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विवो और पूर्व vivo पेरिटोनियल वसा में दूधिया स्पॉट संरचनाएं की डिम्बग्रंथि के कैंसर Metastatic औपनिवेशीकरण अध्ययन के लिए दृष्टिकोण में

Published: October 14, 2015 doi: 10.3791/52721
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 4, 4,5, 1
1Section of Urology, Department of Surgery, The University of Chicago, 2Department of Pathology, Robert Wood Johnson Medical School, 3Campbell Family Institute for Breast Cancer Research, Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network, 4Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, Campbell Family Institute for Breast Cancer Research, Princess Margaret Cancer Centre, University of Toronto, University Health Network, 5Departments of Medicine, Pharmacology, and Cancer Biology, Duke University Medical Center

Abstract

उच्च ग्रेड तरल डिम्बग्रंथि के कैंसर (HGSC), व्यापक पेरिटोनियल मेटास्टेसिस के कारण, एक अत्यंत गरीब पूर्वानुमान है जारी; महिलाओं के कम से कम 30% 5 साल के निदान के बाद जीवित हैं। वपा HGSC मेटास्टेसिस के गठन के लिए एक पसंदीदा स्थल है। इस microenvironment के नैदानिक ​​महत्व के बावजूद, डिम्बग्रंथि कैंसर की प्रगति के लिए omental वसा ऊतकों के योगदान understudied बनी हुई है। यह वाहिका के घने घोंसले आसपास के दूधिया बी, टी के शामिल हैं जो धब्बे, और एन.के. कोशिकाओं, मैक्रोफेज, और पूर्वज कोशिकाओं के रूप में जाना जाता संरचनाओं में शामिल है कि में omental वसा असामान्य है। दूधिया स्पॉट पेरिटोनियल समस्थिति के लिए आवश्यक हैं जो वपा की शारीरिक काम करता है, में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हम दूधिया धब्बे भी पेरिटोनियल वसा की या गर्भाशय के कैंसर मेटास्टेटिक उपनिवेशन, पेरिटोनियल मेटास्टेसिस के विकास में एक महत्वपूर्ण कदम को बढ़ावा देने के दिखाया है। यहाँ हम दृष्टिकोण हम मूल्यांकन करें और प्रति में दूधिया स्पॉट यों के लिए विकसित किया वर्णनवसा itoneal और इन विवो और पूर्व vivo में दोनों omental ऊतकों की डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका मेटास्टेटिक उपनिवेशन को उनके कार्यात्मक योगदान का अध्ययन। इन तरीकों इस प्रकार व्यापक पेरिटोनियल मेटास्टेसिस के विकास के लिए दूधिया मौके संरचनाओं के लिए कोशिकाओं की प्रारंभिक स्थानीयकरण से या गर्भाशय के कैंसर मेटास्टेसिस गठन के अध्ययन को सक्षम, माउस मॉडल और सेल लाइनों के अतिरिक्त करने के लिए generalizable हैं।

Introduction

सबसे ठोस ट्यूमर के विपरीत, उच्च ग्रेड तरल डिम्बग्रंथि के कैंसर (HGSC) से मेटास्टेसिस पेरिटोनियल गुहा 1 तक सीमित हैं। इस प्रकार, प्रभावी पेरिटोनियल उपचारों संभावित नियंत्रण या HGSC उन्मूलन सकता है। वर्तमान में, एक मानक चिकित्सकीय दृष्टिकोण कीमोथेरेपी 1-3 के साथ संयुक्त शल्य cytoreduction है। दुर्भाग्य से, रोगियों के विशाल बहुमत का अनुभव है और रोग की पुनरावृत्ति की जटिलताओं का शिकार। ये निराशाजनक आँकड़ों मेटास्टेटिक उपनिवेशवाद की बेहतर समझ के लिए की जरूरत को दिखाने के लिए, प्रक्रिया है जिसके द्वारा कैंसर की कोशिकाओं, उपयोग, और मेटास्टेसिस 2 फार्म के लिए मेजबान ऊतकों के भीतर पैदा करना स्थानीय बनाना।

वपा HGSC मेटास्टेसिस 4-7 की वरीय जल्दी साइट है। अन्य पेरिटोनियल वसा के विपरीत, omental वसा ऊतकों पेरिटोनियल homeos में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जो बी, टी, और एन.के. कोशिकाओं और मैक्रोफेज होते हैं, जो दूधिया धब्बे, के रूप में जाना असामान्य प्रतिरक्षा संरचनाओं में शामिलtasis 8,9। उनकी शारीरिक कार्यों के अलावा, हम दूधिया धब्बे या गर्भाशय के कैंसर मेटास्टेटिक उपनिवेशन 4 में एक सक्रिय भूमिका निभा पाया। तेजी से घर दूधिया स्पॉट करने के लिए या गर्भाशय के कैंसर की कोशिकाओं, कोशिकाओं एक secreted कीमोटैक्टिक कारक की ओर आगे बढ़ रहे हैं, सुझाव है कि; प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस assays, SKOV3ip.1, CaOV3, और HeyA8 (मानव) और ID8 (C57BL 6 / murine) में। दिलचस्प है, कैंसर की कोशिकाओं को दूधिया स्पॉट (यानी, जननांगों और गर्भाशय वसा) 4 कमी पेरिटोनियल वसा उपनिवेश नहीं है।

दूधिया मौके उपनिवेशन के विनियमन तंत्र की पहचान करने के लिए, हम मेटास्टेटिक उपनिवेशन 4 के समय के पाठ्यक्रम पर सेलुलर और आणविक घटनाओं से पूछताछ के लिए सक्षम है कि xenograft मॉडल अनुकूलित है। यहाँ बताया दृष्टिकोण का एक विशिष्ट लाभ पूरी तरह से विवो में एकीकृत और मीटर के पूर्व vivo मॉडल में उपयोगकर्ताओं परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए सक्षम बनाता है जो ऊतक वास्तुकला और समारोह पर जोर है,etastatic उपनिवेशन 4,10। होते हैं या दूधिया धब्बे की कमी है, जो या तो पेरिटोनियल वसा डिपो में कैंसर सेल स्थानीयकरण और विकास की तुलना करके, जांचकर्ताओं दर्ज कराने और physiologically प्रासंगिक ऊतकों में या गर्भाशय के कैंसर कोशिकाओं के प्रगतिशील विकास के लिए दूधिया स्पॉट भीतर adipocytes और कोशिकाओं के रिश्तेदार योगदान (एस) का परीक्षण कर सकते हैं।

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Protocol

सभी चूहों संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के दिशा निर्देशों को और शिकागो पशु संसाधन केंद्र के विश्वविद्यालय की देखरेख अनुसार रखे बनाए रखा और euthanized थे।

प्रायोगिक अध्ययन के लिए 1. तैयारी पशु

  1. जानवरों के परिवहन और हैंडलिंग की क्षमता का शारीरिक प्रभाव से उबरने के लिए नए आवास और पर्यावरण के लिए acclimate करने की अनुमति दें।
    नोट: निम्न तकनीक चूहों के सभी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपभेदों के लिए लागू है। एक प्रयोग के लिए प्रयोग की जाने वाली जानवरों की संख्या अध्ययन डिजाइन पर निर्भर है और एक सांख्यिकीविद् से परामर्श के साथ किया जाना चाहिए।

2. पहचान और पेरिटोनियल वसा डिपो के अलगाव।

  1. सीओ 2 की अधिक मात्रा और मौत की पुष्टि के लिए एक उच्च माध्यमिक शारीरिक विधि के माध्यम से जानवरों euthanize।
  2. कटाई पेरिटोनियल वसा डिपो के रूप में आंतरिक अंग हटाने (माध्यमिक विधि), एमए का गठन कियाKe आंतरिक अंगों (चित्रा 1 ए) का पर्दाफाश करने के लिए पेरिटोनियल दीवार के माध्यम से वंक्षण papillae के करीब एक midline चीरा।
  3. Omental वसा (ओएम) के लिए, संदंश (चित्रा 1 सी) के साथ पेरिटोनियल गुहा से तिल्ली का विस्तार करके omental / अग्नाशय जटिल बेनकाब। बारीकी से सभी ऊतक कनेक्शन trimming द्वारा अग्न्याशय और तिल्ली से वपा रिलीज। किसी भी शेष अग्नाशय के ऊतक 4 excised है कि सुनिश्चित करें।
  4. जननांगों वसा (GF) के लिए, ऊतक कनेक्शन (चित्रा 1 ए ऊपरी righ टी) 4 काटने से अंडाशय और आबकारी आसपास के जननांगों वसा उठाने के लिए संदंश का उपयोग करें।
  5. गर्भाशय वसा (यूएफ) के लिए, ऊतक कनेक्शन काटने से गर्भाशय सींग और आबकारी आसपास के गर्भाशय वसा उठाने के लिए संदंश का उपयोग (चित्रा 1 ए निचले सही) 4।
  6. Mesenteric वसा (एमएफ) के लिए, छोटी आंत और जठरनिर्गम के बीच जंक्शन काटा। संदंश मजबूती से पकड़ से मुक्त अंत करने के लिए प्रयोग करेंछोटी आंत, और इसे दूर mesenteric वसा से धीरे-धीरे "छील"। विदारक कैंची का उपयोग mesenteric जड़ से mesenteric वसा रिलीज (चित्रा 1 ए निचले बाएं) 4।
  7. Splenoportal वसा (एस एफ) के लिए, अग्न्याशय के लिए तिल्ली के वृक्कनाभि जोड़ने के ऊतक की पतली फैटी बैंड बेनकाब करने के लिए संदंश का उपयोग तिल्ली के बाहर का अंत उठा। पहले तिल्ली से यह विदारक ध्यान से तो अग्न्याशय से इसे जारी करने, और द्वारा splenoportal वसा उत्पाद शुल्क (चित्रा 1 बी) 4।

Giemsa धुंधला का उपयोग 3. दूधिया स्पॉट पहचान

  1. आबकारी omenta C57BL / 6 चूहों से और 16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस (ओ / एन) में 5% तटस्थ बफर formalin में तय (2.3 कदम को देखें)।
  2. तय ऊतक embedding आयल के लिए, ऊतक के आकार के लिए उपयुक्त है कि एक मोल्ड चुनें। मोल्ड भरने के लिए आयल जलाशय से पिघला हुआ आयल डालो। कैसेट खोलें और के लिए गर्म का उपयोग करCeps, मिट्टी में ऊतक हस्तांतरण।
    1. ध्यान से अनुदैर्ध्य वर्गों का उत्पादन करने के लिए embedding आयल के दौरान ऊतकों पूरबी। जगह में मजबूती मोल्डिंग और प्रेस पर लेबल ऊतक कैसेट रखें। मोल्ड में कम से कम 30 मिनट के लिए शांत करने के लिए अनुमति दें।
  3. Formalin तय आयल एम्बेडेड (FFPE) ऊतक ब्लॉक से (4 माइक्रोन मोटी) धारावाहिक वर्गों में कटौती। ऊतक के रिबन पैराफिन ब्लॉक उतर आता है के रूप में धाराओं के तहत एक precleaned स्लाइड रखें।
  4. क्रमानुसार अनुभाग पूरे वपा; इकट्ठा और Giemsa दाग (3.6 देखें) के लिए हर तीसरे खंड दाग। आरटी पर हे / एन अधिमानतः, शुष्क हवा के लिए वर्गों के साथ गिलास स्लाइड की अनुमति दें। सूखे स्लाइड निर्धारण के लिए तैयार हैं। Giemsa दाग स्लाइड करने के लिए की तुलना के लिए hematoxylin और eosin के लिए प्रथम खंड दाग।
  5. Xylenes में दो अनुक्रमिक 5 मिनट incubations के द्वारा स्लाइड Deparaffinize। निम्नलिखित में दो अनुक्रमिक incubations के द्वारा स्लाइड rehydrate: 100% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, और अंत में वा नलआतंकवाद।
    1. सूखने से स्लाइड से बचने के लिए पर्याप्त सावधानी रखना। आरटी पर सभी चरणों को पूरा।
  6. पूरी तरह से 5% Giemsa समाधान युक्त एक Coplin जार में विसर्जित स्लाइड और आरटी पर 4 मिनट के लिए सेते (नल के पानी में तैयार w / वी)। हवा शुष्क, 60 सेकंड के लिए नल के पानी में स्लाइड्स कुल्ला और बढ़ते मीडिया का उपयोग coverslip के साथ माउंट।
  7. छवि निर्माता सॉफ्टवेयर के साथ एक पूरे स्लाइड स्कैनर और इस प्रक्रिया का उपयोग दाग स्लाइड। ImageJ सॉफ्टवेयर 4 का उपयोग Giemsa से सना हुआ omental वर्गों में दूधिया मौके मात्रा यों।

में विवो और पूर्व vivo अध्ययन के लिए डिम्बग्रंथि कैंसर कोशिकाओं के 4. प्रचार और तैयारी

  1. एक गर्मी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेल मध्यम विकास के पूर्व गर्म 15 मिलीलीटर। सेल लाइन, बीतने संख्या, तारीख और जमे हुए शेयर तैयार करने वाले व्यक्ति का नाम, और तारीख के साथ लेबलिंग से एक उचित आकार टिशू कल्चर कुप्पी (जैसे, 75 सेमी 2 सतह क्षेत्र) तैयार करेंऔर व्यक्ति की कोशिकाओं चढ़ाना / विगलन है कौन।
    नोट: नीचे फ्रीज और बीतने संख्या की तारीख मेटास्टेटिक फेनोटाइप को प्रभावित कर सकते हैं के रूप में मेटास्टेसिस के अध्ययनों में इस तरह की विस्तृत जानकारी, महत्वपूर्ण है।
  2. जैविक सुरक्षा हुड, पिपेट टी -75 संस्कृति फ्लास्क में मध्यम की 10 मिलीलीटर की बाँझ वातावरण का उपयोग करना। तरल नाइट्रोजन प्रणाली से कोशिकाओं की एक शीशी निकालें और सेल प्रकार पुष्टि करने के लिए लेबल की जाँच करें। 37 डिग्री सेल्सियस गर्मी स्नान में वार्मिंग से एक समय में केवल कोशिकाओं के एक शीशी पिघलना।
  3. बाँझ तकनीक का उपयोग करना, पिपेट 1x10 6 संस्कृति फ्लास्क में कोशिकाओं thawed। कोशिकाओं को संलग्न करने की अनुमति देने के लिए इनक्यूबेटर में कुप्पी रखें। धीरे एक वर्दी सेल निलंबन के रूप में आगे और पीछे कुप्पी रॉक।
    1. टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में कुप्पी की जगह और सीओ 2 के माहौल 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। कोशिकाओं हे / एन पालन करने की अनुमति दें।
  4. महाप्राण मीडिया, और ताजा पूर्व गर्म विकास मीडिया के साथ बदलें। इनक्यूबेटर और सभी में कुप्पी की जगहओउ कोशिकाओं को विकसित करने के लिए। एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग हर 2-3 दिनों के दृश्य निरीक्षण द्वारा दैनिक सेल के विकास की निगरानी करें। 70-80% संगम पर पहुंचने पर पारित होने की कोशिकाओं के लिए मानक सेल कल्चर तकनीक का प्रयोग करें।
    नोट: प्रयोगात्मक जांच कोशिकाओं को सक्रिय proliferating रहे हैं यह सुनिश्चित करने के लिए 70% संगम पर कोशिकाओं फसल के लिए।
  5. संस्कृति के माध्यम Aspirate और बाँझ खारा फॉस्फेट बफर के 10 मिलीलीटर (पीबीएस) के साथ कुल्ला। महाप्राण पीबीएस और 0.25% / trypsin EDTA (एक 75 सेमी 2 सतह क्षेत्र के लिए 2 से 3 एमएल) जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट सेते हैं। दिखने में कोशिकाओं को अलग किया है कि इस बात की पुष्टि और मध्यम विकास के एक समान मात्रा में जोड़ने के लिए, और धीरे से एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए ऊपर और नीचे कोशिकाओं विंदुक।
    नोट: यह trypsin निष्क्रिय कर के रूप में मध्यम विकास सीरम होते हैं कि महत्वपूर्ण है। बाद के चरणों के दौरान कोशिकाओं के नुकसान की भरपाई करने के लिए एक भी प्रयोग के लिए आवश्यक संख्या से अधिक कोशिकाओं 4 गुना कम से कम 2 के लिए तैयार
  6. में व्यवहार्य कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारितएक hemacytometer या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग trypan नीले बहिष्कार परख के माध्यम से निलंबन।
    नोट: यहाँ, केवल कोशिकाओं के ≥ 96% व्यवहार्य हैं जिसमें सेल की तैयारियों का उपयोग करें।
  7. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कुप्पी से सेल निलंबन स्थानांतरण। 4 ओ सी पर, 1100 XG पर 5 मिनट centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं
  8. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और मिलीलीटर प्रति 2x10 6 कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए पीबीएस में सेल गोली resuspend।

प्रकोष्ठों के 5. इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन

हमारे प्रयोगों में, चूहों स्पष्ट रूप से इस तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए, रोगज़नक़ जोखिम के जोखिम को सीमित करने के क्रम में हमारे बाधा सुविधा के भीतर एक लामिना airflow या जैव सुरक्षा कैबिनेट में नियंत्रित किया जाता है, साथ वीडियो में प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी एक प्रयोगशाला में किए गए थे: नोट पशु काम के लिए। इस विशेष तकनीक संज्ञाहरण के तहत किया जाना जानवरों की आवश्यकता नहीं है। मंजूरी दे दी प्रोटोकॉल के तहत, इस techniq प्रदर्शनजीवित पशुओं पर UE। इस अध्ययन के लिए चूहों का उचित उपभेदों का प्रयोग करें। उदाहरण के लिए: मानव या गर्भाशय के कैंसर सेल (SKOV3ip.1, और HeyA8) उपनिवेशन के अध्ययन के लिए प्रतिरक्षा, athymic नग्न चूहों का उपयोग करें; माउस या गर्भाशय के कैंसर की कोशिकाओं (ID8) उपनिवेशन के अध्ययन के लिए असुरक्षित C57BL / 6 चूहों का उपयोग करें।

  1. लोड 500 सिरिंज में एकल कक्ष निलंबन की μl और बाँझ छाया हुआ 25 जी सुई में डाल दिया है। इस इंजेक्शन के लिए पहले सेल बाल काटना कम कर देता है।
  2. गर्दन के कूड़ा द्वारा माउस उठाओ और खजूर और तर्जनी का उपयोग पूंछ पकड़ और अंगूठी और (माउस बाएँ हाथ से रोका जाता है) छोटी उंगली के बीच छोड़ दिया हिंद पैर ठीक।
    नोट:, traumatizing पेट अंगों से बचने के लिए यह इंजेक्शन के दौरान नहीं ले जा सकता है कि इतनी अच्छी तरह से माउस को नियंत्रित करने के लिए।
  3. सिर्फ घुटनों से ऊपर पेट भर में एक लाइन की कल्पना कीजिए, और जानवर के सही पक्ष पर एक बात का पता लगाने और midline के करीब है। प्रवेश के मुद्दे पर कपाल और थोड़ा औसत दर्जे का हैपिछले निपल की।
    नोट: माउस के सही पक्ष पर सुई डालने सेसम से बचा जाता है और आंतों 11 puncturing के जोखिम को कम कर देता है।
  4. लगभग 0.5 सेमी की गहराई तक चूहों के पेट के निचले पार्श्व क्षेत्र में सुई डालें। सुई एक रक्त वाहिका या अन्य पेरिटोनियल अंगों प्रवेश नहीं किया गया है कि इस बात की पुष्टि करने के लिए सवार पर वापस खींच।
    1. किसी भी तरल पदार्थ aspirated है तो सिरिंज (और नमूना) 11 त्यागें। एक हरा भूरा या पीला महाप्राण क्रमश: आंतों या मूत्राशय में सुई प्रवेश इंगित करता है।
  5. धीमी, सतत दबाव का उपयोग नमूना इंजेक्षन। सुई वापस लेने और अपने पिंजरे करने के लिए माउस वापसी। तेजधार कंटेनर में निपटान से पहले सिरिंज संक्षिप्त मत करो।
  6. विशिष्ट समय बिंदुओं पर सीओ 2 asphyxiation और महत्वपूर्ण अंग हटाने के माध्यम से बलिदान चूहों के बाद इंजेक्शन।

विवो 6. दूधिया जगह बसाना

  1. Quantitaदूधिया स्पॉट करने के लिए कैंसर सेल स्थानीयकरण के tion के फ्लो का उपयोग करते हुए
    1. (2.3 कदम के रूप में वर्णित - 2.7) चूहों से पेरिटोनियल वसा डिपो को अलग fluorescently इंजेक्शन के साथ ठंडा पीबीएस में कैंसर की कोशिकाओं और तत्काल जगह ऊतकों चिह्नित।
      1. इस विशेष तकनीक के लिए, वजन मैचों की वपा करने के लिए सभी वसा वसा ऊतकों। स्थानांतरण ऊतकों सीरम मुक्त DMEM के 1.5 मिलीग्राम और 0.1% (w / v) गोजातीय सीरम albumin युक्त 5 मिलीलीटर ट्यूबों अलग करने के लिए। तीन स्वतंत्र चूहों से काटा पूल ऊतकों फ्लो के लिए कोशिकाओं की पर्याप्त पैदावार सुनिश्चित करने के लिए।
    2. शल्य कैंची का उपयोग करने और जोड़ने कीमा ऊतकों (w / v) कोलैजिनेज़ आई बारी-बारी से मिश्रण के साथ 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक निलंबन सेते 0.4% से युक्त सीरम मुक्त DMEM के 1.5 मिलीलीटर।
      1. एक वैकल्पिक कदम के रूप में, आगे चबाना द्वारा ऊतक अलग। इस मामले में, उन्मुखीकरण घूर्णन, कम पर 10 मिनट के लिए चबाना, एक microstomacher बैग के लिए ऊतक कोलैजिनेज़ निलंबन हस्तांतरण5 मिनट के बाद बैग की।
    3. एक नायलॉन जाल फिल्टर (60 माइक्रोन ताकना) के माध्यम से फिल्टर नमूने बड़ा मलबे को हटाने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 XG पर centrifugation के माध्यम से कोशिकाओं को इकट्ठा करने और सतह पर तैरनेवाला अंश त्यागें।
    4. एसीके lysis बफर के 900 μl के साथ संयुक्त पीबीएस के 100 μl में सेल गोली Resuspend और 1 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। 250 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं 5 मिनट के लिए और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
      1. ठंडा पीबीएस के 250 μl में सेल गोली Resuspend। एकल कक्ष निलंबन सुनिश्चित करने के लिए एक 60 माइक्रोन ताकना नायलॉन जाल के माध्यम से नमूने फ़िल्टर। ठंडा पीबीएस के 250 μl के साथ फिल्टर कुल्ला।
    5. कोशिकामापी एक 561 एनएम पीले-हरे रंग की लेजर से लैस एक प्रवाह है और एक 585 एनएम / 15 एनएम bandpass फिल्टर का उपयोग कर जनसंख्या में fluorescently टैग कोशिकाओं की संख्या quantitate। माता-पिता की कोशिकाओं और / या उचित नकारात्मक नियंत्रण 4 के विश्लेषण पर आधारित tdTomato पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए गेट पर सेट करें।
    6. सूक्ष्म और स्थूल मेटास्टेसिस के quantitation
      1. वांछित प्रयोगात्मक समापन बिंदु (ओं) पर, अलग, और तुरंत उचित निर्धारण मीडिया में ऊतकों जगह है। ऐसे बरकरार जननांगों, गर्भाशय, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए 10% तटस्थ बफर formalin में mesenteric वसा डिपो के रूप में बड़े नमूनों, ठीक करें। 2-16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5% तटस्थ बफर formalin में (गर्भाशय और mesenteric वसा की omental और splenoportal वसा, साथ ही ऊतक समकक्ष) छोटे नमूने को ठीक करें।
        1. वैकल्पिक रूप से, तस्वीर अक्टूबर के रूप में इस तरह के एक ठंड मध्यम में उन्हें रखने के द्वारा ऊतकों फ्रीज और तरल नाइट्रोजन का एक उचित मात्रा में ड्रॉप।
      2. स्थानांतरण आयल में एम्बेड तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 70% इथेनॉल और स्टोर करने के ऊतकों तय की। 3.2 और 3.3 में वर्णित के रूप में एम्बेड और प्रक्रिया ऊतक।
        1. सूक्ष्म मेटास्टेसिस की उपस्थिति या अनुपस्थिति के लिए ऊतकों का मूल्यांकन करने के लिए एच एंड ई दाग अनुभाग का उपयोग (यानी, 50 कोशिकाओं के समूहों)। टी की पुष्टिवह इस तरह के cytokeratin 8/18 के लिए एक आईएचसी दाग ​​के रूप में एक माध्यमिक विधि द्वारा सूक्ष्म मेटास्टेसिस की उपस्थिति या गर्भाशय के कैंसर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए।

    7. दूधिया स्पॉट औपनिवेशीकरण पूर्व Vivo

    1. बुनियादी पूर्व vivo omental अंग संस्कृति शर्तों की स्थापना
      1. 20% एफसीएस युक्त डीएमई / F12 मीडिया के 500 μl युक्त एक बारह अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट की एक अच्छी तरह से भीतर एक ही संस्कृति की थाली डालने और जगह में प्रत्येक वपा रखें। 24 से 48 घंटा और / या अतिरिक्त समय के अंक के लिए एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर अंग संस्कृतियों को बनाए रखें। हर हालत (जैसे, मीडिया प्रकार / समय बिंदु) के लिए तीन स्वतंत्र omenta (तीन प्रतियों नमूने) का प्रयोग करें।
      2. ऊतक अखंडता का आकलन कर सकते हैं एच ई वर्गों पर परिगलित adipocytes बनाम स्वस्थ गिनती चरण 3 में वर्णित के रूप में ठीक करने और प्रक्रिया के नमूने, प्रयोगात्मक समापन पर ऊतकों की अखंडता की पुष्टि करने के लिए। से की एक न्यूनतम ~ 120 कोशिकाओं5 जैविक नमूने 10 उपस्थित रहते ऊतक का एक प्रतिशत तैयार करने के लिए आवश्यक है।
      3. ऊतक समारोह, 20% एफसीएस के साथ डीएमई / F12 मीडिया के 500 μl युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली की अलग कुओं में जगह omenta (एन = 3) को मापने के लिए। Omenta 24 घंटे के लिए एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया की हालत करने की अनुमति दें, और उसके बाद एक आईएल -6 एलिसा परख 10 में उपयोग के लिए 250 μl को हटा दें।
    2. SKOV3ip.1-GFP कोशिकाओं के साथ माउस वपा के पूर्व vivo सह संस्कृति
      1. आगे बढ़ें और मिलीलीटर प्रति 2 × 10 6 कोशिकाओं की एकाग्रता में धारा 4 और resuspend में वर्णित के रूप में fluorescently टैग किया कोशिकाओं को तैयार।
      2. संस्कृति डालने की झिल्ली के लिए ऊतक चिपकने के ~ 6 μl लागू करें और शुष्क हवा के लिए यह अनुमति देते हैं। किसी भी अत्यधिक चिपकने वाला दूर करने के लिए बाँझ पानी के साथ दो बार झिल्ली धो लें। एयर एक लामिना हुड के तहत झिल्ली सूखी।
      3. ध्यान omenta आबकारी एवं चिपकने वाला लेपित memb को देते हैंराणे बाँझ संदंश का उपयोग। ऊतक से पहले मीडिया को जोड़ने के लिए 1 मिनट के लिए झिल्ली का पालन करने की अनुमति दें। प्रत्येक संस्कृति डालने में प्रत्येक वपा के शीर्ष पर सेल निलंबन के 500 μl जोड़ें। डीएमई / एफ-12 10 के 2.5 मिलीलीटर के साथ transwell कक्ष के आसपास क्षेत्र भरें।
      4. एक 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए सेल निलंबन के साथ omenta सेते हैं। ध्यान से हटाने और ~ पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ omenta धो लें। एक उपयुक्त फ्लोरोसेंट इमेजिंग प्रणाली 10 का उपयोग फ्लोरोसेंट कैंसर सेल foci कल्पना।

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Representative Results

पेरिटोनियल वसा डिपो की पहचान और histologic परीक्षा

सकल शारीरिक विच्छेदन पेरिटोनियल वसा (चित्रा 1 ए) के पांच प्राथमिक स्रोतों में से चार की पहचान के लिए अनुमति देता है। शीर्ष केंद्र से दक्षिणावर्त आगे बढ़ रहे हैं: वपा (ओम; उल्लिखित) (उह) बाएँ अंडाशय (ov), गर्भाशय वसा (यूएफ) गर्भाशय सींग से जुड़ी आसपास के पेट और तिल्ली, जननांगों वसा (GF) पर स्थित और अन्त्रपेशी (मेरा) छोटी आंत (एसआई) से जुड़ी। अंडाशय (ov), गर्भाशय सींग (उह), और छोटी आंत (एसआई) संदर्भ के अंक के रूप में संकेत कर रहे हैं। splenoportal वसा (सपा) प्लीहा धमनी के चारों ओर और सीलिएक धमनी (चित्रा 1 बी) के लिए तिल्ली के वृक्कनाभि जोड़ता है। अंत में, वपा पेट और अग्न्याशय (चित्रा 1 सी) से जुड़ा हुआ है। इन ऊतकों की सकल संरचना और रिश्तेदार आकार चित्रा -1 में दिखाया गया है। वें के histologic परीक्षाई ऊतकों splenoportal और omental वसा adipocytes [एक] से घिरा हुआ ऊतक परिधि में दूधिया मौके [एमएस] संरचनाओं, होते हैं कि पता चलता है; गर्भाशय, जननांगों, और mesenteric वसा नहीं है (चित्रा 1E)।

Giemsa धुंधला का उपयोग दूधिया मौके पहचान

अलग माउस उपभेदों, दूधिया स्थान की मात्रा और व्यक्तिगत omenta में मौजूद क्षेत्र के बीच समग्र दूधिया मौके सामग्री की तुलना सक्षम करने के लिए एक उपन्यास विधि का उपयोग quantitated था। के तरीके में वर्णित है, omenta के एक "डिजिटल पूरे माउंट" एक 5% Giemsa समाधान में ऊतक के हर तीसरे खंड धुंधला हो जाना और दाग ऊतकों (2A चित्रा) की छवियों पर कब्जा करने से निर्माण किया गया था। दूधिया स्पॉट गहरे नीले (चित्रा 2 बी) धुंधला क्षेत्रों के रूप में दिखाई देते हैं। दूधिया धब्बे के रूप में इन क्षेत्रों की पहचान CD45, एक आम लिम्फोसाइट मार्कर (के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के लिए दोनों एच एंड ई धुंधला और आईएचसी द्वारा धारावाहिक वर्गों में पुष्टि की गई एट अल 4 में वर्णित है, छवियों (2A चित्रा) संकलित और फिर व्यक्तिगत omenta में दूधिया स्थान की मात्रा और क्षेत्र की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो एक "डिजिटल पूरे माउंट" का निर्माण करने के लिए कार्रवाई कर रहे थे।

वपा के कैंसर उपनिवेशवाद की मात्रात्मक और गुणात्मक मूल्यांकन

एक फ्लो आधारित पद्धति intraperitoneal इंजेक्शन के बाद वसा डिपो में मौजूद कैंसर कोशिकाओं की संख्या quantitate करने के लिए विकसित किया गया था। इस प्रोटोकॉल मेटास्टेटिक प्रक्रिया के प्रारंभिक उपनिवेशन कदम अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। उदाहरण के लिए, चित्रा 3 में, ID8-tdTomato कोशिकाओं से तैयार किए गए थे और C57BL / 6 चूहों में intraperitoneally इंजेक्शन। 7 दिन के बाद इंजेक्शन (डीपीआई) में वसा अंगों काटा गया और तरीके में वर्णित के रूप में एक एकल कोशिका निलंबन में अलग। tdTomato सीई की संख्याLLS प्रवाह cytometry का उपयोग मात्रा था (चित्रा 3 ए, बाएं)। वपा tdTomato पॉजिटिव घटनाओं की संख्या में लगभग 12 गुना वृद्धि देखी गई, PBS- के सापेक्ष नियंत्रण (सही चित्रा 3), इंजेक्शन, लेकिन जननांगों वसा, गर्भाशय वसा, या अन्त्रपेशी से सेल की तैयारियों में कोई उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी । एक पूरक गुणात्मक आईएचसी आधारित दृष्टिकोण भी 7 दिन SKOV3ip.1 कोशिकाओं के आईपी इंजेक्शन के बाद, तुलनीय कैंसर कोशिका घावों दोनों omental और splenoportal वसा (चित्रा 3 बी) में मनाया गया है कि पता चला है। आईएचसी मानव अखिल cytokeratin (पैन-सी) के लिए दूधिया स्पॉट भीतर कैंसर कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करता है। आईएचसी धुंधला की विशिष्टता अखिल cytokeratin एंटीबॉडी (चित्रा 3 बी) के लिए एक आईजीजी नियंत्रण का उपयोग कर पुष्टि की गई। पेरिटोनियल वसा डिपो की ID8 या गर्भाशय के कैंसर उपनिवेशन 7 डीपीआई पर C57BL / 6 चूहों का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था। वपा और splenoportal वसा दोनों की दूधिया स्थानों में बड़े कैंसर कोशिका घावों बाहर हैंखड़े हैं। पैनल इनसेट में सचित्र के रूप में कैंसर कोशिकाओं के छोटे समूहों कभी-कभी अन्य वसा डिपो में देखा गया था। इस प्रकार, एक एक दिया ऊतक के भीतर सापेक्ष संख्या और कोशिकाओं के स्थान दोनों का उपयोग कर सकते हैं।

पूर्व vivo परख दूधिया स्थलों में से या गर्भाशय के कैंसर उपनिवेशन अध्ययन करने के लिए

ऊतक संरचना और वास्तुकला को बनाए रखते हुए इन विवो की स्थिति की सीमाओं को संबोधित करने के क्रम में, हम omental ऊतकों की डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका उपनिवेशन अध्ययन करने के लिए एक पूर्व vivo दृष्टिकोण अनुकूलित। चूहों से excised पूरे omental ऊतकों सफलतापूर्वक दूधिया धब्बों के साथ या गर्भाशय के कैंसर बातचीत का अध्ययन करने के लिए पूर्व vivo सुसंस्कृत हैं। SKOV3ip.1-GFP कोशिकाओं पूर्व vivo सुसंस्कृत omental ऊतकों पर वरीयता प्राप्त और 6 घंटा की अवधि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया। GFP पॉजिटिव फ्लोरोसेंट कोशिकाओं दोनों पूर्व vivo में और vivo में विचारशील foci में दिखाई दे रहे थे (चित्रा 4 क)। दोनों शर्तों के तहत, एच एंड ई धुंधला का उपयोग ऊतकीय सत्यापन दूधिया स्पॉट (चित्रा 4 बी) को कैंसर सेल स्थानीयकरण की पुष्टि की। कैंसर कोशिकाओं के लिए cytokeratin दाग का उपयोग कर पुष्टि दाग दूधिया स्पॉट (चित्रा 4C) के भीतर कैंसर सेल foci की उपस्थिति देखी गई। इन आंकड़ों से पूर्व vivo उपयोग की व्यवहार्यता इन विवो निष्कर्षों पूरक करने के लिए तंत्र-आधारित अध्ययन के लिए दृष्टिकोण प्रदर्शित करता है।

चित्र 1
चित्रा 1. मुख्य पेरिटोनियल वसा डिपो के रिश्तेदार स्थानों और संरचनाओं। (ए) पेरिटोनियल वसा के पांच प्राथमिक स्रोतों में से चार के रिश्तेदार स्थान दिखा सकल शारीरिक विच्छेदन। वपा (ओम; उल्लिखित), जननांगों वसा (GF), गर्भाशय वसा (यूएफ), अन्त्रपेशी(मेरा), अंडाशय (ov), गर्भाशय सींग (उह), और छोटी आंतों (एसआई) दिखाए जाते हैं (बी) Splenoportal वसा (सपा, उल्लिखित)। संदंश के साथ तिल्ली उठाने से अवगत कराया (सी) दिखाया माउस वपा विच्छेदित। दृश्य में सुधार करने के लिए अग्न्याशय से मुक्त: डी। सापेक्ष आकार और excised पेरिटोनियल वसा की संरचनाओं; अन्त्रपेशी mesenteric जड़ से जुड़ी दिखाया गया है। दूधिया स्पॉट (ए) adipocytes की उपस्थिति के लिए पेरिटोनियल वसा की ई histologic मूल्यांकन, (एमएस) दूधिया जगह है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
Omental ऊतक में दूधिया स्पॉट बढ़ाता के लिए 2. Giemsa आधारित दृष्टिकोण चित्रा। (ए); Giemsa साथ दाग पूरी वपा की धारा की छवि। द्वारा मूल्यांकन omental ऊतक के सीरियल वर्गों: (बी) Giemsa धुंधला; दूधिया स्पॉट काला तीर के साथ संकेत कर रहे हैं (सी) एच एंड ई धुंधला। और, (डी) आईएचसी दूधिया मौके ढांचे के भीतर लिम्फोसाइट की पहचान करने के लिए विरोधी CD45 एंटीबॉडी का उपयोग। पैमाने पर पट्टी बी.डी. के लिए ही है और 100 माइक्रोन को दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. ओवेरियन कैंसर की कोशिकाओं को रियायत के दूधिया स्थलों में शामिल है कि पेरिटोनियल वसा उपनिवेश। प्रवाह cytometric ID8- के 7 डीपीआई पर वपा (ओम) चूहों से काटा, गर्भाशय वसा (यूएफ), जननांगों वसा (GF), और अन्त्रपेशी (मेरा) का विश्लेषण करती है tdTomato कोशिकाओं (बाएं)। डेटा प्रस्तुत कर रहे हैंपीबीएस इंजेक्शन चूहों (दाएं) से अधिक tdTomato-postive कोशिकाओं के गुना परिवर्तन वृद्धि के रूप में। त्रुटि सलाखों का मतलब की मानक त्रुटि का संकेत। ** दोनों मानक ऊतक विज्ञान द्वारा ऊतकों (बी) परीक्षा। पीबीएस नियंत्रण की तुलना में पी <0.01 अर्थ और आईएचसी वपा और (नग्न चूहों में 1x10 6 SKOV3ip.1 कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद) splenoportal वसा दोनों में दूधिया स्थलों में से तुलनीय उपनिवेशन से पता चलता है। धारा एच एंड ई धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया गया। उपकला की उपस्थिति घावों के भीतर (कैंसर) कोशिकाओं को एक अखिल cytokeratin (अखिल सी.के.) एंटीबॉडी का उपयोग cytokeratin के आईएचसी पता लगाने के द्वारा पुष्टि की गई। अखिल cytokeratin के लिए एक आईजीजी निर्धारण एंटीबॉडी का उपयोग आईएचसी विशिष्टता धुंधला करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। पैमाने बार सभी छवियों के लिए ही है और 100 माइक्रोन अर्थ। 7 डीपीआई पर C57BL / 6 चूहों में पेरिटोनियल वसा डिपो की ID8 या गर्भाशय के कैंसर उपनिवेशन (सी) मूल्यांकन। क्लिक करेंयहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 4
डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं की चित्रा 4. पूर्व vivo उपनिवेशन omentum करने के लिए। कॉलम भोले omenta (बाएं) 1 एक्स 10 6 SKOV3ip.1 कोशिकाओं की, चूहों से omenta 6 घंटे बाद आईपी इंजेक्शन (बीच में) दिखा तीन प्रयोगात्मक शर्तों की तुलना प्रतिनिधित्व और SKOV3ip.1-GFP के साथ omenta पूर्व vivo की स्थिति (दाएं) के तहत उपनिवेश। Omenta (पूर्व vivo लगाव) पूर्व vivo संस्कृति की स्थिति में SKOV3ip.1 GFP के द्वारा उपनिवेश में विवो परख (विवो में लगाव) या omenta से SKOV3ip.1 GFP के द्वारा उपनिवेश (रिक्त) भोले omenta। GFP के लिए पूरे omenta की प्रतिदीप्ति इमेजिंग (ए) विवो और पूर्व vivo assays के दोनों के लिए समान उपनिवेशन पैटर्न से पता चलता है। के धारावाहिक वर्गों के एच एंड ई धुंधलापैनल से omenta दूधिया स्पॉट (बी) के लिए स्थानीय कैंसर की कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि। डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं के लिए Cytokeratin एच ई धुंधला (सी) पुष्टि की। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रचारित कोशिकाओं को लक्षित करने के उपचारों के विकास मेटास्टेटिक उपनिवेशवाद की एक यंत्रवत समझ, पेरिटोनियल रोग के विकास में महत्वपूर्ण पहला कदम की आवश्यकता है। हम वपा का अनूठा ऊतक संरचना और वास्तुकला या गर्भाशय के कैंसर मेटास्टेटिक उपनिवेशन को बढ़ावा देने के कैसे विचार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता दृष्टिकोण है कि रिपोर्ट में इन मुद्दों का समाधान करने के लिए। हमारे दृष्टिकोण का भेद विशेषताएं हैं: औपनिवेशीकरण की प्रक्रिया में जल्दी घटनाओं पर 1) फोकस; दूधिया स्पाट युक्त और कमी वसा डिपो का 2) की तुलना; 3) एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक की उपलब्धता के ऊतकों में दूधिया मौके मात्रा quantitate करने के लिए; विवो पूर्व vivo में पूरक और 4) उपलब्धता दूधिया मौके संरचनाओं के डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका बसाना का मूल्यांकन करने के लिए दृष्टिकोण।

इन अध्ययनों के संचालन में हम जांचकर्ताओं अक्सर माउस वपा के स्थान और सपा के अस्तित्व के बारे में पता कर रहे हैं एहसास के लिए आया थादूधिया मौके युक्त पेरिटोनियल वसा का एक दूसरा स्रोत के रूप में कार्य करता है जो lenoportal वसा बैंड,। वर्णित तकनीकों के साथ साथ मेटास्टेटिक उपनिवेशन में कदम की पढ़ाई सक्षम हैं, वे केवल इन प्रक्रियाओं के "स्नैपशॉट", और नहीं वास्तविक समय में उपनिवेशवाद का आकलन करते हैं। उचित रूप से पालन करते हैं, के रूप में वर्णित प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं की एक श्रृंखला के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम चाहिए। इन तकनीकों की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं: 1) की पहचान करना और फ्लो से प्राप्त मात्रात्मक डेटा तिरछा जाएगा अन्य प्रकार के ऊतकों द्वारा संदूषण के रूप में विशिष्ट पेरिटोनियल वसा ऊतकों बाहर विदारक; और 2) प्रश्न में अध्ययन के लिए ट्रांसजेनिक चूहों की उचित उपभेदों को लागू करने। यह समय के पाठ्यक्रम की पढ़ाई व्यक्तिगत सेल लाइनों के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए कि ध्यान दिया जाना चाहिए। अनुभव से यह प्रसार दर, ट्यूमर ले और मेटास्टेटिक संभावित करने के लिए समय सहित कारकों की एक किस्म पर निर्भर करता है।

Intera विदारक के अलावामेटास्टेसिस गठन के लिए महत्वपूर्ण हैं कि अच्छी तरह से स्थापित डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइनों और उनके omental microenvironment के ctions, यहाँ बताया तकनीक भी तरल ट्यूबल अंतःउपकला कार्सिनोमा में जल्दी आणविक परिवर्तन पुनरावृत्ति कि चिकित्सकीय व्युत्पन्न सेल लाइनों की घातक क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता फैलोपियन ट्यूब 12-17 की fimbriae। इन घावों की आणविक प्रगति के लिए एक मार्ग में उभर रहा है हालांकि, vivo अध्ययन में विशिष्ट परिवर्तन के जैविक महत्व को निर्धारित करने की जरूरत है। विवो और पूर्व vivo assays में पूरक जानकारी चिकित्सीय परिकल्पना की पीढ़ी और आगे preclinical अध्ययन के डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है अध्ययनों से बटोरा इस तरह के मॉडल अग्रदूत सेल लाइनों से omental ऊतक के मेटास्टेटिक उपनिवेशन में विशेष कदम का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

मेटास्टेटिक बसाना है कि नियंत्रण की पहचान तंत्र रोकथाम सक्षम हो सकता हैया मेटास्टेसिस गठन का नियंत्रण। उदाहरण के लिए, या गर्भाशय के कैंसर 18-22 के विकास के लिए खतरा बढ़ जाता है, जो महिलाओं के लिए (यानी, बीआरसीए 1 या बीआरसीए 2 जीन उत्परिवर्तन वाहक) अक्सर पेरिटोनियल रोग 23,24 के विकास के जोखिम को कम करने के रोगनिरोधी salpingo-oophorectomy गुज़रना पड़ता है। दुर्भाग्य से, रोगियों को अक्सर अभी भी कारण वपा और सर्जरी के समय में अन्य मेटास्टेटिक साइटों के भीतर मौजूद डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं के परिणाम को HGSC का विकास। वपा भीतर कैंसर सेल स्थानीयकरण और / या विकास को रोकने सकता omental ऊतक microenvironment बाधित कि एजेंटों की पहचान। इस तरह के दृष्टिकोण संभावित मेटास्टेसिस गठन को रोकने या (शल्य debulking के बाद) कैंसर पुनर्वृद्धि को दबाने के लिए या गर्भाशय के कैंसर की कोशिकाओं को लक्षित है कि चिकित्सकीय एजेंटों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection Tools Fine Science Tools NA
Geimsa Fluka/Sigma Aldrich 48900
5% Formalin Sigma HT501320
DMEM Corning 10-013-CV
Trypsin Gibco 25200-056
PBS Corning 21-040-CV Without calcium and Magnesium
26 gauge needle BD 329652
BSA Sigma A7906
Collagenase Worthington LS004196
Stomacher Seward Labsystems Stomacher 80 Biomaster
Microstomacher bag Stomacher Lab Systems BA6040/Micro
ACK Lysis Buffer Gibco A10492-01
Millicell culture plate insert Millipore PICM01250
Cell-Tak Corning 354240

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References

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चिकित्सा अंक 104 दूधिया धब्बे वपा डिम्बग्रंथि के कैंसर पेरिटोनियल वसा प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस मेटास्टेटिक उपनिवेशन
<em>विवो</em> और <em>पूर्व</em> vivo पेरिटोनियल वसा में दूधिया स्पॉट संरचनाएं की डिम्बग्रंथि के कैंसर Metastatic औपनिवेशीकरण अध्ययन के लिए दृष्टिकोण <em>में</em>
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Krishnan, V., Clark, R., Chekmareva, M., Johnson, A., George, S., Shaw, P., Seewaldt, V., Rinker-Schaeffer, C. In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose. J. Vis. Exp. (104), e52721, doi:10.3791/52721 (2015).

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