) следующим образом:
    1. Повышение контраста изображения с помощью метода гистограмм эквалайзера, чтобы получить лучшее качество изображения для каждого кадра.
    2. Преобразование полутоновых изображений в бинарных изображений. С этой целью установить пороговое значение в диапазоне от 0 до 1, который диктует преобразование каждого пикселя. Любой пиксель в изображении ниже порогового значения будет обнаружен как черный пиксель, а пиксели со значениями больше, чем пороговое будет обнаружен как белых пикселей.
    3. Заполнитеотверстия (если присутствует и необходимо), соответствующие пробелы в один агрегат для лучших результатов.
    4. Обнаружение клеток путем определения соседних белых пикселей в бинарном изображении так, что соседние ячейки связаны в виде агрегатов.
    5. Этикетка различных агрегатов обнаружены и преобразовать двоичный файл в красный-зеленый-синий (RGB) изображения для лучшей визуализации. Зерноуборочные оригинальные кадры с каждой из соответствующих обработанных изображений, чтобы проверить эффективность методики обработки изображений и убедиться, что все клетки учитывать, как показано на рисунке 5. Выполните шаги 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 , 4.5.4 и 4.5.5 для всех кадров, захваченных.
    6. Вычислить площадь каждого агрегата, обнаруженного в кадре на основе количества пикселов, обнаруженных. На основании увеличения линзы, используемой, вычислить коэффициент преобразования, используя калибровочную сумочку, и преобразовывать результаты в мкм 2. Нормальное совокупные размеры обнаруженных в каждойрамка, а затем усреднить результаты для всех кадров, чтобы получить среднюю совокупную размер для каждой записи РБК-суспензий.
    7. Вычислить площадь одной РБК определения репрезентативной предполагаемое количество эритроцитов в каждой обнаруженной совокупности. Используя эти результаты, вычислить распределение процент эритроцитов в каждой совокупности в зависимости от совокупных размеров (представленных на предполагаемое количество клеток в каждой совокупности), как показано на рисунке 6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения агрегаты РБК, программное обеспечение ImageJ можно использовать (вместо MATLAB) для выполнения тех же задач на каждом кадре.

5. скорость жидкости и скорость сдвига Измерения

Определить скорость жидкости и, следовательно, скорость сдвига, используя систему μPIV.

  1. После того, как данные приобретенных с использованием высокой скорости камеру, переключиться на двойной импульсной камеры, используемой для системы μPIV. Используйте программное обеспечение для обработки изображений изображения переменного токаприобрете- потока и обработки изображений для определения поля скоростей.
  2. Принимать все меры предосторожности необходимости, в зависимости от класса лазера, перед включением лазера. Затем включите систему, камеры и лазера.
  3. Калибровка камеры на основе увеличения объектива используется. Для этого используйте микромасштаб точностью 10 мкм под микроскопом и установить размер 1 пиксель в изображении.
  4. Начните лазер и визуализировать частицы в обоих жидкостей. Найти среднюю плоскость микроканале, сосредоточив внимание на самых частиц в потоке (т.е., самые быстрые частицы должны быть яркая).
  5. Установите DT (интервал времени между двумя последовательными кадрами), чтобы обеспечить надлежащее смещение частицы. Самые быстрые частицы должны двигаться от 5 до 10 пикселей между двумя изображениями.
  6. Начало записи потока. Установите программное обеспечение на приобретение 100 пар изображений, 5 мс друг от друга. Выполните шаги 5.4, 5.5 и 5.6 для всех дифных РБК-суспензии и для различных скоростях сдвига.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробная информация о методологии приведены в исследовании Питтс и Фенек 20.
  7. Процесс записей, полученных с помощью метода кросс-корреляции с программным обеспечением обработки изображений.
    Примечание: Этот состоит из дискретизации пары изображений на небольшие окна заданного размера (в расчете на поток текучей среды и временного интервала, выбранного пользователем) под названием корреляции окна и вслед за смещением частиц в каждом окне.
    1. Во-первых, определить, если изображения, полученные требуют предварительной обработки (в том числе вычитание фона, "базовой" отсечения 21 или перекрывающихся изображений 22,23) для лучшего обработки данных.
    2. Затем выберите размер корреляция окна и форму, а также процентного изображений перекрывающихся. Детальное изучение проводили Питтс и др. 24, чтобы определить оптимальные параметры и методы изображения предварительной обработки для кровитечь в разных конфигураций каналов. Экспресс результаты в виде среднего поля скорости, рассчитанной от пар 100 изображений и Root Mean Square (RMS) ошибка в скорости.
  8. Извлечение профиль скорости на выходе канала, из обработанных данных, как показано на фиг.7. Для лучшего профиль, в среднем поле скоростей в пространстве.
    Примечание: Полосы, образующие профиль скоростей соответствуют размеру окна корреляции по отношению к выбранной ширины канала. Среднеквадратической ошибки в скорости также показано на рисунке 7, представляющий ошибку в оценке экспериментальной скорости.
  9. Выключите лазер, когда все измерения и обработки выполняются ,. Выключите все компоненты системы: программное обеспечение, камеры, движущийся этап, компьютеры и лазер.
  10. Чтобы вычислить скорость сдвига, первый обнаружить и оценить толщину крови в микроканала на основе высокоскоростной записи камеры. Для этого, в среднем всекадры в определенной записи, чтобы получить фоновое изображение на видео. Разграничить слой крови (как показано на рисунке 8 для RBC-суспензий, протекающих при 10 мкл / ч, когда приостанавливается на уровне 5%, 10% и 15% гематокрита). Получить значение скорости для соответствующего толщине слоя крови и рассчитать скорость сдвига путем деления значения скорости по толщине слоя крови.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Пример потока двух жидкости в двойной Y-микроканале показано на рисунке 2 для человека эритроцитов, взвешенных в 5%, 10% и 15% гематокрита и впадающих в 10 мкл / ч. Рисунок 3 показывает разницу в совокупных размеров, когда поток в канале снижается с 10 мкл / ч в 5 мкл / ч в течение гематокрита 10%. Это дает качественное представление о размерах агрегатов при изменении гематокрита и скорости сдвига. Рисунок 5 следует перемещение четырех агрегатов эритроцитов человека, в течение трех последовательных кадров, обеспечивая качественную меру частоты кадров камеры, необходимого и качественного понятия агрегаты распределение в пределах каждого кадра. На рисунке 5, небольшие агрегаты (с 8 или менее оценкам эритроцитов) показаны синим цветом, а средние агрегаты (от 9 до 30 оценивается БС) и крупные агрегаты (больше, чем 30 оценивается БС) показаны зеленым и красным соответственно.

рисунке 7, где красные, синие и зеленые кривые представляют профили скорости эритроцитов взвешенные в 5%, 10% и 15% гематокрита соответственно. В RMS ошибки скорости, также отображаются на рисунке 7 для каждого РБК-подвески, относительно мала по сравнению со значениями скорости, с указанием точности измерений скорости, и, следовательно, скорости сдвига. Места интерфейса обозначаются как "Е" и показали, как сплошными линиями на том же рисунке.

Соответствующие скорости сдвига для различных RBC-суспензий (на основе профилей скорости и толщины слоя крови) приведены в таблице 1. В среднем совокупные размеры определяются для каждого из RBC-суспензий, на основе способа обработки изображения для обнаружения Площадь агрегатов эритроцитов, которые показаны на рисунке 9, как функцион соответствующего скорости сдвига. Пример распределения процент эритроцитов в пределах каждой совокупности показано на фиг.6. Совокупные размеры представлены в качестве расчетного количества эритроцитов в агрегаты.

Фигура 1
Рисунок 1. Дважды конфигурации Y-микроканальный и входа жидкостей. Кровь поступает в первое отделение в Q = 2 мкл / ч в то время как PBS, входит во вторую ветвь на Q = 8 мкл / ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Человеческий РБК-подвеска на другой уровень гематокрита. Рисунок представляет захватили кадры человеческих РБК-суспензий, протекающих в Q = 10 мкл / ч при () 5% (B)10% (С) 15% гематокрита. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Человеческий РБК-подвеска на разных расходах. Рисунок представляет захватили кадры человеческих эритроцитов, взвешенных в 10% гематокрита H, протекающих (A) Q = 10 мкл / ч и (б) Q = 5 мкл / час. Пожалуйста, нажмите здесь Чтобы смотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Блок-схема программы обработки изображений, используемых для обнаружения совокупности. Шаги, показанные описывают основную методологию. Качество изображения повышается, чтобы быть с onverted в бинарном изображении. Агрегаты обнаружены и помечены на основе соответствующих размеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. RGB окраски, а чистая движение нескольких человеческого РБК агрегатов в течение трех последовательных кадров. Рисунок показывает чистый движение четырех агрегатов, обнаруженных в трех последовательных кадров на (а) Т = 0 мс, (B) T = 60 мс и (С) T = 120 мс. Большие агрегаты (> 30 оценивается БС), средние (9-30 агрегаты оценкам эритроцитов) и мелкие агрегаты (<8 оценкам эритроцитов) приведены в красный, зеленый и синий соответственно. Каждый из агрегатов, обнаруженных обозначены черным кружком._blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6. Распределение совокупного РБК размер 10% H РБК-подвески для различных скоростях потока. Распределение совокупного размера для образцов крови, взвешенных в 10% H, течет на Q = 10 и 5 мкл / час. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию из этой фигуры.

Рисунок 7
Рисунок 7. Скорость сравнение профиль для различных гематокрита. Профили скорости приведены для эритроцитов в плазме взвешенных в 5% H (красный), 10% Н (синий), 15% H (зеленый) и моделирования 19 (сплошная линия) для 120 х 60 мкм двойной Y-микроканальный с Q = 10 мкл / ч. Расположение интерфейс обозначается Е дляэксперименты. Соответствующие RMS ошибки различных профилей скорости отображаются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 8
Рисунок 8. фон изображения для различных РБК-суспензий и делимитации толщины слоя крови. Рисунок показывает делимитации толщины слоя крови РБК-суспензий, протекающих в 10 мкл / ч приостановлено в (А) 5%, (B ) 10% и (С) 15% Х. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 9
FIGURe 9. Средние совокупные размеры в зависимости от соответствующих скоростях сдвига. Результаты, полученные для различных РБК-суспензий, протекающих в Q = 10 мкл / ч в 5% (A), 10% (B) и 15% H (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Гематокрит Расход (мкл / ч) Скорость сдвига (с -1)
5% 10 11.02
5% 5 5.36
10% 10 8.17
10% 5 4.47
15% 10 7,41
15% 5 2.51

Таблица 1. Значения скорости сдвига для различных случаев кровотока. Значения скорости сдвига получают с использованием данных и результатов обработки изображений μPIV для различных РБК-суспензий с 5%, 10% и 15% H, течет на Q = 10 мкл / ч и Q = 5 мкл / час.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

С помощью настоящего методику, можно проанализировать качественно и количественно эритроцитов агрегатов при различных условиях потока и гематокрита. Для успешного тестирования и совокупного обнаружения, важно, чтобы определить соответствующий коэффициент скорости между двумя жидкостями на входе микроканальной. Это соотношение очень важно получить оптимальную толщину слоя крови, где профиль скорости квазилинейная 19.

Еще одним ключевым фактором для успешного тестирования хорошее качество изображения. В самом деле, поскольку способ основан на обработке изображения, очень важно, чтобы контраст между фоновым изображением (жидкости внутри канала), и частиц, которые будут обнаружены. Здесь, как показано на фиг.2 и 3, частицы кажутся темнее фона, который помогает в совокупном обнаружения. Наиболее важным параметром, чтобы рассмотреть для способа обработки изображения тhreshold значение. Таким образом, на основе контраста получается очень важно выбрать оптимальное пороговое значение, где все агрегаты будут учтены, как показано на рисунке 5. Настоящий сегментацию изображения, используемый в данном исследовании, широко используется для обнаружения и подсчета клеток 25- 27. Если качество изображения вас не устраивает, и глобальная пороговое значение не подходит, можно использовать другой алгоритм для определения оптимального порогового значения, такие как метод Оцу в 28 или методом адаптивной пороговой (дискретизации изображения и получения локального порога для каждого окна дискретизированной).

Другим фактором, который учитывает это масштабный коэффициент для надлежащего преобразования из пикселей в мкм.

При использовании соответствующего коэффициента преобразования, можно определить диаметр и толщину одной RBC, который будет служить для определения распределения по размерам совокупного (на основе оцененного количесг эритроцитов в каждом совокупности). В зависимости от ориентации агрегатов, правильно рассчитать площадь на одного РБК (фронтальной или вид сбоку). Как уже упоминалось в разделе 4 (этап 4.4.1), важно, чтобы определить правильное время экспозиции камеры и частоту кадров, чтобы обеспечить динамические свойства агрегатов захватили между каждой последовательной рамке. Это значение основано на расходе используемого при получении измерения. Ряд других факторов должны быть приняты во внимание при приобретении результаты, используя систему μPIV и обсуждаются четко в исследовании Питтс и Фенек 20.

Методология была успешно испытана на нескольких РБК-суспензий, протекающих при различных гематокрита. Тем не менее, из-за ограничений в технологии обработки изображения и отсутствие контраста между фоновым изображением и агрегатов, трудно обнаружить эритроцитов агрегатов для более высоких гематокрита (от 20% до 45%). Действительно, как упоминалосьранее, качество изображения имеет решающее значение для этой методологии.

Используя этот протокол, размеры совокупные RBC могут быть измерены в контролируемой микрожидком устройства и, следовательно, можно получить информацию о агрегации эритроцитов динамически микроциркуляции и получить RBC совокупные размеры для диапазона физиологических скоростях сдвига. Кроме того, можно дополнить цифровые и экспериментальные исследования реологических свойств крови и относятся агрегатные размеры и поведение в клинических и патологических исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана естественных наук и инженерного исследовательский совет Канады. Микротехнологий была выполнена при поддержке объекта МакГилл Nanotools Microfab в Университете Макгилла и кафедры электроники в Университете Карлтон.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SU8-50 epoxy based negative Photo-resist MicroChem Corp.
SU8-50 developer MicroChem Corp.
Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184 Dow-Corning 3097358-1004
PE-50 series Plasma system  Plasma Etch PE-50 series
Blood collection tubes with K2-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) FisherSci B367861
Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 Thermo Scientific 004260F
Poshpate buffered saline (PBS) Sigma Aldrich P5368-10PAK
Tracer fluorescent particles solution (15 ml) FisherSci R800
Aggregometer RheoMeditech Rheo Scan AnD300
Glass syringes (50 µl) Hamilton 80965
Tubing (Tygon) FisherSci AAA00001
High speed camera (Basler) Graftek Imaging Inc. basler acA2000-340km A camera capable of recording 18 frames per second could be used.
Double pulsed camera  LaVision Imager Intense
Microscope MITAS LaVision MITAS
Nd:YAG laser New Wave Research Solo-II
Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus) Chemyx Inc. and Harvard Apparatus Nexus3000 and PicoPlus
DaVis software LaVision Davis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkkio, J., Keskinen, R. Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming. Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).
  2. Chien, S., Jan, K. Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation. Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).
  3. Neu, B., Meiselman, H. J. Depletion-mediated red blood cell aggregation in polymer solutions. Biophys. J. 83 (5), 2482-2490 (2002).
  4. Schmid-Schönbein, H., Gaehtgens, P., Hirsch, H. On the shear rate dependence of red cell aggregation in vitro. J. Clin. Invest. 47 (6), 1447-1454 (1968).
  5. Pries, A. R., Secomb, W. Rheology of the microcirculation. Clin. Hemorheol. Microcirc. 29 (3-4), 143-148 (2003).
  6. Baskurt, O. K., Neu, B., Meiselman, H. J. Red Blood Cell Aggregation. , Taylor and Francis. Florida. (2011).
  7. Cho, Y. I., Mooney, M. P., Cho, D. J. Hemorheological disorders in diabetes mellitus. J. Diabetes Sci. Technol. 2 (6), 1130-1138 (2008).
  8. Baskurt, O. K., Hardeman, M. R., Rampling, M. W., Meiselman, H. J. Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. , IOS Press. Netherlands. (2007).
  9. Lindqvist, T. The viscosity of the blood in narrow capillary tubes. Am. J. Physiol.-Legacy Content. 96, 562-568 (1931).
  10. Goldsmith, H. L., Cokelet, G. R., Gaehtgens, P. R. Fåhraeus: Evolution of his concepts in cardiovascular physiology. Am. J. Physiol. 257 (3), H1005-H1015 (1989).
  11. Fåhraeus, R. The suspension stability of the blood. Physiol. Rev. 9 (2), 241-274 (1929).
  12. Bauersachs, R. M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J. Determination of specific red blood cell aggregation indices via an automated system. Clin. Hemorheol. 9 (1), 1-25 (1989).
  13. Hardeman, M. R., Dobbe, J. G., Ince, C. The laser-assisted optical rotational cell analyzer (lorca) as red blood cell aggregometer. Clin. Hemorheol. Microcirc. 25 (1), 1-11 (2001).
  14. Rampling, M. W. Red cell aggregation and yield stress. Clinical Blood Rheology. , CRC Press. Boca Raton, Florida. (1988).
  15. Dusting, J., Kaliviotis, E., Balabani, S., Yianneskis, M. Coupled human erythrocyte velocity field and aggregation measurements at physiological haematocrit levels. J. Biomech. 42 (10), 1438-1443 (2009).
  16. Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity: modelling using shear fields measured by a µPIV based technique. Med. Eng. Phys. 33 (7), 824-831 (2011).
  17. Sherwood, J. M., Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity and velocity distributions of aggregating and non-aggregating blood in a bifurcating microchannel. Biomech. Model. Mechan. 13 (2), 259-273 (2014).
  18. Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14 (4), 497-508 (1994).
  19. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie International Edition England. , 551-577 (1998).
  20. Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Design of a microfluidic system for red blood cell aggregation investigation. J. Biomech. Eng. 136 (6), 064501-1-064501-5 (2014).
  21. Pitts, K. L., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry for velocity profile measurements of micro blood flows. J. Vis. Exp. (74), e50314 (2013).
  22. Bitsch, L., Oleson, L. H., Westergaard, C. H., Bruus, H., Klank, H., Kutter, J. P. Micro particle-image velocimetry of bead suspensions and blood flows. Exp. Fluids. 39 (3), 507-513 (2005).
  23. Wereley, S. T., Gui, L., Meinhart, C. D. Advanced algorithms for microscale particle image velocimetry. AIAA J. 40 (6), 1047-1105 (2002).
  24. Nguyen, C. V., Fouras, A., Carberry, J. Improvement of measurement accuracy in micro PIV by image overlapping. Exp. Fluids. 49 (3), 701-712 (2010).
  25. Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods. Meas. Sci. Technol. 23 (10), 105302 (2012).
  26. Bhamare, M. G., Patil, D. S. Automatic blood cell analysis by using digital image processing: a preliminary study. Int. J. Eng. Res. Tech. 2 (9), 3135-3141 (2013).
  27. Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform. Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).
  28. Jambhekar, N. D. Red blood cells classification using image processing. Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).
  29. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).

Tags

Биоинженерия выпуск 100 Эритроциты агрегация микроциркуляция микрофлюидики микро велосиметрия изображения частиц реологические свойства крови

Erratum

Formal Correction: Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation
Posted by JoVE Editors on 11/30/2015. Citeable Link.

An erratum was issue for Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation. The introduction section was updated.

The introduction was updated from:

Few studies have attempted to study RBC aggregation and determine the degree of aggregation in controlled flow conditions15-17. However, these studies indirectly investigate RBC aggregate sizes by determining the ratio of the occupied space in a shearing system measured based on microscopic blood images providing information on the degree of aggregation as well as the local viscosity.

We therefore present a new procedure to directly quantify RBC aggregates in microcirculation, dynamically, under controlled and constant shear rates. RBC-suspensions are entrained, in a double Y-microchannel (as illustrated in Figure 1), with a Phosphate Buffered Saline (PBS) solution hence creating a shear flow in the blood layer. Within this blood layer a constant shear rate can be obtained. The RBC-suspensions are tested at different hematocrit (H) levels (5%, 10% and 15%) and under different shear rates (2-11 sec-1). The blood velocity and shear rate are determined using a micro Particle Image Velocimetry (µPIV) system while the flow is visualized using a high speed camera. The results obtained are then processed with a MATLAB code based on the image intensities in order to detect the RBCs and determine aggregate sizes.

to:

Few studies have attempted to study RBC aggregation and determine the degree of aggregation in controlled flow conditions15-17. However, these studies indirectly investigate RBC aggregate sizes by determining the ratio of the occupied space in a shearing system measured based on microscopic blood images providing information on the degree of aggregation as well as the local viscosity. Chen et al.18 presented a direct measurement technique for RBC aggregate sizes and provided RBC aggregate size distribution for different shear stresses by varying the flowrate of the suspensions while monitoring the pressure drop across a flow chamber. The shear stresses are calculated based on the monitored pressure using Stokes equation18.

We therefore present a new procedure to directly quantify RBC aggregates in a controlled microfluidic environment, dynamically, under specific, constant and measurable shear rates. The blood flow in the shear system is directly observed (perpendicularly to the flow direction), providing a different angle on flow investigation compared to previous studies15,18 and a visualization of the full domain of interest. RBC-suspensions are entrained, in a double Y-microchannel (as illustrated in Figure 1), with a Phosphate Buffered Saline (PBS) solution hence creating a shear flow in the blood layer. Within this blood layer a constant shear rate can be obtained. The RBC-suspensions are tested at different hematocrit (H) levels (5%, 10% and 15%) and under different shear rates (2-11 sec-1). The blood velocity and shear rate are determined using a micro Particle Image Velocimetry (µPIV) system while the flow is visualized using a high speed camera. The results obtained are then processed with a MATLAB code based on the image intensities in order to detect the RBCs and determine aggregate sizes.

Reference 18 was updated to:

18. Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14, (4), 497-508 (1994).

All subsequent citations were also updated.

Контролируемая Микрожидкостных Окружающая среда для динамического исследования эритроцитов агрегации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. … More

Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation. J. Vis. Exp. (100), e52719, doi:10.3791/52719 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter