Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kontrollerad Mikrofluidumanordning Miljö för Dynamic Undersökning av röda blodkroppar Sammanläggning

Published: June 4, 2015 doi: 10.3791/52719
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Mechanical Engineering, University of Ottawa

ERRATUM NOTICE

Summary

Det protokoll som beskrivits detaljer en experimentell procedur för att kvantifiera röda blodkroppar (RBC) aggregat under kontrollerad och konstant skjuvhastighet, baserat på bildbehandlingstekniker. Målet med detta protokoll är att relatera RBC aggregatstorlekar att motsvarande skjuvhastighet i en kontrollerad mikroflödes miljö.

Abstract

Blod, som en icke-newtonsk biofluid, representerar i fokus för ett stort antal studier på hemorheology fältet. Blodbeståndsdelar inkluderar röda blodkroppar, vita blodkroppar och blodplättar som är suspenderade i blodplasma. På grund av överflödet av de röda blodkropparna (40% till 45% av blodvolymen), deras beteende dikterar det reologiska beteendet hos blod i synnerhet i mikrocirkulationen. Vid mycket låga skjuvhastigheter, är RBK ses att montera och bildar enheter som kallas aggregat, vilket bringar icke-newtonskt beteende av blod. Det är viktigt att förstå villkoren för aggregat bildandet att förstå blodet reologi i mikro. Protokollet som beskrivs här detaljer den experimentella proceduren för att bestämma kvantitativt RBC aggregaten i mikrocirkulationen under konstant skjuvhastighet, baserat på bildbehandling. För detta ändamål är RBC-suspensioner testas och analyseras i 120 x 60 ^ m poly-dimetyl-siloxan (PDMS) mikrokanaler. The RBC-suspensioner är entregnade användning av en andra vätska för att erhålla en linjär hastighetsprofil inuti blodskiktet och därmed uppnå ett brett utbud av konstanta skjuvhastigheter. Skjuvhastigheten bestäms med användning av en mikro Particle Image Velocimetry (μPIV) system, medan RBC aggregat visualiseras med hjälp av en höghastighetskamera. Filmerna tagna av RBC aggregaten analyseras med användning av bildbehandlingstekniker för att bestämma aggregatstorlekar baserade på de bilder intensiteter.

Introduction

Röda blodkroppar (RBC) spelar en avgörande roll för att bestämma det reologiska beteendet hos blod. De är nästan ovanligt ansvariga för de speciella egenskaperna hos blod in vitro och in vivo. Under fysiologiska betingelser, RBCs upptar 40% till 45% av blodvolymen. I mikrocirkulationen, bara RBC ockupera upp till 20% av blodvolymen på grund av mindre fartyg diametrar och plasma skimming effekt 1. Detta fenomen med minskning plasma i mikrocirkulationen är känd som Fåhraeus effekten. Vid låga skjuvhastigheter, RBC kan överbrygga tillsammans och bilda en dimensionell eller tre dimensionella strukturer som kallas "rouleaux" eller aggregat därför bidrar till den icke-newtonska beteendet hos blod. Emellertid är mekanismen för RBC aggregering inte fullständigt klarlagd. Två teorier finns för att modellera sammanläggning av de röda blodkropparna: att överbrygga celler teori på grund av tvärbindning av makromolekyler 2 och kraften attraktionsteori orsakad av utarmning av molekylerna på grund av den osmotiska gradienten 3.

Typiskt för humanblod, aggregat bildas vid mycket låga skjuvhastigheter 4 intervallet från 1 till 10 sek -1. Ovanför detta område, RBC tenderar att dela upp och strömma separat inuti kärlet.

Förstå villkoren för aggregat bildning är av stor betydelse för hemorheology villkor när det gäller att definiera blodets reologiskt beteende. Dessa aggregat ses ofta på makrocirkulationen nivå (> 300 um diameter) 5. Vid denna skala, blod betraktas som en newtonsk vätska och en homogen blandning. Emellertid är dessa aggregat sällan i kapillären nivå (4-10 | j, m i diameter) och är vanligtvis ett tecken på patologiska tillstånd såsom diabetes 6 och fetma. Andra patologiska tillstånd som kan förändra RBC aggregering innefattar inflammatoriska eller infektiösa tillstånd,kardiovaskulära sjukdomar, såsom högt blodtryck eller åderförkalkning, genetiska sjukdomar och kroniska sjukdomar 7. Därför kan förstå aggregationsmekanismen RBC och analysera dessa enheter (genom att definiera en relation mellan storleken på dessa aggregat och strömningsförhållandena) leda till förståelsen av microrheological beteende av blod och därmed relatera det till kliniska tillämpningar.

RBC aggregat kan förändras genom flera faktorer, såsom hematokrit (volymen av RBC i blod), skjuvhastigheten, kärldiametern, RBC membranstelhet och suspensionsmediet kompositionen 8-10. Därför är kontrollerade betingelser som krävs för att effektivt analysera RBC aggregaten. Flera metoder har möjlighet att analysera aggregatbildning genom att ge statiska mätningar aggregering (aggregering index) som erbjuder relevant information om blod beteende. Dessa metoder inkluderar, bland annat, den sänkningsreaktionmetod 11, ljusöverföringsmetoden 12, den ljusreflektion metoden 13 och viskositeten metoden 14 låg skjuvning.

Få studier har försökt att studera RBC aggregering och bestämma graden av aggregering under kontrollerade flödesförhållanden 15-17. Men dessa studier indirekt undersöka RBC sammanlagda storlekar genom att bestämma förhållandet mellan den ockuperade utrymme i en skärsystemet mäts utifrån mikroskopiska blod bilder som ger information om graden av aggregering samt den lokala viskositeten.

Vi presenterar därför ett nytt förfarande för att direkt kvantifiera RBC aggregat i mikro, dynamiskt under kontrollerade och konstanta skjuvhastigheter. RBC-suspensioner medbringas, i en dubbel Y-mikrokanal (såsom visas i fig 1), med en fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning därmed skapa ett skjuvflöde i blodskiktet. Inom detta blod skikt en konstant shear hastighet kan erhållas. The RBC-suspensioner testas vid olika hematokrit (H) nivå (5%, 10% och 15%) och under olika skjuvningshastigheter (2-11 sek -1). Blodhastigheten och skjuvhastighet bestämmes med användning av en mikro Particle Image Velocimetry (μPIV) systemet medan flödet visualiseras med hjälp av en höghastighetskamera. De erhållna resultaten behandlas sedan med ett MATLAB-kod baserat på de bildintensitet för att detektera de röda blodkropparna och bestämma aggregatstorlekar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Blod samlas in från friska individer med godkännande av den etiska kommittén vid universitetet i Ottawa (H11-13-06).

1. Mikro Fabrication

De mikro tillverkas baserat på standard fotolitografiska metoder 18.

  1. Utforma mikrogeometrin med hjälp av en datorstödd konstruktion (CAD) programvara och skriva ut konfigurations på en öppenhet fotomask. Dessa masker är avgörande eftersom de dikterar strålgången under tillverkningsprocessen. I detta fall är mikrokanaldimensioner är 120 | im i tjocklek, 60 ^ m i djup och 7 mm i längd.
  2. I ett renrum, spinn belägga en epoxibaserad negativt fotoresist på en kiselskiva vid 2000 rpm under 30 sek för att erhålla den önskade mikrokanaldjupet (60 | j, m).
  3. Exponera skivan och den fotomasken under en UV-lampa på 650 mJ / cm 2 för 70 sek. Se till att exponera endast de transparenta områdena ifotomask för UV-ljus. Exponeringen av de transparenta områdena möjliggör polymerisation av kedjorna som resulterar i en härdning av fotoresist. Sänk kiselstycket till en utvecklare för att avlägsna överskott av fotoresist.
  4. När formen är tillverkad, blanda en silikonbaserad elastomer och ett härdningsmedel i ett förhållande av 10: 1 för att skapa en lösning av poly-dimetyl-siloxan (PDMS). Sätt PDMS lösningen i en vakuumkammare för avgasning. Häll det i formen och värm vid 60 ° C under 90 minuter för att skapa mikrokanaler. Binda sedan de enskilda kanalerna till en glasskiva med hjälp av syreplasma bindning under 90 sekunder.
    OBS: PDMS avgasa processen utförs för att eliminera luftbubblor som framkallas av blandningsprocessen.
  5. Se till att mikrokanaldimensioner möjliggör framgångsrika tester. I detta protokoll, mikrokanaler har en rektangulär tvärsektion på 120 x 60 nm. I jämförelse, har en genomsnittlig RBC en diameter av 8 | j, m och en tjocklek av 2 um. Denrefore är mikro tillräcklig bredd för att uppmärksamma rätt aggregering och exakt fastställa hastighetsprofiler.

2. Blod Framställning

  1. Samla blod från friska frivilliga givare, efter godkännande av en etisk kommitté. Behandla blodet med etylendiamintetraättiksyra (EDTA) som är närvarande i uppsamlingsrören (7,2 mg EDTA i 4 ml blod).
    OBS! EDTA används för att undvika blodproppar.
  2. Centrifugera blodprov tre gånger för 10 min vid 1400 x g (3000 rpm) för att separera blodbeståndsdelar. Som ett resultat av centrifugeringen, observera tre distinkta skikt.
    OBS: De tre skikten är RBC skiktet (belägen vid botten av röret), buffy coat (bestående av vita blodkroppar och blodplättar som ligger på toppen av RBC skiktet) och plasmaskiktet (ligger på toppen av alla andra beståndsdelar).
    1. Efter den första centrifugeringen, samla blodplasma med användning av en blod pipett. Undvik contakt med lättcellskoncentratet.
    2. Samla och avyttra lättcellskoncentratet i en behållare med blekmedel utspätt till 10%.
    3. Tillsätt 3 ml PBS pH 7,4 till vart och ett av rören med de återstående RBC lagret och säkerställa den rätta balansen av centrifugen. Blanda försiktigt rören och centrifugera en gång vid 1400 x g (3000 rpm) under 10 minuter.
      OBS: Se till att PBS-lösningen inte innehåller något magnesium eller kalcium eftersom de kan förändra celladhesion.
    4. Kassera PBS i rören efter den andra centrifugeringen och avlägsna kvarvarande gul hinna om närvarande. Upprepa steg 2.2.3 och 2.2.4 för tredje centrifugering för att ge rena RBC.
  3. Blanda den önskade mängden (0,05, 0,1 och 0,15 ml) av de rena RBC med plasma (0,95, 0,9 och 0,85 ml) i en 1 ml rör för att erhålla RBC-suspensioner med motsvarande (5%, 10% och 15% ) hematokrit. Kontrollera hematokriter med en mikrocentrifug.

3. Vätskor Framställning

  1. Tillsätt 60 ul av lösningen fluorescerande spårpartiklar (1% fast, d partikel = 0. 86 pm, abs λ = 542 nm och λ emission = 612 nm) i 1 ml RBC-suspension rör.
    OBS: De fluorescerande spårämnespartiklar (internt färgade polystyrenpartiklar) används för att mäta hastigheten hos flödet i mikrokanalen. Dessa partiklar fluorescerar när de exponeras för den motsvarande våglängden hos den laserstråle (λ = 542 nm).
  2. Förbered en PBS pH 7,4 lösning och tillsätt 60 | il av samma fluorescerande spårämne partiklar lösning i 1 ml av PBS-lösning.

4. Aggregat Storlek Mått

  1. För att infoga vätskor (RBC-suspensioner och PBS) i mikro, använda två glassprutor av 25 pl och 100 pl. Det här kommer attbidra till att minska efterlevnaden av systemet. Anslut mikro till sprutorna via slangar och kopplingar Montering av ingångshålen. Fyll glassprutor med användning av tryckskillnaden som föreligger mellan fluidbehållaren och sprutan. Se till att inga bubblor är närvarande i systemet. Som en alternativ metod, använder en tryckstyrt system för att driva båda vätskor i mikro.
  2. Placera mikrokanalen på ett inverterat mikroskop skede förbunden med en höghastighetskamera och en μPIV systemet. Programmera sprutpumpen till de önskade flödeshastigheter (t ex Q = 2 | j, l / h under blod Engendering en flödeshastighet av Q = 8 | il / h under PBS).
    OBS: Endast en sprutpump används. Med hjälp av två olika glassprutor, med två olika innerdiametrar, är det möjligt att variera flödet in varje gren av Y-mikro.
  3. Sätt båda vätskorna i dubbel Y-mikro vardera från en annan post gren och vid olika flöden som visas i 19 (fig 2 och 3). Vänta tills flödet för att nå steady state innan förvärva mätningarna: visuellt inspektera kamerabilder höghastighets för ett jämnt flöde.
    OBS: Förhållandet är avgörande för att erhålla en linjär hastighetsprofil inuti blodskiktet.
  4. Visualisera RBC med hjälp av höghastighetskamera. Anslut kameran till en dator för att styra, spela in och spara bilder av vätskeflödet. När de två vätskeflöden når steady state, starta inspelningen.
    1. Förvärva flera bilder för bättre resultat bearbetning. Bestäm en optimal kamera exponeringstid för en tydlig bild av aggregaten.
      OBS! Kameran exponeringstiden i detta fall var 0,5 msek. Valet av tidsintervallet mellan varje ram är baserad på kamerans bildhastighet och flödeshastigheten i than mikrokanal. Tiden mellan varje ram bearbetas i denna procedur var 60 msek. Därför är en kamera som kan spela in 18 bildrutor per sekund är tillräckligt.
      OBS: Undvik blod sedimentering i röret och sprutan, vilket kan leda till felaktiga mätningar.
  5. Använda bildbehandlingsteknik (en MATLAB program i det här fallet) för att förbättra bildkvaliteten, upptäcka aggregaten i vart och ett av de bilder som bygger på pixelintensiteter (visas i figur 4) enligt följande:
    1. Förbättra bilderna kontrast med hjälp av histogrammet equalizer metod för att få en bättre bildkvalitet för varje bildruta.
    2. Konvertera gråskalebilder till binära bilder. För detta ändamål ställer ett tröskelvärde, från 0 till 1, som dikterar omvandlingen av varje pixel. Varje pixel i bilden under tröskelvärdet kommer att upptäckas som en svart pixel, medan pixlar med värden större än tröskelvärdet kommer att upptäckas som vita pixlar.
    3. Fyllhål (om det går nödvändigt) motsvarar luckorna inom ett aggregat för bättre resultat.
    4. Detektera cellerna genom bestämning angränsande vita bildpunkter i den binära bilden, så att intilliggande celler är associerade som aggregat.
    5. Märk olika aggregat som upptäckts och omvandla den binära bilden till en röd-grön-blå (RGB) bilder för bättre visualisering. Kombinera de ursprungliga ramar med vardera av de motsvarande bearbetade bilder för att verifiera effektiviteten av bildbehandlingsteknik och se till att alla cellerna beaktas, såsom visas i fig 5. Utför steg 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 , 4.5.4 och 4.5.5 för alla ramar fångas.
    6. Beräkna arean av varje aggregat detekteras i ramen baserat på antalet pixlar detekterade. Baserat på objektivets förstoring används, beräkna omvandlingsfaktorn med hjälp av en kalibrerings hårkors, och omvandla resultaten till pm 2. Medelvärdet de samlade storlekar som upptäckts i varjeram och sedan det genomsnittliga resultatet för alla ramar för att få den genomsnittliga sammanlagda storleken för varje inspelning av RBC-suspensioner.
    7. Beräkna arean av en RBC för att bestämma ett representativt uppskattade antalet röda blodkroppar i varje detekterad aggregat. Med hjälp av dessa resultat, beräkna fördelningen av andelen röda blodkroppar i varje aggregat som en funktion av den sammanlagda storlek (representeras av det uppskattade antalet celler i varje aggregat), som visas i figur 6.
      OBS: För att mäta RBC aggregaten kan ImageJ programvara användas (istället för MATLAB) för att utföra samma arbetsuppgifter på varje bildruta.

5. fluidhastigheten och skjuvningshastighet Mätningar

Bestäm fluidhastigheten och följaktligen skjuvhastighet med användning av ett μPIV systemet.

  1. När data förvärvas med hjälp av höghastighetskamera, växla till dubbel pulsade kamera som används för μPIV systemet. Använd en bildhanteringsprogram för bild acförvärvs av flödet och bildbehandlingen för hastighetsfältet bestämning.
  2. Vidta alla försiktighetsåtgärder som behövs, beroende på klass av laser, innan du slår på lasern. Slå sedan på systemet, kameran och lasern.
  3. Kalibrera kameran baserat på objektivets förstoring används. För detta ändamål, använda en mikro av 10 mikrometer precision under mikroskop och ställa in storleken på 1 pixel i bilden.
  4. Starta lasern och visualisera partiklarna i båda fluiderna. Hitta mitt plan mikro genom att fokusera på de snabbaste partiklarna i flödet (dvs, bör de snabbaste partiklarna vara den ljusaste).
  5. Ställ dt (tidsintervallet mellan två på varandra följande ramar) för att säkerställa en korrekt förskjutning av partikeln. De snabbaste partiklar ska röra sig 5 till 10 pixlar mellan de båda bilderna.
  6. Starta inspelningen flödet. Ställ in programvara för att förvärva 100 par av bilder, 5 ms mellanrum. Utför steg 5,4, 5,5 och 5,6 för alla diflunda RBC-suspensioner och för olika skjuvhastigheter.
    OBS: Mer information om de metoder som anges i studiet av Pitts och Fenech 20.
  7. Behandla inspelningar förvärvade hjälp av korskorrelationsmetoden med bildbehandlingsprogram.
    OBS: Denna består av diskretisering paret av bilder till små fönster med förutbestämd storlek (baserat på fluidflödet och tidsintervallet som valts av användaren) kallas korrelationsfönster och efter förskjutning av partiklarna i varje fönster.
    1. Först måste du bestämma om bilderna förvärvade kräver förbehandling (inklusive bakgrundssubtraktion, "bas-klippning" 21 eller bildöverlappande 22,23) för bättre databehandling.
    2. Välj sedan korrelationsfönstret storlek och form, liksom av andelen bilder överlappande. En detaljerad studie utfördes av Pitts et al. 24 för att bestämma den optimala parametrar och bild förbehandlingstekniker för blodflöde i olika kanalkonfigurationer. Uttryck resultaten som en medelhastighet område beräknas från 100 bildpar och Root Mean Square (RMS) fel i hastigheten.
  8. Extrahera en hastighetsprofil vid kanalutloppet, från den bearbetade datan såsom visas i figur 7. För en bättre profil, genomsnitt hastighetsfältet i rymden.
    OBS: Staplarna komponera hastighetsprofilen motsvarar korrelationsfönstrets storlek väljs relativt den kanalbredd. Den RMS-felet i hastighet visas även i fig 7, som representerar felet i den experimentella hastighetsuppskattning.
  9. Stäng av lasern när alla mätningar och behandling utförs ,. Stäng alla komponenter i systemet: mjukvara, kameror, flytta scenen, datorer och laser.
  10. För att beräkna skjuvhastighet, först detektera och uppskatta blodtjocklek i mikrokanalen baserat på höghastighetskamerainspelning. För detta ändamål skall det genomsnittliga allaramarna i viss inspelning för att få en bakgrundsbild av videon. Avgränsa blodskiktet (såsom visas i fig 8 för RBC-suspensioner som strömmar med 10 | j, l / h när suspenderades vid 5%, 10% och 15% hematokrit). Erhålla hastighetsvärde för den motsvarande blodskikttjockleken och beräkna skjuvhastigheten genom att dividera anslagsvärde av blodet skikttjocklek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ett exempel på två-fluidflödet i dubbel Y-mikrokanal visas i figur 2 för mänskliga RBCs suspenderade vid 5%, 10% och 15% hematokrit och flyter på 10 | j, l / h. Figur 3 visar skillnaden i aggregatstorlekar när flödet i kanalen reduceras från 10 | j, l / h till 5 | j, l / h under ett hematokritvärde av 10%. Detta ger en kvalitativ uppfattning om storleken på aggregaten när variera hematokrit och skjuvhastighet. Figur 5 följer förflyttningen av fyra humana RBC aggregat, för tre konsekutiva ramar, vilket ger en kvalitativ mått på kamerans bildhastighet som krävs och kvalitativ uppfattning om aggregat fördelningen inom varje ram. I Figur 5, är de små aggregat (med 8 eller mindre uppskattade RBC) visas i blått, medan medel aggregat (som sträcker sig 9-30 uppskattade RBC) och stora aggregat (mer än 30 uppskattade RBC) visas i grönt och rött resp.

fig 7, där de röda, blå och gröna kurvorna representerar hastighetsprofilerna för de röda blodkropparna suspenderade i 5%, 10% och 15% hematokrit respektive. De RMS fel hastigheten, visas också i figur 7 för varje RBC-suspension, är relativt små jämfört med de hastighetsvärden, anger precisionen i mätningarna hastighet, och därmed skjuvhastigheter. De gränsyteplatserna betecknas som "E" och visas som heldragna linjer i samma figur.

Motsvarande skjuvningshastigheter för de olika RBC-suspensioner (baserat på hastighetsprofilerna och blodet skikttjocklek) visas i Tabell 1. De genomsnittliga aggregatstorlekar som fastställs för var och en av RBC-suspensioner, baserat på bildbehandlingsmetod för att detektera område av RBC aggregaten, är visade i fig 9, som en funktjonen av det motsvarande skjuvningshastighet. Ett exempel på fördelningen av procentandelen av de röda blodkropparna i varje aggregat visas i figur 6. De sammanlagda storlekar representeras som ett uppskattat antal RBC i aggregaten.

Figur 1
Figur 1. Dubbla Y-mikro konfiguration och inträdesvätskor. Blod kommer in i första grenen vid Q = 2 pl / h medan PBS in i andra grenen vid Q = 8 il / h. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Humant RBC-suspension vid olika hematokrit. Figuren representerar fångade ramar av de humana RBC-suspensioner som flödar vid Q = 10 | il / timme vid (A) 5% (B)10% och (C) 15% hematokrit. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Human RBC-suspension vid olika flöden. Siffran representerar fångade ramar för de mänskliga RBC suspenderade på 10% hematokrit H strömmar (A) Q = 10 l / h och (B) Q = 5 ul / h. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Flödesschema för bildbehandlingsprogram användes för aggregerad detektering. De visade stegen beskriver den grundläggande metod som används. Kvaliteten på bilden förbättras för att vara c onverted till en binär bild. Aggregaten upptäcks och märkas utifrån sina respektive storlekar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. RGB färg och nettorörelse av flera mänskliga RBC aggregat för tre på varandra följande ramar. Figuren visar nettorörelse fyra aggregat som upptäcktes i tre på varandra följande ramar på (A) t = 0 ms, (B) t = 60 ms och (C) t = 120 ms. De stora aggregat (> 30 uppskattade RBC), medel aggregat (9-30 uppskattade RBC) och små aggregat (<8 uppskattade RBC) visas i rött, grönt och blått respektive. Vart och ett av aggregaten detekterade är markerade med en svart cirkel._blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. RBC sammanlagda storleksfördelning för 10% H RBC-suspension för olika flödeshastigheter. Aggregate storleksfördelning för blodprov suspenderade vid 10% H, flyter på Q = 10 och 5 ul / h. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 7
Figur 7. hastighetsprofil jämförelse för olika hematokrit. De hastighetsprofiler visas för RBC i plasma suspenderade vid 5% H (röd), 10% H (blå), 15% H (grön) och simulering 19 (heldragen linje) för den 120 x 60 um dubbel Y-mikro med en Q = 10 ^ / h. Gränssnittet läge betecknas med E för denexperiment. Motsvarande RMS fel av olika hastighetsprofilerna visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8
Figur 8. Bild bakgrund för de olika RBC-suspensioner och avgränsning i blodet skikttjocklek. Figuren visar avgränsningen av blod tjocklek av RBC-suspensioner flyter på 10 ul / h avbröts kl (A) 5%, (B ) 10% och (C) 15% H Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 9
Figure 9. genomsnittliga sammanlagda storlekar som en funktion av de motsvarande skjuvhastigheter. Resultaten erhålls för de olika RBC-suspensioner flyter på Q = 10 l / h vid 5% (A), 10% (B) och 15% H (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Hematokrit Flödeshastighet (| il / timme) Skjuvhastighet (sek -1)
5% 10 11,02
5% 5 5,36
10% 10 8,17
10% 5 4,47
15% 10 7,41
15% 5 2,51

Tabell 1. Shear frekvensvärden för olika blodflödes fall. Skjuvningshastigheten värden erhålles med användning av de μPIV data och bildbehandlings resultat för olika RBC-suspensioner med 5%, 10% och 15% H, som strömmar med Q = 10 | il / timme och Q = 5 | il / timme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Med användning av föreliggande metod, är det möjligt att analysera kvalitativt och kvantitativt RBC aggregat under olika strömningsförhållanden och hematokriter. För framgångsrika tester och samlade upptäckt, är det viktigt att bestämma lämplig hastighetsförhållandet mellan de båda vätskorna på mikro posten. Detta förhållande är mycket viktigt att uppnå en optimal blodskikttjocklek där hastighetsprofilen är kvasi-linjär 19.

En annan viktig faktor för framgångsrik testning är en bra bildkvalitet. Faktum är att eftersom förfarandet är baserat på bildbehandling, är det mycket viktigt att ha en kontrast mellan bildens bakgrund (vätskan inuti kanalen) och partiklarna som skall detekteras. Här, såsom visas i figurerna 2 och 3, att partiklarna verkar vara mörkare än bakgrunden, som hjälper till i den sammanlagda detektering. Den viktigaste parametern för att överväga för bildbehandlingsteknik är threshold värde. Därför bygger på kontrasten erhållits är det viktigt att välja den optimala tröskelvärde där alla aggregaten kommer att beaktas, som visas i figur 5. Den nuvarande bilden segmentering, som används för denna studie, används ofta för celldetektering och räkna 25- 27. Om kvaliteten på bilden inte som önskat och ett globalt tröskelvärde inte är lämpligt, kan man använda en annan algoritm för att bestämma den optimala tröskelvärdet såsom Otsu metod 28 eller en adaptiv tröskelmetod (diskretisering bilden och erhålla en lokal tröskel för varje diskretiseras fönster).

En annan faktor att ta hänsyn till är skalfaktorn för en korrekt omvandling från pixlar till xm.

Använda rätt omräkningsfaktorn, kan man bestämma diametern och tjockleken på en RBC som tjänar till att bestämma den sammanlagda storleksfördelning (baserat på den uppskattade number av RBC i varje aggregat). Beroende på orienteringen av aggregaten, korrekt beräkna området på en RBC (framifrån eller från sidan). Som nämnts i avsnitt 4 (steg 4.4.1), är det viktigt att bestämma den rätta kameran exponeringstiden och bildhastighet för att säkerställa att de dynamiska egenskaperna hos aggregaten fångas mellan varje rad ram. Detta värde är baserat på flödeshastigheten som används vid förvärv mätningarna. Flera andra faktorer måste beaktas vid förvärv resultat använder μPIV systemet och tydligt diskuteras i studien av Pitts och Fenech 20.

Metoden testades framgångsrikt på flera RBC-suspensioner flyter på olika hematokrit. Men på grund av den begränsning av bildbehandlingstekniken och bristen på kontrasten mellan bildens bakgrund och aggregaten, är det svårt att upptäcka RBC aggregat för högre hematokriter (från 20% till 45%). I själva verket som nämntstidigare, är bildkvaliteten avgörande för denna metodik.

Med hjälp av detta protokoll, kan RBC aggregatstorlekar mätas på ett kontrollerat mikrofluidikanordning och därför är det möjligt att få information om RBC sammanläggning dynamiskt i mikrocirkulationen och få RBC sammanlagda storlekar för en rad fysiologiska skjuvhastigheter. Det är också möjligt att komplettera numeriska och experimentella studier av blod reologi och relatera aggregatstorlekar och beteende till kliniska och patologiska studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada. Mikro utfördes med stöd av McGill Nanotools Microfab anläggning vid McGill University och Institutionen för elektronik vid Carleton University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SU8-50 epoxy based negative Photo-resist MicroChem Corp.
SU8-50 developer MicroChem Corp.
Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184 Dow-Corning 3097358-1004
PE-50 series Plasma system  Plasma Etch PE-50 series
Blood collection tubes with K2-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) FisherSci B367861
Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 Thermo Scientific 004260F
Poshpate buffered saline (PBS) Sigma Aldrich P5368-10PAK
Tracer fluorescent particles solution (15 ml) FisherSci R800
Aggregometer RheoMeditech Rheo Scan AnD300
Glass syringes (50 µl) Hamilton 80965
Tubing (Tygon) FisherSci AAA00001
High speed camera (Basler) Graftek Imaging Inc. basler acA2000-340km A camera capable of recording 18 frames per second could be used.
Double pulsed camera  LaVision Imager Intense
Microscope MITAS LaVision MITAS
Nd:YAG laser New Wave Research Solo-II
Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus) Chemyx Inc. and Harvard Apparatus Nexus3000 and PicoPlus
DaVis software LaVision Davis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perkkio, J., Keskinen, R. Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming. Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).
  2. Chien, S., Jan, K. Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation. Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).
  3. Neu, B., Meiselman, H. J. Depletion-mediated red blood cell aggregation in polymer solutions. Biophys. J. 83 (5), 2482-2490 (2002).
  4. Schmid-Schönbein, H., Gaehtgens, P., Hirsch, H. On the shear rate dependence of red cell aggregation in vitro. J. Clin. Invest. 47 (6), 1447-1454 (1968).
  5. Pries, A. R., Secomb, W. Rheology of the microcirculation. Clin. Hemorheol. Microcirc. 29 (3-4), 143-148 (2003).
  6. Baskurt, O. K., Neu, B., Meiselman, H. J. Red Blood Cell Aggregation. , Taylor and Francis. Florida. (2011).
  7. Cho, Y. I., Mooney, M. P., Cho, D. J. Hemorheological disorders in diabetes mellitus. J. Diabetes Sci. Technol. 2 (6), 1130-1138 (2008).
  8. Baskurt, O. K., Hardeman, M. R., Rampling, M. W., Meiselman, H. J. Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. , IOS Press. Netherlands. (2007).
  9. Lindqvist, T. The viscosity of the blood in narrow capillary tubes. Am. J. Physiol.-Legacy Content. 96, 562-568 (1931).
  10. Goldsmith, H. L., Cokelet, G. R., Gaehtgens, P. R. Fåhraeus: Evolution of his concepts in cardiovascular physiology. Am. J. Physiol. 257 (3), H1005-H1015 (1989).
  11. Fåhraeus, R. The suspension stability of the blood. Physiol. Rev. 9 (2), 241-274 (1929).
  12. Bauersachs, R. M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J. Determination of specific red blood cell aggregation indices via an automated system. Clin. Hemorheol. 9 (1), 1-25 (1989).
  13. Hardeman, M. R., Dobbe, J. G., Ince, C. The laser-assisted optical rotational cell analyzer (lorca) as red blood cell aggregometer. Clin. Hemorheol. Microcirc. 25 (1), 1-11 (2001).
  14. Rampling, M. W. Red cell aggregation and yield stress. Clinical Blood Rheology. , CRC Press. Boca Raton, Florida. (1988).
  15. Dusting, J., Kaliviotis, E., Balabani, S., Yianneskis, M. Coupled human erythrocyte velocity field and aggregation measurements at physiological haematocrit levels. J. Biomech. 42 (10), 1438-1443 (2009).
  16. Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity: modelling using shear fields measured by a µPIV based technique. Med. Eng. Phys. 33 (7), 824-831 (2011).
  17. Sherwood, J. M., Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity and velocity distributions of aggregating and non-aggregating blood in a bifurcating microchannel. Biomech. Model. Mechan. 13 (2), 259-273 (2014).
  18. Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14 (4), 497-508 (1994).
  19. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie International Edition England. , 551-577 (1998).
  20. Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Design of a microfluidic system for red blood cell aggregation investigation. J. Biomech. Eng. 136 (6), 064501-1-064501-5 (2014).
  21. Pitts, K. L., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry for velocity profile measurements of micro blood flows. J. Vis. Exp. (74), e50314 (2013).
  22. Bitsch, L., Oleson, L. H., Westergaard, C. H., Bruus, H., Klank, H., Kutter, J. P. Micro particle-image velocimetry of bead suspensions and blood flows. Exp. Fluids. 39 (3), 507-513 (2005).
  23. Wereley, S. T., Gui, L., Meinhart, C. D. Advanced algorithms for microscale particle image velocimetry. AIAA J. 40 (6), 1047-1105 (2002).
  24. Nguyen, C. V., Fouras, A., Carberry, J. Improvement of measurement accuracy in micro PIV by image overlapping. Exp. Fluids. 49 (3), 701-712 (2010).
  25. Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods. Meas. Sci. Technol. 23 (10), 105302 (2012).
  26. Bhamare, M. G., Patil, D. S. Automatic blood cell analysis by using digital image processing: a preliminary study. Int. J. Eng. Res. Tech. 2 (9), 3135-3141 (2013).
  27. Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform. Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).
  28. Jambhekar, N. D. Red blood cells classification using image processing. Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).
  29. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).

Tags

Bioteknik röda blodkroppar aggregering mikrocirkulation mikrofluidik mikro Particle Image Velocimetry blod reologi

Erratum

Formal Correction: Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation
Posted by JoVE Editors on 11/30/2015. Citeable Link.

An erratum was issue for Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation. The introduction section was updated.

The introduction was updated from:

Few studies have attempted to study RBC aggregation and determine the degree of aggregation in controlled flow conditions15-17. However, these studies indirectly investigate RBC aggregate sizes by determining the ratio of the occupied space in a shearing system measured based on microscopic blood images providing information on the degree of aggregation as well as the local viscosity.

We therefore present a new procedure to directly quantify RBC aggregates in microcirculation, dynamically, under controlled and constant shear rates. RBC-suspensions are entrained, in a double Y-microchannel (as illustrated in Figure 1), with a Phosphate Buffered Saline (PBS) solution hence creating a shear flow in the blood layer. Within this blood layer a constant shear rate can be obtained. The RBC-suspensions are tested at different hematocrit (H) levels (5%, 10% and 15%) and under different shear rates (2-11 sec-1). The blood velocity and shear rate are determined using a micro Particle Image Velocimetry (µPIV) system while the flow is visualized using a high speed camera. The results obtained are then processed with a MATLAB code based on the image intensities in order to detect the RBCs and determine aggregate sizes.

to:

Few studies have attempted to study RBC aggregation and determine the degree of aggregation in controlled flow conditions15-17. However, these studies indirectly investigate RBC aggregate sizes by determining the ratio of the occupied space in a shearing system measured based on microscopic blood images providing information on the degree of aggregation as well as the local viscosity. Chen et al.18 presented a direct measurement technique for RBC aggregate sizes and provided RBC aggregate size distribution for different shear stresses by varying the flowrate of the suspensions while monitoring the pressure drop across a flow chamber. The shear stresses are calculated based on the monitored pressure using Stokes equation18.

We therefore present a new procedure to directly quantify RBC aggregates in a controlled microfluidic environment, dynamically, under specific, constant and measurable shear rates. The blood flow in the shear system is directly observed (perpendicularly to the flow direction), providing a different angle on flow investigation compared to previous studies15,18 and a visualization of the full domain of interest. RBC-suspensions are entrained, in a double Y-microchannel (as illustrated in Figure 1), with a Phosphate Buffered Saline (PBS) solution hence creating a shear flow in the blood layer. Within this blood layer a constant shear rate can be obtained. The RBC-suspensions are tested at different hematocrit (H) levels (5%, 10% and 15%) and under different shear rates (2-11 sec-1). The blood velocity and shear rate are determined using a micro Particle Image Velocimetry (µPIV) system while the flow is visualized using a high speed camera. The results obtained are then processed with a MATLAB code based on the image intensities in order to detect the RBCs and determine aggregate sizes.

Reference 18 was updated to:

18. Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14, (4), 497-508 (1994).

All subsequent citations were also updated.

Kontrollerad Mikrofluidumanordning Miljö för Dynamic Undersökning av röda blodkroppar Sammanläggning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. … More

Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation. J. Vis. Exp. (100), e52719, doi:10.3791/52719 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter