In vivo och ex vivo Approaches att studera äggstockscancer Metastatisk Colonization av Milky Spot Structures i Peritoneal Fett
Summary
We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.
Abstract
Högkvalitativ serös äggstockscancer (HGSC), fortsätter orsaken till omfattande peritoneala metastaser att ha en extremt dålig prognos; mindre än 30% av kvinnorna lever 5 år efter diagnosen. Omentum är en föredragen plats för HGSC metastasbildning. Trots den kliniska betydelsen av denna mikro förblir understudied bidrag omental fettvävnad till äggstockscancer progression. Omental adipose är ovanligt att den innehåller strukturer som kallas mjölkaktiga fläckar, som består av B, T och NK-celler, makrofager, och progenitorceller kring täta bon kärl. Mjölkaktiga fläckar spelar en nyckelroll i de fysiologiska funktioner omentum, som krävs för peritoneal homeostas. Vi har visat att mjölkaktiga fläckar också främja äggstockscancer metastaserad koloniseringen av peritoneal fettvävnad, ett viktigt steg i utvecklingen av peritoneala metastaser. Här beskriver vi de metoder vi utvecklat för att utvärdera och kvantifiera mjölkaktiga fläckar i peritoneal adipös och studera deras funktionella bidrag till äggstockscancercell metastaserad kolonisering av omental vävnad både in vivo och ex vivo. Dessa metoder är generaliserbart till ytterligare musmodeller och cellinjer, vilket möjliggör studier av äggstockscancer metastasbildning från initial lokalisering av celler till milky spotstrukturer för utvecklingen av omfattande peritoneala metastaser.
Introduction
Till skillnad från de flesta fasta tumörer, är metastaser från höggradig serös äggstockscancer (HGSC) begränsad till bukhålan 1. Således kan effektiva peritoneala terapier eventuellt kontrollera eller utrota HGSC. För närvarande är en vanlig terapeutisk metod kirurgisk cytoreduktion kombination med kemoterapi 1-3. Tyvärr, de allra flesta patienter upplever och duka under för komplikationer av återfall i sjukdomen. Dessa dystra statistik visar på behovet av ökad förståelse av metastaserad kolonisering, den process genom vilken cancerceller lokalisera till utnyttja och föröka sig i värdvävnader för att bilda metastaser 2.
Omentum är en föredragen tidig platsen HGSC metastasering 4-7. Till skillnad från andra peritoneal fettvävnad, innehåller omental fettvävnad ovanliga immun strukturer som kallas mjölkaktiga fläckar, som innehåller B, T och NK-celler och makrofager, som spelar nyckelroller i peritoneala homeostasis 8,9. Förutom deras fysiologiska funktioner, fann vi att mjölkaktiga fläckar spelar en aktiv roll i äggstockscancer metastaserad kolonisering 4. I experimentella metastas analyser, SKOV3ip.1, CaOV3 och HeyA8 (human) och ID8 (mus, C57BL / 6) äggstockscancerceller snabbt hem till mjölkaktiga fläckar, vilket tyder på att cellerna är på väg mot ett utsöndrat kemotaktisk faktor. Intressant, gör cancercellerna inte kolonisera peritoneal adipose saknar mjölkaktiga fläckar (dvs. gonad och livmoder fett) 4.
För att identifiera mekanismer som reglerar mjölk plats kolonisation, har vi optimerat xenograft-modeller som möjliggör förhör av cellulära och molekylära händelser under tidsförloppet av metastaserad kolonisering 4. En särskild fördel med de metoder som beskrivs här är dess betoning på vävnad arkitektur och funktion, som gör det möjligt för användare att testa hypoteser i helt integrerad in vivo och ex vivo-modeller av metastatic kolonisering 4,10. Genom att jämföra cancercellernas lokalisering och tillväxt i peritoneala fettdepåer som antingen innehåller eller saknar mjölkaktiga fläckar, kan utredarna testa det relativa bidraget (s) i adipocyter och celler inom mjölkaktiga fläckar till logi och progressiv tillväxt av äggstockscancerceller i fysiologiskt relevanta vävnader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utveckling av terapier för att rikta sprids celler kräver en mekanistisk förståelse av metastaser kolonisering, det kritiska första steget i utvecklingen av peritoneala sjukdomen. För att möta dessa frågor som vi rapporterar metoder som kan användas för att urskilja hur omentum unika kroppskonstitution och arkitektur främja äggstockscancer metastaserad kolonisering. Utmärkande för vår strategi är: 1) fokus på tidiga händelser i koloniseringen processen; 2) jämförelse av mjölkpunkt innehåll…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by grants from the Department of Defense (W81XWH-09-1-0127), the NIH (2-R01-CA089569), the Elsa U. Pardee Foundation, a Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research Pilot Study Award, and generous philanthropic support from Section of Urology and Section of Research in the Department of Surgery, University of Chicago.
Materials
| Dissection Tools | Fine Science Tools | NA | |
| Geimsa | Fluka/Sigma Aldrich | 48900 | |
| 5% Formalin | Sigma | HT501320 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | Without calcium and Magnesium |
| 26 gauge needle | BD | 329652 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| Stomacher | Seward Labsystems | Stomacher 80 Biomaster | |
| Microstomacher bag | Stomacher Lab Systems | BA6040/Micro | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 | |
| Cell-Tak | BD | 354240 |
References
- Bast, R. C., Hennessy, B., Mills, G. B. The biology of ovarian cancer: new opportunities for translation. Nature Reviews Cancer. 9 (6), 415-428 (2009).
- Bowtell, D. D. L. The genesis and evolution of high-grade serous ovarian cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (11), 803-808 (2010).
- Colgan, T. J., Chang, M. C. Chapter 18 Familial Cancer and Prophylactic Surgery. Diagnostic Pathology of Ovarian Tumors. , 277-288 (2011).
- Clark, R., et al. Milky Spots Promote Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Peritoneal Adipose in Experimental Models. The American Journal of Pathology. 183 (2), 576-591 (2013).
- Platell, C., Cooper, D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. The omentum. World Journal Of Gastroenterology: WJG. 6 (2), 169-176 (2000).
- Hagiwara, A., et al. Milky spots as the implantation site for malignant cells in peritoneal dissemination in mice. Cancer Research. 53 (3), 687-692 (1993).
- Gerber, S. A., et al. Preferential Attachment of Peritoneal Tumor Metastases to Omental Immune Aggregates and Possible Role of a Unique Vascular Microenvironment in Metastatic Survival and Growth. The American Journal of Pathology. 169 (5), 1739-1752 (2010).
- Liebermann-Meffert, D. The greater omentum. Anatomy, embryology, and surgical applications. The Surgical Clinics of North America. 80 (1), 275-293 (2000).
- Collins, D., Hogan, A. M., O’Shea, D., Winter, D. C. The Omentum: Anatomical, Metabolic, and Surgical Aspects. Journal of Gastrointestinal Surgery. 13 (6), 1138-1146 (2009).
- Khan, S. M., et al. In vitro metastatic colonization of human ovarian cancer cells to the omentum. Clinical, & Experimental Metastasis. 27 (3), 185-196 (2010).
- Shimizu, S., Hans, H. Routes of Administration. The Laboratory Mouse. , 527-542 (2004).
- Vang, R., Shih, I. -. M., Kurman, R. J. Fallopian tube precursors of ovarian low- and high-grade serous neoplasms. Histopathology. 62 (1), 44-58 (2012).
- Folkins, A. K., Jarboe, E. A., Roh, M. H., Crum, C. P. Precursors to pelvic serous carcinoma and their clinical implications. Gynecologic Oncology. 113 (3), 391-396 (2009).
- Li, J., Fadare, O., Xiang, L., Kong, B., Zheng, W. Ovarian serous carcinoma: recent concepts on its origin and carcinogenesis. Journal of Hematology, & Oncology. 5 (1), 8 (2012).
- Kurman, R. J., Shih, I. -. M. The origin and pathogenesis of epithelial ovarian cancer: a proposed unifying theory. The American Journal Of Surgical Pathology. 34 (3), 433-443 (2010).
- Crum, C. P., et al. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Current Opinion In Obstetrics, & Gynecology. 19 (1), 3-9 (2007).
- Crum, C. P., et al. Lessons from BRCA: The Tubal Fimbria Emerges as an Origin for Pelvic Serous Cancer. Clinical Medicine, & Research. 5 (1), 35-44 (2007).
- Foulkes, W. D., Narod, S. A. Ovarian cancer risk and family history. The Lancet. 349, 878 (1997).
- Antoniou, A., et al. Average Risks of Breast and Ovarian Cancer Associated with BRCA1 or BRCA2 Mutations Detected in Case Series Unselected for Family History: A Combined Analysis of 22 Studies. The American Journal of Human Genetics. 72 (5), 1117-1130 (2003).
- King, M. -. C., Marks, J. H., Mandell, J. B. New York Breast Cancer Study Group Breast and ovarian cancer risks due to inherited mutations in BRCA1 and BRCA2. Science. 302 (5645), 643-646 (2003).
- Kjær Krüger, S., Gayther, S. Ovarian cancer and genetic susceptibility in relation to the BRCA1 and BRCA2 genes. Occurrence, clinical importance and intervention. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 85 (1), 93-105 (2006).
- Easton, D. F., Ford, D., Bishop, D. T. Breast and ovarian cancer incidence in BRCA1-mutation carriers. Breast Cancer Linkage Consortium. American Journal of Human Genetics. 56 (1), 265-271 (1995).
- Rebbeck, T. R., et al. Prophylactic Oophorectomy in Carriers of BRCA1or BRCA2Mutations. New England Journal of Medicine. 346 (21), 1616-1622 (2002).
- Olivier, R. I., et al. Clinical outcome of prophylactic oophorectomy in BRCA1/BRCA2 mutation carriers and events during follow-up. British Journal Of Cancer. 90 (8), 1492-1497 (2004).
