Abstract
Высококачественная серозный рак яичников (HGSC), причиной распространенных перитонеального метастазов, по-прежнему имеет чрезвычайно плохой прогноз; меньше, чем 30% женщин живы через 5 лет после постановки диагноза. Сальник является предпочтительным местом формирования HGSC метастазов. Несмотря на клиническое значение этого микросреды, вклад сальника жировой ткани яичников прогрессии рака остается недостаточно изученной. Сальника жировой необычна тем, что она содержит структуры, известные как белесые пятна, которые состоят из B, T, и NK-клеток, макрофагов и клеток-предшественников, окружающих плотные гнезда сосудов. Белесые пятна играют ключевую роль в физиологических функций сальника, которые необходимы для перитонеального гомеостаза. Мы показали, что белесые пятна также способствовать рака яичников метастатического колонизации перитонеального жировой, ключевой шаг в развитии перитонеальных метастазов. Здесь мы опишем подходы мы разработали, чтобы оценить и количественно белесые пятна в заitoneal жировой и изучать их функциональное вклад в яичников клеток рака метастатического колонизации сальника тканей и в естественных условиях и экс естественных условиях. Эти подходы к обобщению дополнительные модели мыши и клеточные линии, что позволяет изучение формирования метастазов рака яичников от первоначального локализации клеток в молочных местная структур к развитию распространенных перитонеального метастазов.
Introduction
В отличие от большинства солидных опухолей, метастазов из высококачественной серозного рака яичников (HGSC) ограничены в брюшную полость 1. Таким образом, эффективные методы лечения перитонеального потенциально может контролировать или искоренить HGSC. В настоящее время стандарт терапевтический подход хирургического циторедукции в комбинации с химиотерапией 1-3. К сожалению, подавляющее большинство пациентов испытывают и поддаваться осложнений рецидива заболевания. Эти мрачные статистические данные показывают, необходимость в улучшении понимания метастатического колонизации, процесс, посредством которого раковые клетки локализуются в, использовать и размножаться в тканях хозяина, чтобы сформировать метастазы 2.
Сальник является предпочтительным рано сайт HGSC метастазов 4-7. В отличие от других перитонеального жировой, сальниковой жировой ткани содержит необычные иммунные структуры, известные как белесые пятна, которые содержат B, T, и NK-клеток и макрофагов, которые играют ключевую роль в перитонеальных homeosТАСИС 8,9. В дополнение к их физиологических функций, мы обнаружили, что белесые пятна играют активную роль в метастатическим раком яичников колонизации 4. В экспериментальных метастазов анализов, SKOV3ip.1, CaOV3 и HeyA8 (человека) и ID8 (мышиного; C57BL / 6) клеток рака яичников быстро домой, чтобы белесые пятна, предполагая, что клетки движутся к секретируемого хемотаксиса фактора. Интересно, что раковые клетки не заселяют перитонеальный жировой хватает белесые пятна (то есть, гонадных и матки жир) 4.
Для того, чтобы определить механизмы, регулирующие молочный пятна колонизации, мы оптимизировали модели ксенотрансплантатов, которые позволяют допрос клеточных и молекулярных событий в течение времени, конечно метастатического колонизации 4. Конкретный преимущество подходов, описанных в настоящем документе, его акцент на архитектуре и функции тканей, что позволяет пользователям проверять гипотезы в полностью интегрирована в естественных условиях и бывших естественных модели мetastatic колонизация 4,10. Сравнивая локализации раковых клеток и рост в перитонеальных жировых депо, которые либо содержат или отсутствие белесые пятна, исследователи могут проверить относительный вклад (ы) адипоцитов и клеток в молочных пятен на жилье и прогрессивного роста клеток рака яичников в физиологически соответствующих тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все мыши были размещены, поддерживается и эвтаназии в соответствии с Уходу за животными и использование комитета (IACUC) руководящих принципов и под контролем Университета Чикаго ресурсного центра животных.
1. Подготовка Животные для экспериментальных исследований
- Разрешить животных, чтобы акклиматизироваться к новым корпусом и окружающей среды, чтобы оправиться от потенциальных физиологических эффектов транспортировки и обработки.
Примечание: следующая методика применима для всех коммерчески доступных линий мышей. Количество животных, которые будут использоваться для эксперимента зависит от дизайна исследования и должно быть сделано с консультации с статистиком.
2. Выявление и изоляция перитонеального жировых депо.
- Эвтаназии животных через СО 2 передозировки и вторичного физического метода, чтобы подтвердить смерть.
- Как уборочных брюшины жировых депо составляет внутреннюю извлечение органов (вторичный метод), мАке срединный разрез близко к паховой сосочков через брюшную стенку в подвергать внутренние органы (рис 1а).
- Для сальниковой жира (OM), подвергать сальниковой / поджелудочной комплекс путем расширения селезенки из брюшной полости щипцами (рис 1c). Отпустите сальник из поджелудочной железы и селезенки, внимательно обрезки все соединения тканей. Убедитесь, что все оставшиеся ткани поджелудочной железы вырезали 4.
- Для гонадных жиров (GF), использовать пинцет, чтобы поднять гонадная жир, окружающий яичники и акциз от резки соединений ткани (1А верхнего Рог T) 4.
- Для матки жиров (UF), использовать пинцет, чтобы поднять матки жир, окружающий рога матки и акциз от резки ткани соединений (рис 1А нижний правый) 4.
- Для брыжеечных жир (MF), вырезать соединение между тонкой кишки и привратника. Используйте пинцет, чтобы твердо сцепление свободный конецтонком кишечнике, и медленно "корки", что от брыжеечной жира. Отпустите брыжеечной жир из брыжеечной корня с помощью ножницы рассекает (1А нижний левый) 4.
- Для Splenoportal жир (SF), снять дистальный конец селезенки с помощью щипцов, чтобы обнажить тонкую жирную полосу ткани, соединяющий воротах селезенки поджелудочной железы. Вырежьте splenoportal жир сначала выпуская его из поджелудочной железы, а затем тщательно анализируя его из селезенки (рис 1B) 4.
3. Млечный Пятно Идентификация Используя Giemsa окрашивания
- Акцизный omenta (обратитесь к шагу 2.3) от мышей C57BL / 6 и зафиксировать в 5% -ном нейтральном забуференном формалине при 4 ° С в течение 16 ч (O / N).
- Для парафин фиксированной ткани, выбрать форму, подходящую для размера ткани. Налейте расплавленного парафина с парафиновым резервуара заполнить форму. Откройте кассету и с помощью теплой длябелых грибов, передавать ткани в форму.
- Тщательно ориентироваться тканей во время парафин для производства продольные разрезы. Поместите надписью кассету тканей над формования и прессы твердо на месте. Дайте форме остыть, по крайней мере 30 мин.
- Вырезать серийных срезов (толщиной 4 мкм) из фиксированных формалином парафиновых (FFPE) ткани блока. Поставьте предварительно очищенные слайд по разделам, как лента ткани отрывается парафинового блока.
- Серийно раздел весь сальник; собирать и окрашивать каждый третий раздел Гимза (см 3.6). Разрешить стекло с секциях высохнуть на воздухе, предпочтительно О / Н при комнатной температуре. Сушеные слайды готовы для фиксации. Пятно первый раздел гематоксилином и эозином для сравнений Гимза окрашенных слайдов.
- Deparaffinize слайды двумя последовательными 5 мин инкубации в ксилолы. Увлажняет слайды двух последовательных инкубации в следующем: 100% этанола, 95% этанола, и, наконец, нажмите ватер.
- Примите соответствующие меры предосторожности, чтобы избежать слайды из сушки. Выполните все шаги при комнатной температуре.
- Полностью погрузить слайды в банку Коплин, содержащей 5% раствор Giemsa (вес / объем полученного в водопроводной воде) и инкубируют в течение 4 мин при комнатной температуре. Промыть слайды в водопроводной воде в течение 60 сек, воздух сухой и крепление с помощью крепежных покровного средства массовой информации.
- Изображение окрашенные слайды, используя сканер слайдов Всего и процесс с производителем программного обеспечения. Количественно молочный объем место в Гимза окрашенных сальника разделы, используя ImageJ программного обеспечения 4.
4. Распространение и подготовка яичников раковых клеток для В естественных условиях и бывших естественных условиях Исследования
- Предварительно теплые 15 мл среды для роста клеток на 37 ° С в термостате. Подготовка соответствующего размера культуре ткани колбу (например, 75 см площадь 2 поверхности) по маркировке с именем клеточной линии, номер пассажа, дату и лица, составившего замороженные акции, и датаи человек, который тает / покрытие клетки.
Примечание: В исследованиях метастазов например детальная информация имеет решающее значение, так как дата замораживания вниз и числом пассажей может повлиять на метастатический фенотип. - Использование стерильной среде биологической безопасности, капот пипетки 10 мл среды в колбе для культивирования Т-75. Снимите флакон клеток из системы жидкого азота и проверьте, чтобы подтвердить тип клеток. Оттепель только один флакон клеток, в то время, нагревая в 37 ° C тепла ванне.
- Использование стерильных, пипетка 1x10 6 талой клетки в культуре колбу. Колбу помещают в инкубатор, чтобы позволить клеткам прикрепляться. Осторожно покачайте фляжку с образованием однородной суспензии клеток.
- Поместите колбу в инкубаторе тканевых культур и поддерживать при температуре 37 ° С в 5% СО 2 окружающей среды. Разрешить клетки придерживаться O / N.
- Аспирируйте СМИ, и заменить свежим подогретого СМИ роста. Колбу помещают в инкубатор и всеOW клеткам расти. Монитор роста ежедневно визуальным осмотром клеток каждые 2-3 дня использованием инвертированного микроскопа. Используйте стандартные методы культивирования клеток к прохождению клеток при достижении 70-80% слияния.
Примечание: Для экспериментальные анализы сбора клеток в 70% слияния, чтобы обеспечить, что клетки активно пролиферирующих. - Аспирируйте культуральную среду и промыть 10 мл стерильной фосфатным буферным раствором (PBS). Аспирируйте PBS и добавить 0,25% трипсин / ЭДТА (от 2 до 3 мл на 75 см 2 площади в поверхности) и инкубировать 5 мин при 37 ° С. Визуально подтверждают, что клетки были отключены, и добавляют равный объем среды для роста, и осторожно пипеткой клетки вверх и вниз, чтобы получить суспензию отдельных клеток.
Примечание: Очень важно, что питательная среда содержит сыворотку, как это инактивирует трипсин. Подготовьте по крайней мере, от 2 до 4 раз больше клеток, чем количество, необходимое для данного эксперимента, чтобы компенсировать потерю клеток в процессе последующих этапов - Определить процент жизнеспособных клеток вподвеска с помощью трипанового синего анализе с использованием гемацитометра или автоматизированный счетчик клеток.
Примечание: Здесь следует использовать только клеточные препараты, в которых ≥ 96% клеток жизнеспособными. - Передача клеточной суспензии из колбы в 50 мл коническую пробирку. Пелле клеток путем центрифугирования 5 мин при 1100 мкг при 4 ° С.
- Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в PBS до концентрации 2х10 6 клеток на мл.
5. Внутрибрюшинное инъекции клеток
Примечание: В наших экспериментах мыши обрабатываются в ламинарном потоке воздуха или биобезопасности кабинета в нашем барьера объекта для того, чтобы ограничить риск воздействия патогена, Для того, чтобы продемонстрировать эту технику ясно, что процедуры в сопровождающей видео проводились в лаборатории, утвержденной для животных работы. Данный метод не требует, чтобы животные под наркозом. Под утвержденных протоколов, выполнить эту Techniqие на живых животных. Используйте соответствующие штаммы мышей в данном исследовании. Например: используйте иммунитетом, бестимусных голых мышей для изучения человеческой раковой клетки яичников (SKOV3ip.1 и HeyA8) колонизация; использовать иммунокомпетентных мышей C57BL / 6 для изучения мыши клеток рака яичников (ID8) колонизации.
- Нагрузка 500 мкл суспензии отдельных клеток в шприц и поставить в стерильной ограничен 25 G иглы. Это снижает клеточную сдвиг до инъекции.
- Выберите мышь вверх по шиворот и удерживайте хвост, используя ладонь и указательный палец и закрепите левую заднюю ногу между кольцом и мизинца (когда мышь сдержанной с левой стороны).
Примечание: Чтобы избежать травмирующее психологическое органов брюшной полости, сдерживать мышь хорошо, так что он не может двигаться во время инъекции. - Представьте себе линию поперек живота чуть выше колен, и найдите точку на правой стороне животного, недалеко от средней линии. Точка входа в краниально к медиальной и слегкапоследнего соска.
Примечание: Вставка иглу на правой стороне мыши избегает слепой кишки и снижает риск прокола кишечника 11. - Вставьте иглу в нижней боковой области живота мышей, чтобы глубине примерно 0,5 см. Потяните на поршень, чтобы подтвердить, что игла не проникла в кровеносный сосуд или другие органы брюшины.
- Если какая-либо жидкость отсасывают отбросить шприц (и образец) 11. Зеленовато-коричневый или желтый аспирации указывает проникновение иглы в кишечник или мочевой пузырь, соответственно.
- Вводите пробу с помощью медленно, постоянное давление. Вывод иглу и вернуть мышь в клетку. Не надевайте шприц перед утилизацией в контейнер для острых предметов.
- Жертва мышей через СО 2 удушья и жизненной изъятия органов в определенных временных точках после инъекции.
6. Млечный место колонизация В естественных условиях
- Количественно онние раковых клеток локализации в белесые пятна с помощью проточной цитометрии
- Изолировать перитонеальные тучные склады от мышей (как описано в шаге 2.3 - 2.7) вводили флуоресцентно помеченные раковые клетки и непосредственные места ткани в ледяном PBS.
- Для данного метода, вес матча все жировая ткани жирные к сальника. Передача ткани, чтобы отделить 5 мл пробирки, содержащие 1,5 мл бессывороточной среды DMEM и 0,1% (вес / объем) бычьего сывороточного альбумина. Бассейн ткани, полученные из трех независимых мышей, чтобы обеспечить достаточный выход клеток для проточной цитометрии.
- Mince тканей с использованием хирургических ножниц и добавить 1,5 мл бессывороточной среды DMEM, содержащей 0,4% (вес / объем) коллагеназы И. Инкубируйте суспензии ткани при 37 ° С в течение 30 мин с перемешиванием вращения.
- В качестве необязательной стадии, дополнительно отделить от ткани жевания. В этом случае, передача ткани коллагеназы суспензии в microstomacher мешок, жевать в течение 10 мин на низкой, вращая ориентациюмешков через 5 мин.
- Образцы фильтруют через фильтр из нейлона меш (60 мкм) пор, чтобы удалить большую мусора. Собирают клетки центрифугированием при 250 х г в течение 5 мин при 4 ° С и отбросить фракцию супернатанта.
- Ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл PBS в сочетании с 900 мкл буфера для лизиса АСК и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 мин. Центрифуга клетки при 250 мкг в течение 5 мин и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют осадок клеток в 250 мкл ледяной PBS. Фильтр образцы через нейлоновую сетку пор 60 мкм, чтобы обеспечить суспензии отдельных клеток. Промыть фильтр с 250 мкл охлажденного льдом PBS.
- Количественного определения количества флуоресцентно меченых клеток в популяции с использованием проточного цитометра, оснащенного 561 нм желто-зеленого лазера и 585 нм / 15 нм полосовой фильтр. Установите ворота для tdTomato-позитивных клеток на основе анализа родительских клеток и / или соответствующих отрицательных контролей 4.
- Количественное микроскопические и макроскопические метастазы
- В экспериментальной желаемой конечной точки (ов), изолировать и сразу же поставить тканей в соответствующей фиксирующей сред. Исправление больших образцов, таких как интактным половой железы, матки и брыжеечных жировых депо в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 48 ч при 4 ° С. Fix меньшие образцы (сальника и splenoportal жира, а также ткани эквиваленты матки и брыжейки жира) в 5% -ном нейтральном формалине с буфером при 4 ° С в течение 2-16 ч.
- Кроме того, оснастки заморозить ткани, помещая их в морозильной среде, такой как OCT, и упасть в соответствующем количестве жидкого азота.
- Передача не фиксируется на ткани 70% этанола и хранят при температуре 4 ° С до встраивания в парафин. Вставить и процесс ткани, как описано в 3.2 и 3.3.
- Использование Н & Е окрашенных раздел оценить тканей на наличие или отсутствие метастазов микроскопических (т.е. кластеры 50 клеток). Подтвердите тон наличие микроскопических метастазов по методу вторичного таких как пятна IHC для цитокератина 8/18 обнаружить клеток рака яичников.
- В экспериментальной желаемой конечной точки (ов), изолировать и сразу же поставить тканей в соответствующей фиксирующей сред. Исправление больших образцов, таких как интактным половой железы, матки и брыжеечных жировых депо в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 48 ч при 4 ° С. Fix меньшие образцы (сальника и splenoportal жира, а также ткани эквиваленты матки и брыжейки жира) в 5% -ном нейтральном формалине с буфером при 4 ° С в течение 2-16 ч.
7. Млечный пятна Колонизация Ex Vivo
- Создание основных бывших естественных условиях культивирования сальника органов
- Место каждого сальника в одном вставки пластины культуры и место в одну лунку планшета для культуры ткани двенадцать лунку, содержащую 500 мкл DME / F12 среды, содержащей 20% FCS. Поддержание культуры органов при 37 ° С в 5% СО 2 окружающей среды в течение 24 ч 48 и / или дополнительных временных точках. Используйте три независимых omenta (три образца) для каждого условия (например, тип носителя / время точки).
- Для подтверждения целостности тканей в экспериментальных конечных точек, исправить и технологические образцы, как описано в шаге 3. Подсчет здоровым против некротических адипоцитов на H & E разделов могут оценить целостность тканей. Минимум ~ 120 клетки5 биологические образцы требуется сформулировать процент живой ткани настоящего 10.
- Для измерения функции ткани, место omenta (N = 3) в отдельных лунках 24-луночного планшета, содержащую 500 мкл DME / F12 с 20 средах% FCS. Разрешить omenta в состояние СМИ в 37 ° С в 5% СО 2 окружающей среды в течение 24 ч, а затем удалить 250 мкл для использования в IL-6 ELISA анализе 10.
- Экс естественных совместное культивирование сальника мыши с SKOV3ip.1-GFP клеток
- Расти и подготовить флуоресцентно помеченные клетки, как описано в разделе 4 и ресуспендируют в концентрации 2 × 10 6 клеток на мл.
- Применение ~ 6 мкл тканевого адгезива на мембране культуры вставки и позволяют ему высохнуть на воздухе. Промыть мембрану дважды стерильной водой для удаления излишнего клея. Воздух сухой мембраны под капотом ламинарного.
- Тщательно акцизного omenta и приложите его к покрытой адгезивом MembRane с помощью стерильного пинцета. Дайте ткани прилипать к мембране в течение 1 мин перед добавлением носителя. Добавить 500 мкл клеточной суспензии в верхней части каждой сальника в каждой культуре вставки. Заполните область вокруг Transwell камеры с 2,5 мл DME / F-12 10.
- Инкубируйте omenta с клеточной суспензии в течение 6 ч при 37 ° С в 5% СО 2 среде. Осторожно снимите и вымойте omenta с ~ 10 мл PBS. Представьте флуоресцентный очаги раковых клеток с помощью соответствующего флуоресцентного системы визуализации 10.
- Изолировать перитонеальные тучные склады от мышей (как описано в шаге 2.3 - 2.7) вводили флуоресцентно помеченные раковые клетки и непосредственные места ткани в ледяном PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Идентификация и гистологического исследования перитонеального жировых депо
Полная анатомическая рассечение позволяет идентифицировать четыре из пяти основных источников перитонеального жира (рис 1А). Грузоперевозки по часовой стрелке от верхнего центра являются: сальник (ОМ; изложены), расположенный на животе и селезенки, от гонадо жира (ГФ), окружающей левый яичник (ов), матки жира (UF), прикрепленный к рогах матки (мм) и брыжейки (МОИ), прикрепленный к тонкой кишке (Si). Завязь (ов), рога матки (мм), и тонкой кишки (SI) обозначаются как точки отсчета. Splenoportal жира (ИП) окружает селезеночной артерии и соединяет воротах селезенки к целиакии артерии (рис 1B). Наконец, сальник прикреплен к желудка и поджелудочной железы (рис 1c). Валовая структура и относительный размер этих тканей показано на рисунке 1D. Гистологического исследования гое ткани показывает, что splenoportal и сальниковой жира содержат молочные пятна [мс] структуры на ткани периферии, в окружении адипоцитов [А]; матки, половые железы, и брыжеечные жира нет (рис 1E).
Млечный идентификация место с помощью окрашивания Giemsa
Чтобы включить сравнение общего молочного содержания пятна между различными штаммами мыши, молочно объема спот и области настоящего в индивидуальном omenta количественно, используя новый метод. Как описано в Methods, "цифровой вся гора" в omenta была построена путем окрашивания каждый третий участок ткани в 5% -ном растворе Гимза и захвата изображения, окрашенных тканей в (фиг.2А). Белесые пятна появляются как регионы окрашивания темно-синий (рис 2B). Идентичность этих регионах, как белесые пятна было подтверждено в серийных срезах обеих H & E окрашивания и IHC для клеток положительных для CD45, общего лимфоцитов маркера (
Количественная и качественная оценка рака колонизации сальника
Способ цитометрии на основе потока была разработана для того, для количественного определения количества раковых клеток, присутствующих в жировой депо после внутрибрюшинного введения. Этот протокол особенно полезен для изучения первые шаги колонизации метастатического процесса. Например, на фиг.3А, ID8-tdTomato клетки получали и вводили внутрибрюшинно в мышей C57BL / 6. Через 7 дней после инъекции (точек на дюйм), из жировой ткани забирали органы и диссоциированных в одной клеточной суспензии, как описано в Методике. Количество tdTomato CEзаполняет количественно с помощью проточной цитометрии (3А, слева). Сальник показали примерно 12-кратное увеличение числа tdTomato-позитивных событий, по отношению к PBS-инъекции управления (рис 3а, справа), но не было значительное увеличение в клеточных препаратов из гонадного жира, матки жира, или брыжейки , Дополнительный качественный подход IHC основе также показали, что через 7 дней после внутрибрюшинной инъекции SKOV3ip.1 клеток, сравнимые повреждения клеток рака наблюдались и в сальниковой и splenoportal жира (рис 3B). IHC для человека пан-цитокератина (пан-CK) подтверждает наличие раковых клеток в пределах Млечного пятен. Специфика окрашивания IHC подтвердили с помощью IgG контроль за пан-цитокератина антитела (рис 3B). ID8 рак яичника колонизация перитонеальных жировых депо оценивали с использованием мышей C57BL / 6 на 7 дюйм. Большие повреждения клеток рака в Млечном пятен как сальника и splenoportal жира вневыстроились. Небольшие скопления раковых клеток были иногда видели в других жировых депо, как показано на вставке панели. Таким образом, можно получить доступ как относительное количество и расположение клеток в данной ткани.
Экс естественных анализ для изучения рака яичников колонизации молочных пятен
Для того, чтобы преодолеть ограничения условий в естественных условиях, сохраняя при этом состав ткани и архитектуры, мы оптимизировали экс естественных условиях подход к изучению рака яичников клеток колонизации сальника тканей. Целые сальника ткани вырезали из мышей успешно культивируют экс естественных условиях для изучения взаимодействия яичников рака с белесые пятна. SKOV3ip.1-GFP клетки высевали на исключая виво культивируемых тканей сальника и выдерживают при 37 ° С в течение 6 ч. GFP-положительных клеток флуоресцентные были видны в сдержанный очагов в обоих экс естественных условиях и в естественных условиях (4А). В рамках обоих условий, гистологическое подтверждение с помощью Н & E окрашивание подтвердил локализацию раковых клеток к белесые пятна (рис 4б). Подтверждающие пятна с помощью Цитокератин пятно для раковых клеток показали присутствие раковых клеток очагов в пределах Млечного пятен (фиг.4С). Эти данные демонстрируют возможность использования естественных экс подходит для исследований механизма на основе дополнять результаты в естественных условиях.
Рисунок 1. Относительные места и сооружения основных перитонеальных жировой депо. (А) Полная анатомическая рассечение показывает относительное местоположение четырех из пяти основных источников перитонеального жира. Сальник (ОМ; изложены), половые железы жира (GF), маточное жира (UF), брыжейки(МОИ), яичников (ов), рога матки (э) и тонкий кишечник (SI) показаны (B) Splenoportal жира (SP; изложены). Воздействию путем подъема селезенки щипцами (С) Сальник мыши показали расчленены. свободной от поджелудочной железы, чтобы улучшить визуализацию. D: Относительные размеры и структуры вырезанной перитонеального жира; брыжейки показано прикреплен к брыжеечной корня. Е. гистологической оценки перитонеального жира на наличие пятен молочно (А) адипоцитов (МС) молочно место. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок подход Гимза основе 2. Для количественной оценки белесые пятна в сальниковой ткани. (А); Изображение части всей сальника окрашенных Гимза. Серийные срезы ткани сальника оцениваются: окрашивание (Б); Гимза белесые пятна указаны с черными стрелками (С) Н & Е окрашивание. и (D) IHC с использованием анти-CD45 антитела для выявления лимфоцитов в пределах структуры молочной месте. Шкалы то же самое для BD и обозначает 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. клеток рака яичников преимущественно заселяют перитонеальный жир, который содержит молочные пятна. Цитометрии потока анализ сальника (OM), маточное жира (UF), половые железы жира (GF), и брыжейки (MY) собирают из мышей в 7 точек на дюйм в ID8- tdTomato клетки (слева). Данные представленыкак увеличение раз-изменение tdTomato-POSTIVE клеток над PBS-инъекции мышей (справа). Столбики ошибок указывают стандартное отклонение от среднего значения. ** Обозначает Р <0,01 по сравнению с контрольной PBS. (Б) Экспертиза тканей как в стандартном гистологии и IHC показывает сопоставимый колонизации молочных пятен в обоих сальника и splenoportal жира (после инъекции 1х10 6 клеток SKOV3ip.1 голым мышам). Срезы оценивали H & E окрашивания. Наличие эпителиальных (раковые) клетки в пределах поражений подтверждается обнаружением IHC в цитокератина использованием пан-Цитокератин (пан-CK) антитела. IHC, используя антитело IgG изотипов для пан-цитокератином был использован в качестве контроля для окрашивания специфичность. Шкалы является одинаковым для всех изображений и обозначает 100 мкм. (С) Оценка ID8 рака яичников колонизации перитонеальных жировых депо в C57BL / 6 мышей на 7 точек на дюйм. Пожалуйста, нажмитездесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Экс естественных колонизации клеток рака яичников в сальник. Столбцы представляют собой сравнение трех экспериментальных условиях, показывая наивное omenta (слева), omenta от мышей 6 ч после IP инъекции 1 х 10 6 клеток SKOV3ip.1 (в центре) и omenta с SKOV3ip.1-GFP колонизировали под бывших естественных условиях (справа). Наивный omenta (Бланк), omenta колонизирована SKOV3ip.1-GFP из анализа в естественных условиях (приложение в естественных условиях) или omenta колонизирована SKOV3ip.1-GFP в Экс Vivo условиях культивирования (приложение экс естественных условиях). Флуоресценции визуализации всей omenta для GFP показывает аналогичную колонизации шаблон для как в естественных условиях и бывших естественных условиях анализов (А). Н & Е окрашивание серийные срезыomenta от панели А подтверждает наличие раковых клеток, локализованных в молочных пятен (B). Цитокератин для клеток рака яичников подтверждает окрашивание H & E (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Разработка терапии для целевой ячейки, распространяемых требует механическое понимание метастатического колонизации, критический первый шаг в развитии перитонеального болезни. Для решения этих проблем мы фиксировали подходы, которые могут быть использованы для различить, как уникальный состав ткани сальника и архитектура способствовать рака яичников метастатического колонизации. Отличительные особенности нашего подхода являются: 1) акцент на ранних событий в процессе колонизации; 2) сравнение молочно местная содержащих и дефицитом жировой депо; 3) наличие воспроизводимым методом для количественного молочный объем пятна в тканях; 4) наличие дополняют в естественных условиях и экс естественных подходов к оценке яичников раковых клеток колонизации молочных местная структур.
При проведении этих исследований мы пришли к пониманию, что следователи часто не знают о месте сальника мыши и существование СПlenoportal жира группа, которая служит в качестве второго источника молочного пятна, содержащие перитонеального жира. Хотя описанные здесь методы позволяют исследования шагов в метастатической колонизации, они только предлагают "моментальные снимки" этих процессов, а не оценки колонизации в режиме реального времени. Если последовал надлежащим образом, протоколы, как описано должно дать воспроизводимые результаты в диапазоне исследователей. Важнейшее значение для успеха этих методов являются: 1) выявление и рассечения брюшины конкретные жировой ткани, как загрязнения других типов тканей будет исказить количественные данные, полученные из потока цитометрии; и 2) Реализация соответствующих штаммов трансгенных мышей для изучения в вопросе. Следует отметить, что временные программа обучения должны быть определены для отдельных клеточных линий. Эмпирически, поскольку она зависит от множества факторов, включая скорость распространения, время, чтобы взять опухоли и метастатического потенциала.
В дополнение к рассекает Интераctions из хорошо известных рака яичников клеточных линий и их сальниковой микросреды, которые важны для образования метастазов, способ, описанный здесь, также могут быть использованы для оценки злокачественного потенциала клинически полученных клеточных линий, которые воспроизводят ранние молекулярные изменения в серозные трубной интраэпителиальной карциномы в бахромка маточных труб 12-17. Хотя путь для молекулярной прогрессии этих поражений становится, в естественных условиях исследования необходимы, чтобы определить биологическое значение конкретных изменений. Дополнительные в естественных условиях и бывших естественных условиях анализов могут быть использованы для оценки конкретных шагов в метастатической колонизации сальниковой ткани от таких клеточных линий модель-предшественник информации, полученной из исследований может быть ключом к генерации гипотез терапевтических и дизайна дальнейших доклинических исследований.
Определение механизмы, которые контролируют метастатического колонизации может позволить профилактикиили контроль образования метастазов. Например, женщины, которые подвергаются повышенному риску развития рака яичников 18-22 (т.е. генов BRCA1 или BRCA2 мутации перевозчики) часто подвергаются профилактическое удаление придатков матки, чтобы уменьшить риск развития болезни брюшины 23,24. К сожалению, пациенты часто еще разработать HGSC из-за разрастания клеток рака яичников, присутствующих в сальнике и других метастазов на момент операции. Идентификация агентов, которые разрушают ткани сальника микроокружение может предотвратить локализацию раковых клеток и / или роста внутри сальника. Такие подходы потенциально могут быть использованы в сочетании с терапевтическими агентами, которые нацелены клеток рака яичников, чтобы предотвратить образование метастаз рака или подавлять отрастание (после хирургического циторедукция).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | NA | |
| Geimsa | Fluka/Sigma Aldrich | 48900 | |
| 5% Formalin | Sigma | HT501320 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | Without calcium and Magnesium |
| 26 gauge needle | BD | 329652 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| Stomacher | Seward Labsystems | Stomacher 80 Biomaster | |
| Microstomacher bag | Stomacher Lab Systems | BA6040/Micro | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 |
References
- Bast, R. C., Hennessy, B., Mills, G. B. The biology of ovarian cancer: new opportunities for translation. Nature Reviews Cancer. 9 (6), 415-428 (2009).
- Bowtell, D. D. L. The genesis and evolution of high-grade serous ovarian cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (11), 803-808 (2010).
- Colgan, T. J., Chang, M. C. Chapter 18 Familial Cancer and Prophylactic Surgery. Diagnostic Pathology of Ovarian Tumors. , 277-288 (2011).
- Clark, R., et al. Milky Spots Promote Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Peritoneal Adipose in Experimental Models. The American Journal of Pathology. 183 (2), 576-591 (2013).
- Platell, C., Cooper, D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C.
- Hagiwara, A., et al. Milky spots as the implantation site for malignant cells in peritoneal dissemination in mice. Cancer Research. 53 (3), 687-692 (1993).
- Gerber, S. A., et al. Preferential Attachment of Peritoneal Tumor Metastases to Omental Immune Aggregates and Possible Role of a Unique Vascular Microenvironment in Metastatic Survival and Growth. The American Journal of Pathology. 169 (5), 1739-1752 (2010).
- Liebermann-Meffert, D. The greater omentum. Anatomy, embryology, and surgical applications. The Surgical Clinics of North America. 80 (1), 275-293 (2000).
- Collins, D., Hogan, A. M., O’Shea, D., Winter, D. C. The Omentum: Anatomical, Metabolic, and Surgical Aspects. Journal of Gastrointestinal Surgery. 13 (6), 1138-1146 (2009).
- Khan, S. M., et al. In vitro metastatic colonization of human ovarian cancer cells to the omentum. Clinical, & Experimental Metastasis. 27 (3), 185-196 (2010).
- Shimizu, S. Routes of Administration. The Laboratory Mouse. Hans, H. , Academic Press. 527-542 (2004).
- Vang, R., Shih, I. -M., Kurman, R. J. Fallopian tube precursors of ovarian low- and high-grade serous neoplasms. Histopathology. 62 (1), 44-58 (2012).
- Folkins, A. K., Jarboe, E. A., Roh, M. H., Crum, C. P. Precursors to pelvic serous carcinoma and their clinical implications. Gynecologic Oncology. 113 (3), 391-396 (2009).
- Li, J., Fadare, O., Xiang, L., Kong, B., Zheng, W. Ovarian serous carcinoma: recent concepts on its origin and carcinogenesis. Journal of Hematology, & Oncology. 5 (1), 8 (2012).
- Kurman, R. J., Shih, I. -M. The origin and pathogenesis of epithelial ovarian cancer: a proposed unifying theory. The American Journal Of Surgical Pathology. 34 (3), 433-443 (2010).
- Crum, C. P., et al. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Current Opinion In Obstetrics, & Gynecology. 19 (1), 3-9 (2007).
- Crum, C. P., et al. Lessons from BRCA: The Tubal Fimbria Emerges as an Origin for Pelvic Serous Cancer. Clinical Medicine, & Research. 5 (1), 35-44 (2007).
- Foulkes, W. D., Narod, S. A. Ovarian cancer risk and family history. The Lancet. 349, 878 (1997).
- Antoniou, A., et al. Average Risks of Breast and Ovarian Cancer Associated with BRCA1 or BRCA2 Mutations Detected in Case Series Unselected for Family History: A Combined Analysis of 22 Studies. The American Journal of Human Genetics. 72 (5), 1117-1130 (2003).
- King, M. -C., Marks, J. H., Mandell, J. B. New York Breast Cancer Study Group Breast and ovarian cancer risks due to inherited mutations in BRCA1 and BRCA2. Science. 302 (5645), 643-646 (2003).
- Kjær Krüger, S., Gayther, S. Ovarian cancer and genetic susceptibility in relation to the BRCA1 and BRCA2 genes. Occurrence, clinical importance and intervention. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 85 (1), 93-105 (2006).
- Easton, D. F., Ford, D., Bishop, D. T. Breast and ovarian cancer incidence in BRCA1-mutation carriers. Breast Cancer Linkage Consortium. American Journal of Human Genetics. 56 (1), 265-271 (1995).
- Rebbeck, T. R., et al. Prophylactic Oophorectomy in Carriers of BRCA1or BRCA2Mutations. New England Journal of Medicine. 346 (21), 1616-1622 (2002).
- Olivier, R. I., et al. Clinical outcome of prophylactic oophorectomy in BRCA1/BRCA2 mutation carriers and events during follow-up. British Journal Of Cancer. 90 (8), 1492-1497 (2004).
