Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Vivo ve Ex Vivo Periton yağ içinde Samanyolu Nokta Yapıların Yumurtalık Kanseri Metastatik Kolonizasyon Eğitim Yaklaşımlar içinde

Published: October 14, 2015 doi: 10.3791/52721
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 4, 4,5, 1
1Section of Urology, Department of Surgery, The University of Chicago, 2Department of Pathology, Robert Wood Johnson Medical School, 3Campbell Family Institute for Breast Cancer Research, Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network, 4Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, Campbell Family Institute for Breast Cancer Research, Princess Margaret Cancer Centre, University of Toronto, University Health Network, 5Departments of Medicine, Pharmacology, and Cancer Biology, Duke University Medical Center

Abstract

Yüksek dereceli seröz over kanseri (HGSC), yaygın periton metastazı nedeni, son derece kötü prognoz devam eder; Kadınların% 30'dan azının 5 yıl teşhisten sonra hayatta. Omentum HGSC metastaz oluşumunun tercih edilen bir edilir. Bu mikro-klinik önemine rağmen, yumurtalık kanseri ilerlemesine omental adipoz dokudan katkısı örüntüsü oldukça kalır. Bu damar yoğun yuvalar çevreleyen süt B, T oluşmaktadır noktalar, ve NK hücreleri, makrofajlar ve projenitör hücreleri olarak bilinen yapılar içeren, omental adipoz olağan değildir. Sütlü noktalar periton homeostazı için gerekli olan omentum fizyolojik fonksiyonları, önemli bir rol oynamaktadır. Bu süt noktalar da periton adipoz yumurtalık kanseri, metastatik kolonizasyonunu periton metastaz gelişimini önemli bir adım teşvik göstermiştir. Burada yaklaşımlar biz değerlendirmek ve başına sütlü noktalar ölçmek için geliştirilen açıklamakadipoz itoneal ve in vivo ve ex vivo hem de omental doku yumurtalık kanseri hücresi metastatik kolonizasyon işlevsel katkı çalışma. Bu yaklaşımlar, böylece yaygın periton metastazı gelişimine sütlü nokta yapılarına hücrelerin ilk lokalizasyonu yumurtalık kanseri metastazı oluşumu çalışma sağlayan, fare modelleri ve hücre hatları ek genelleştirilebilir.

Introduction

En katı tümörlerin aksine, yüksek dereceli seröz yumurtalık kanseri (HGSC) için metastazlar periton boşluğuna 1 ile sınırlıdır. Böylece, etkili periton tedaviler potansiyel kontrol etmek veya ortadan kaldırmak HGSC olabilir. Şu anda, standart bir tedavi yaklaşımı kemoterapi 1-3 ile kombine cerrahi sitoredüksiyon olduğunu. Ne yazık ki, hastaların büyük çoğunluğu deneyim ve hastalığın tekrarlama komplikasyonlara yenik. Bu kasvetli istatistikler metastatik kolonizasyon geliştirilmiş anlayış ihtiyacını göstermek, süreç hangi kanser hücreleri, kullanmak ve metastaz 2 oluşturmak için konak dokuları içinde çoğalmaya lokalize.

Omentum metastazı HGSC 4-7 tercih edilen erken bir sitedir. Diğer periton adipoz aksine, omentum yağ dokusu, periton homeos kilit rol oynayan B, T ve NK hücreleri ve makrofajlar bulunur sütlü noktalar, olarak bilinen sıradışı bağışıklık yapıları içeriyortasis 8,9. Fizyolojik fonksiyonlara ek olarak, süt noktalar, yumurtalık kanseri, metastatik kolonizasyon 4 aktif bir rol oynadığı bulunmuştur. Hızlı ana süt noktalar yumurtalık kanser hücreleri, salgılanan bir kemotaktik faktör doğru hareket ettiğini göstermektedir; deneysel metastaz tahlilleri, SKOV3ip.1, CaOV3 ve HeyA8 (insan) ve ID8 (C57BL / 6 fare) kullanılmaktadır. İlginçtir, kanser hücreleri sütlü noktalar (yani, gonad ve rahim yağ) 4 eksik periton adipoz kolonize yok.

Sütlü nokta kolonizasyonu düzenleyen mekanizmaları belirlemek amacıyla, biz metastatik kolonizasyon 4 süresi boyunca hücresel ve moleküler olayların sorgulama sağlayan ksenogref modellerini optimize ettik. Bu tarifnamede tarif edilen yaklaşımların özel bir avantajı, tam olarak, in vivo olarak entegre edilmiştir ve m ex vivo modeller kullanıcıların hipotezleri test sağlayan doku mimarisi ve işlevi üzerinde vurgulamasıdıretastatic kolonizasyon 4,10. Içeren veya sütlü noktalar eksikliği ya periton yağ depolarında kanser hücre lokalizasyonu ve büyümeyi karşılaştırarak, araştırmacılar arasında ve fizyolojik ilgili dokularda yumurtalık kanseri hücrelerinin ilerleyici büyüme için sütlü noktalar içinde adipositlerde ve hücrelerin göreceli katkısını (ler) test edebilirsiniz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm fareler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönergelerine ve Chicago Hayvan Kaynak Merkezi'nde Üniversitesi gözetiminde göre, muhafaza korunur ve ötenazi uygulandı.

Deneysel Çalışmalar 1. hazırlanması Hayvanlar

  1. Hayvanlar taşıma ve kullanım potansiyeli fizyolojik etkilerinden kurtarmak için, yeni konut ve çevre gelmesini bekleyin.
    Not: Aşağıdaki tekniğin tüm fareler ticari olarak temin edilebilir suşlar için de geçerlidir. Bir deney için kullanılan hayvanların sayısı, çalışma tasarımına bağlıdır ve istatistik gelen istişare ile yapılmalıdır.

2. Kimlik ve Periton Fat Depolarında İzolasyonu.

  1. CO 2 doz aşımı ve ölüm onaylamak için ikincil bir fiziksel yöntemle hayvanların Euthanize.
  2. Hasat periton yağ deposu olarak iç organ çıkarılması (ikincil yöntemi), anne oluşturmaktadırke iç organları (Şekil 1A) ortaya çıkarmak için periton duvar üzerinden kasık papilla yakın bir orta hat kesi.
  3. Omentum Fat (OM) için, forseps (Şekil 1C) ile periton boşluğuna gelen dalak uzatarak omental / pankreas kompleksi açığa. Yakından doku bağlantıları kırparak pankreas ve dalak omentum bırakın. Kalan pankreas dokusu 4 eksize emin olun.
  4. Gonadal Fat (GF) için, doku bağlantıları (Şekil 1A üst righ t) 4 keserek yumurtalıklar ve rüsumat çevreleyen gonadal yağ kaldırmak için forseps kullanabilir.
  5. Rahim Fat (UF) için, doku bağlantıları keserek rahim boynuzları ve rüsumat çevreleyen rahim yağ kaldırmak için forseps kullanabilir (Şekil 1A sağ alt) 4.
  6. Mezenterik Fat (MF) için, ince bağırsak ve pilor arasındaki kavşak kesti. Forseps sıkıca kavrama serbest ucunu için kullanınince bağırsak ve uzak mezenterik yağ yavaş yavaş "soyma". Diseksiyon makas kullanarak mezenterik kökünden mezenterik yağ bırakın (Şekil 1A sol alt) 4.
  7. Splenoportal Fat (SF) için, pankreas dalak hilusu bağlayan doku ince yağlı bandı ortaya çıkarmak için forseps kullanarak dalak distal ucunu kaldırın. İlk dalak onu diseksiyon dikkatlice ardından pankreas onu bırakmadan tarafından splenoportal yağ tüketim (Şekil 1B) 4..

Giemsa boyanması Kullanılması 3. Sütlü Nokta Kimlik

  1. Tüketim omenta C57BL / 6 farelerinden alınan ve 16 saat süre ile 4 ° C'de (O / N)% 5 nötr tamponlu formalin içinde çözmek (2.3 adım bakınız).
  2. Sabit doku gömme parafin için, doku boyutu için uygun olan bir kalıbın seçin. Kalıbı doldurmak için parafin hazneden erimiş parafin dökün. Kaseti açın ve sıcak kullanmaAk, kalıp içine doku aktarın.
    1. Dikkatle uzunlamasına bölümleri üretmek için gömme parafin sırasında dokuları yönlendirin. Sıkıca yerinde kalıp ve basın üzerinde etiketli doku kasetini yerleştirin. Kalıp en az 30 dakika soğumasını bekleyin.
  3. Formalin ile fikse parafin gömülü (FFPE) doku blok uzaklıkta (4 mikron kalınlığında) seri kesitler kesin. Doku şerit parafin bloğu kapalı geliyor gibi bölümlere altında önceden temizlenir slayt yerleştirin.
  4. Seri bölüm tüm omentum; toplamak ve Giemsa (3.6 bakınız) her üçüncü bölümü leke. Oda sıcaklığında O / N, tercihen hava ile kurumaya bölümleri ile cam slayt izin verir. Kurutulmuş slaytlar sabitlenmesi için hazırız. Giemsa lekeli slaytlar karşılaştırmalar için hematoksilen ve eozin ilk bölümü Leke.
  5. Kisilenler iki ardışık 5 dk inkubasyon tarafından slaytlar Deparaffinize. Aşağıdaki iki sıralı inkubasyon slaytlar rehidrate:% 100 etanol,% 95 etanol ve son olarak da wa dokununter.
    1. Kurutma slaytları önlemek için gerekli önlemleri alın. Oda sıcaklığında tüm adımları uygulayın.
  6. Tamamen% 5 Giemsa çözeltisi ihtiva eden bir Coplin kavanoza slaytlar daldırın ve oda sıcaklığında 4 dakika boyunca inkübe (musluk suyu hazırlanan a / h). Hava-kuru, 60 saniye musluk suyunda slaytlar durulayın ve montaj medyayı kullanarak lamel ile monte edin.
  7. Görüntü üretici yazılımı ile Tüm Slayt Tarayıcı ve işlem kullanılarak boyandı slaytlar. ImageJ yazılımı kullanarak 4 Giemsa lekeli omental bölümlerde sütlü nokta hacmini ölçmek.

İn vivo ve in vivo çalışmalar için Ex Yumurtalık Kanseri Hücreleri 4. Yayılım ve Hazırlama

  1. Bir ısı banyosu içinde 37 ° C hücre büyüme ortamının önceden sıcak 15 mi. Hücre hattı, geçit numara, tarih ve dondurulmuş stok hazırlayan kişinin adı ve tarih ile etiketleme uygun boyutta doku kültürü şişesi (örneğin, 75 cm 2 yüzey alanı) hazırlayınve kişinin hücreleri kaplama / çözülme kim.
    Not: Aşağı donma ve geçit sayısının tarihi metastatik fenotip etkileyebilir olarak metastaz çalışmalarda böyle ayrıntılı bilgi çok önemlidir.
  2. Biyolojik güvenlik kabini, bir pipet, T-75 kültür şişesi içine 10 ml ortamda steril bir ortam kullanılması. Sıvı azot sisteminden hücrelerin bir şişe çıkarın ve hücre tipini onaylamak için etiketi kontrol edin. 37 ° C ısıya banyosunda ısıtılarak bir zamanda hücrelerin sadece bir şişe çözülme.
  3. Steril tekniği kullanarak, pipet 1x10 6 kültür şişesi içine hücreleri çözülmüş. Hücreler takmak için izin inkübatör şişeyi yerleştirin. Yavaşça düzgün bir hücre süspansiyonu oluşturmak için ileri ve geri şişeyi sallayın.
    1. Doku kültürü inkübatöründe içine yerleştirilir ve CO2 ortamında% 5 37 ° C'da koruyun. Hücreler O / N uymak için izin verin.
  4. Aspire medya ve taze önceden ısıtılmış büyüme ortamı ile değiştirin. Kuvöz ve tüm şişeyi koyunow hücreleri büyümek. Devrik bir mikroskop kullanarak her 2-3 günde bir görsel kontrol ile günlük olarak, hücre büyümesini izlemek. % 70-80 izdiham ulaştıktan sonra geçiş hücreleri standart hücre kültürü teknikleri kullanın.
    Not: Deneysel analizler hücreler aktif çoğalan emin olmak için% 70 izdiham hücreleri hasat için.
  5. Kültür ortamı aspire ve steril fosfat tamponlu tuzlu su içinde 10 ml (PBS) ile durulayın. PBS aspire ve% 0.25 tripsin / EDTA (75 cm 2 yüzey alanı için 2 ila 3 ml) ekleyin ve 37 ° C 'de 5 dakika inkübe edilir. Görme hücreler müstakil teyit ve büyüme ortamı eşit hacimde ekleyin ve hafifçe tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için yukarı ve aşağı hücreleri pipetle.
    Not: It tripsin inaktive gibi büyüme ortamı serumu içeren önemlidir. Sonraki adımları sırasında hücre kaybını telafi etmek için verilen bir deney için gerekli olan sayıdan daha fazla hücreler 4 kat en az 2- hazırlanın
  6. Yaşayabilir hücrelerin yüzdesini belirlemekHemasitometre veya otomatik bir hücre sayacı tripan mavi dışlama tahlili ile süspansiyon.
    Not: Burada, sadece hücre ≥% 96 uygulanabilir olduğu hücre preparatları kullanılır.
  7. Bir 50 ml konik bir tüp şişeye hücre süspansiyonu aktarın. 4 o C'de, 1100 x g'de 5 dakika santrifüj Pelet hücreleri
  8. Süpernatant aspire ve ml başına 2x10 6 hücre bir konsantrasyona PBS içinde hücre pelletini.

Hücreleri 5. intraperitoneal enjeksiyon

Deneylerde, fareler açıkça bu tekniği göstermek için, patojen maruz kalma riskini sınırlamak amacıyla bizim bariyer tesis içinde laminer hava akımı ya da biyogüvenlik kabini işlenir, beraberindeki video prosedürleri onaylı bir laboratuarda yapılmıştır: Not Hayvan çalışmaları için. Bu tekniğin anestezi altında hayvanlara gerektirmez. Onaylanmış protokoller kapsamında, bu TECHNIQ gerçekleştirmekCanlı hayvanlar üzerinde ue. Bu çalışma için, farelerin ilgili suşlarının kullanın. Örneğin: insan yumurtalık kanseri hücresinin (SKOV3ip.1 ve HeyA8) kolonizasyonu çalışması için immün sistemi baskılanmış, atimik çıplak farelerin kullanın; Fare yumurtalık kanseri hücreleri (ID8) kolonizasyon çalışma için, immunokompetan C57BL / 6 fareleri kullanır.

  1. Yük 500 şırıngaya tek bir hücre süspansiyonu ul ve steril kapaklı 25 G iğne koymak. Bu enjeksiyondan önce hücre kesme azaltır.
  2. Ensesinden fare Pick up ve palmiye ve işaret parmağı ile kuyruk tutun ve halka ve (fare sol el ile sınırlandığını) küçük parmak arasında sol arka bacak düzeltmek.
    Not: travmatik karın organları önlemek o enjeksiyon sırasında hareket edemez, böylece de fareyi dizginlemek için.
  3. Sadece dizlerinin üstünde karın üzerinde bir çizgi düşünün, ve hayvanın sağ tarafında bir noktayı bulmak ve orta hatta yakın. Giriş noktası için kranial ve biraz medialGeçen meme.
    Not: Farenin sağ tarafındaki iğneyi takma çekum önler ve bağırsak 11 delme riskini azaltır.
  4. Yaklaşık 0,5 cm derinliğe kadar farelerin karın alt yan bölgesinde iğne takın. İğne kan damarı ya da diğer organlara nüfuz periton olmadığını doğrulamak için pistonu geri çekin.
    1. Herhangi bir sıvı aspire edilirse şırınga (ve örnek) 11 atın. A-yeşilimsi kahverengi veya sarı aspirat sırasıyla bağırsak veya mesane içine iğne penetrasyonu gösterir.
  5. Yavaş, sabit bir basınç kullanarak örnek enjekte edilir. İğneyi geri çek ve kafes fare dönün. Kesici kapta atmadan önce şırıngayı tekrarlamak etmeyin.
  6. Belirli zaman noktalarında CO 2 boğulma ve hayati organ aracılığıyla Kurban fareler enjeksiyon sonrası.

In vivo 6. Sütlü nokta kolonizasyonu

  1. Quantitasütlü noktalar kanser hücresi lokalizasyonu yon akışı sitometri kullanılarak
    1. (Adım 2.3 anlatıldığı gibi - 2,7) farelerin periton yağ depoları yalıtmak floresan enjekte edilen buz gibi soğuk PBS kanser hücrelerini ve acil yer dokuları etiketledi.
      1. Bu özel tekniğin için, ağırlık-maç omentum tüm adipoz yağ dokuları. Aktarım dokular serumsuz DMEM 1.5 ml ve% 0.1 (w / v) sığır serum albümini içeren 5 ml tüpler ayırmak için. Üç bağımsız farelerden toplanan Havuz dokular akış sitometrisi için yeterli bir hücre verimi sağlamak.
    2. Cerrahi makas kullanılarak ekleyin kıyma dokular (w / v) kollajenaz I. dönme karıştırma ile 30 dakika için 37 ° C 'de doku süspansiyonu inkübe% 0.4 ihtiva eden serumsuz DMEM 1,5 mi.
      1. Tercihe bağlı bir adım olarak, daha da çiğnenmesi ile doku ilişkisini. Bu durumda, yönlendirme döner düşük üzerinde 10 dakika süreyle masticate bir microstomacher torbasına doku kolajenaz süspansiyonu transfer5 dakika sonra torba.
    3. Bir naylon örgü filtre (60 mikron gözenek) aracılığıyla filtre örnekleri büyük enkaz kaldırmak için. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj yoluyla hücreler toplamak ve süpernatan fraksiyonu atın.
    4. ACK lisiz tamponu 900 ul ile birlikte 100 ul PBS hücre pelletini ve 1 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. 250 x g'de santrifüjleyin hücreler 5 dakika süreyle tavlandı ve süpernatant atılır.
      1. Buz soğukluğunda PBS 250 ul hücre pelletini. Tek hücre süspansiyonu sağlamak için 60 mikron gözenek naylon örgü ile örnekler Filtre. Buz soğukluğunda PBS 250 ul ile durulayın.
    5. Sitometresi bir 561-nm sarı-yeşil lazer ile donatılmış bir akış ve 585 nm / 15 nm bant geçiren filtre kullanarak nüfusun floresan levhası 'hücre sayısını quantitate. Parental hücreler ve / veya uygun negatif kontroller 4 analizine dayanan tdTomato-pozitif hücreler için kapı ayarlayın.
    6. Mikroskobik ve makroskobik metastaz kantitasyonu
      1. İstenilen deneysel bitiş noktası (ler), izole ve hemen uygun sabitleme medyada dokuları yerleştirin. Örneğin sağlam gonadal, rahim ve 4 ° C'de 48 saat boyunca% 10 nötr tamponlu formalin içinde mezenterik yağ deposu olarak daha büyük bir numune, düzeltildi. 2-16 saat boyunca 4 ° C 'de% 5 nötral tamponlu formalin içine (rahim ve mezenterik yağ omental ve splenoportal yağ, ve doku eşdeğer) daha küçük örnekler düzeltildi.
        1. Alternatif olarak, çıtçıt OCT gibi bir dondurma ortamda koyarak dokuları dondurma ve sıvı azot uygun bir miktarda içine bırakın.
      2. Aktarım, parafin içine gömülmek kadar 4 ° C 'de% 70 etanol ve saklamak için dokuların sabit. 3.2 ve 3.3 açıklandığı gibi gömün ve süreç doku.
        1. Mikroskobik metastazları varlığında ya da yokluğunda dokuları değerlendirmek için H & E ile boyanmış bölümü kullanarak (örneğin, 50 hücre kümeleri). T onaylaböyle sitokeratin 8/18 için bir IHC leke olarak ikincil bir yöntem ile mikroskobik metastazlarının varlığı yumurtalık kanser hücrelerini tespit etmek.

    7. Sütlü Nokta Kolonizasyon Ex Vivo

    1. Temel ex vivo omental organ kültürü koşullarının oluşturulması
      1. % 20 FCS içeren DME / F12 ortamı, 500 ul ihtiva eden bir on-çukurlu doku kültürü plakasının bir oyuk içinde tek bir kültür plakası takılır ve her omentum yerleştirin. 24 ila 48 saat ve / veya ek bir zaman noktası için bir% 5 CO2 ortamında 37 ° C 'de, organ kültürleri koruyun. Her durumda (örneğin, ortam türü / zaman noktası) için üç bağımsız omenta (üçlü numuneler) kullanın.
      2. Doku bütünlüğünün değerlendirir H & E bölümlerinde nekrotik adipositler karşı sağlıklı Sayma Adım 3'te açıklandığı gibi düzeltmek ve süreç örnekleri, deneysel uç noktalar da dokuların bütünlüğünü doğrulamak için. Den en az ~ 120 hücre5 biyolojik örnekler 10, bu canlı doku yüzdesini formüle etmek gereklidir.
      3. Doku fonksiyonu,% 20 FCS ile DME / F12 ortamı, 500 ul ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka ayrı kuyularda yer omenta (n = 3) ölçmek. Omenta 24 saat boyunca bir% 5 CO2 ortamında 37 ° C 'de ortam koşullandırılması için izin verin ve daha sonra, bir IL-6, ELISA tahlilinde 10 kullanım için 250 ul çıkarın.
    2. SKOV3ip.1-GFP hücreleri ile fare omentum ex vivo ko-kültür
      1. Büyüme ve ml başına 2 x 10 6 hücre konsantrasyonunda bölüm 4 ve tekrar süspansiyon tarif edildiği gibi floresan etiketlendi hücrelerini hazırlamak.
      2. Kültür ucun zara doku yapıştırıcısı ~ 6 ul uygulayın ve hava ile kurumaya için izin verir. Herhangi bir aşırı yapıştırıcı kaldırmak için steril su ile iki kez zarı yıkayın. Hava laminar kaputun altında membranlar kurulayın.
      3. Dikkatle omenta tüketim ve yapışkan kaplı memb ekleyinrane steril forseps kullanılarak. Doku öncesinde medya ekleyerek 1 dakika zarının uymak için izin verin. Her kültür insert her omentum üstüne hücre süspansiyonu 500 ul ekleyin. DME / F-12 10 2,5 ml transwell odasının çevresini doldurun.
      4. % 5 CO2 ortamında 37 ° C 'de 6 saat süre ile hücre süspansiyonu ile omenta inkübe edin. Dikkatle çıkarın ve ~ 10 ml PBS ile omenta yıkayın. Uygun bir floresan görüntüleme sistemi 10 kullanılarak floresan kanser hücresi odaklar gözünüzde canlandırın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Periton Fat Depolarında Tanımlanması ve Histolojik İnceleme

Brüt anatomik diseksiyon periton yağ (Şekil 1A) beş başlıca kaynaklarından dört belirlenmesini sağlar. Üst merkezine saat yönünde hareket eden şunlardır: omentum (OM; özetlenen) (ah), sol yumurtalık (ov), rahim yağ (UF) rahim boynuzları bağlı çevreleyen mide ve dalak, gonadal yağ (GF) üzerinde bulunan ve mezenter (MY) ince bağırsağın (si) bağlı. Yumurtalık (ov), uterin boynuz (uh) ve ince bağırsak (si) referans noktaları olarak belirtilmiştir. Splenoportal yağ (SP) dalak arteri çevreleyen ve çölyak arter (Şekil 1B) dalak hilusu bağlar. Son olarak, omentum, mide ve pankreas (Şekil 1C) takılır. Bu dokuların brüt yapısı ve göreceli büyüklüğü Şekil 1D gösterilmiştir. Th histolojik incelemee dokular splenoportal ve omentum yağ adipositlerinde [A] çevrili doku çevresinde sütlü nokta [MS] yapıları içerdiğini göstermektedir; rahim, gonadal ve mezenterik yağ yok (Şekil 1E).

Giemsa boyanması kullanarak Milky nokta tespiti

Farklı fare suşları, sütlü nokta hacmi ve bireysel omenta mevcut alan arasında genel sütlü nokta içeriğinin karşılaştırma etkinleştirmek için yeni bir yöntem kullanılarak ölçüldü. Yöntemler bölümünde tarif edildiği gibi, omenta bir "sayısal bütün montaj"% 5 Giemsa çözeltisi doku her üçüncü bölümü boyama ve lekeli dokular (Şekil 2A) görüntülerini yakalamak oluşturulmuştur. Sütlü noktalar koyu mavi (Şekil 2B) boyama bölgeler olarak görünür. Sütlü noktalar olarak bu bölgelerin kimliği CD45, ortak lenfosit markeri (pozitif hücreler için hem H & E boyama ve İHK tarafından seri bölümlerde teyit edilmiştir et al 4'te tarif edildiği gibi, görüntü (Şekil 2A) toplandı ve daha sonra tek tek omenta sütlü bir nokta hacmi ve alanı hesaplamak için kullanılabilecek bir "sayısal bütün montaj" oluşturmak için işleme tabi tutuldu.

Omentumun kanser kolonizasyon Nicel ve nitel değerlendirme

Bir akış sitometri bazlı yöntem intraperitoneal enjeksiyondan sonra adipoz depolarına mevcut kanser hücrelerinin sayısını ölçmek üzere geliştirilmiştir. Bu protokol, metastaz erken kolonizasyon adımları incelemek için özellikle yararlıdır. Örneğin, Şekil 3A'da, ID8-tdTomato hücreleri hazırlandı ve C57BL / 6 farelerine intraperitoneal olarak enjekte edilmiştir. 7 gün sonra enjeksiyon (dpi) 'de, adipoz organları hasat edilmiştir ve Yöntemler bölümünde tarif edildiği gibi tek bir hücre süspansiyonu içine ayrışmış. TdTomato ce sayısılls akış sitometrisi kullanılarak ölçülmüştür (Şekil 3A, sol). Omentum tdTomato pozitif olayların sayısında yaklaşık 12 kat artış gösterdi PBS göre denetimleri (sağ Şekil 3A) enjekte ama gonadal yağ, rahim yağ veya mezenter hücre hazırlıkları anlamlı bir artış vardı . Tamamlayıcı niteliksel IHC-esaslı yaklaşım aynı zamanda 7 gün SKOV3ip.1 hücrelerinin ip enjeksiyonundan sonra, benzer kanser hücre lezyonları hem omentum ve splenoportal yağ (Şekil 3B) gözlenmiştir gösterdi. İHK İnsan pan-sitokeratin (pan-CK) için sütlü noktalar içinde kanser hücrelerinin varlığını doğrulamaktadır. IHC boyama spesifikliği pan-sitokeratin antikoru (Şekil 3B), bir IgG kontrol kullanılarak teyit edildi. Periton yağ depolarının ID8 yumurtalık kanseri kolonizasyon 7 dpi C57BL / 6 fareler kullanılarak değerlendirildi. Omentum ve splenoportal yağ hem de sütlü noktalar Büyük kanser hücre lezyonlar dışındakaplı. Panel Içerlek gösterildiği gibi kanser hücrelerinin Küçük kümeler bazen diğer yağ depolarında görüldü. Bu nedenle, tek bir belirli bir doku içinde nispi sayısını ve hücrelerin yerini hem de erişebilir.

Ex vivo deney sütlü noktalar yumurtalık kanseri kolonizasyon incelemek için

Doku bileşimi ve mimari korurken in vivo koşullarında kısıtlamalarını ortadan kaldırmak üzere amacıyla, omental doku yumurtalık kanseri hücre kolonizasyon incelemek için bir eks vivo yaklaşımı optimize edilmiştir. Farelerden eksize Tüm omentum dokular başarıyla sütlü noktalar ile yumurtalık kanseri etkileşimi incelemek için ex vivo kültüre bulunmaktadır. SKOV3ip.1-GFP hücreleri ex vivo kültürlenmiş omental dokusu üzerine ekilmiş ve 6 saat bir süre için 37 ° C 'de muhafaza edilmiştir. GFP-pozitif hücrelerinin her iki floresan ex vivo ve in vivo olarak gizli odaklarda görünür (Şekil 4A). Her iki durumda da altında, H & E boyama kullanan histolojik doğrulama süt noktalar (Şekil 4B) kanser hücresi yerini teyit etti. Kanser hücreleri için sitokeratin leke kullanılarak teyit leke süt noktalar (Şekil 4C) olan kanser hücre odakları varlığını göstermiştir. Bu veriler ex vivo kullanarak fizibilite in vivo bulgular daha da güzelleştirmek için mekanizma temelli çalışmalar yaklaşımları göstermektedir.

figür 1
Şekil 1. Ana periton yağ depoları göreli konumları ve yapıları. (A) periton yağ beş ana kaynaklarından dört nispi konumunu gösteren brüt anatomik diseksiyon. Omentum (OM; özetlenen), gonadal yağ (GF), rahim yağ (UF), mezenter(MY), yumurtalık (ov), rahim boynuzları (uh) ve ince bağırsak (si) gösterilmektedir (B) splenoportal yağ (SP; özetlenmiştir). Forseps ile dalak kaldırarak maruz (C) gösterilen fare omentum disseke. görselleştirme artırmak için pankreastan ücretsiz D:. Bağıl boyutları ve eksize periton yağ yapıları; mezenter mezenterik kök bağlı gösterilmiştir. Sütlü noktalar (A) adipositlerce varlığı periton yağ E. histolojik değerlendirilmesi, (MS) sütlü nokta. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Omentum dokusunda süt noktalar miktarının 2. Giemsa-temelli bir yaklaşım Şekil. (A); Giemsa ile boyanmış tam omentum bölümünün görüntüsü. Tarafından değerlendirilir omentum dokusunun Seri bölümler: (B) Giemsa boyama; sütlü noktalar siyah oklarla gösterilmiştir (C) H & E boyama.; ve (D) IHC sütlü bir nokta yapısı içinde lenfositlerin tespit etmek, anti-CD45 antikoru kullanılmıştır. Ölçek çubuğu BD için aynıdır ve 100 mikron göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. Yumurtalık kanseri hücreleri tercihen sütlü noktalar içeren periton yağ kolonize. Akış sitometrik ID8- 7 dpi omentum (OM) farelerden alınan hasat, rahim yağ (UF), gonadal yağ (GF) ve mezenter (MY) analizleri tdTomato hücreleri (solda). Veriler sunulmuşturPBS-enjekte edilen farelerin (sağ) üzerinden tdTomato-pozitif hücrelerin kat değişim arttıkça. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını gösterir. ** Hem standart histoloji dokuların (B) incelenmesi. PBS kontrollerine kıyasla, p <0.01 anlamına gelmektedir ve IHC omentum ve (Çıplak farelere 1x10 6 SKOV3ip.1 hücrelerin enjeksiyonundan sonra) splenoportal yağ hem sütlü noktalar benzer kolonizasyonu gösterir. Bölümler H & E boyama ile değerlendirildi. Epitelyal varlığı lezyonlarında (kanser) hücreler, bir Pan-sitokeratin (pan-CK) antikoru kullanılarak sitokeratin IHC tespiti ile teyit edilmiştir. Pan-sitokeratin, bir IgG izotip antikor kullanılarak IHC özgüllük boyama için bir kontrol olarak kullanıldı. Ölçek çubuğu tüm görüntüler için aynıdır ve 100 mikron göstermektedir. 7 dpi C57BL / 6 farelerinde periton yağ depolarının ID8 yumurtalık kanseri kolonizasyon (C) değerlendirilmesi. TıklayınızBurada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.

Şekil 4,
Yumurtalık kanseri hücrelerinin Şekil 4. ex vivo kolonizasyon omentuma. Sütun saf omenta (sol) 1 x 10 6 SKOV3ip.1 hücreleri, farelerden omenta 6 saat sonra IP enjeksiyon (merkezi) gösteren deney koşullarının bir karşılaştırmasını temsil etmektedir ve SKOV3ip.1-GFP ile omenta ex vivo şartlarda (sağda) altında kolonize. Omenta (ex vivo eki) ex vivo kültür koşullarında SKOV3ip.1-GFP tarafından kolonize in vivo deneyde (in vivo eki) ya da omenta dan SKOV3ip.1-GFP tarafından kolonize (Boş) Naif omenta. GFP için bütün omenta floresan görüntüleme, (A), in vivo ve ex vivo tahliller hem de benzer bir kolonizasyon modelini göstermektedir. Seri bölümleri H & E ile boyamaPanel A omenta süt noktalar (B) lokalize kanser hücrelerinin varlığını teyit eder. Yumurtalık kanseri hücreleri için sitokeratin H & E boyama (C) doğrular. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection Tools Fine Science Tools NA
Geimsa Fluka/Sigma Aldrich 48900
5% Formalin Sigma HT501320
DMEM Corning 10-013-CV
Trypsin Gibco 25200-056
PBS Corning 21-040-CV Without calcium and Magnesium
26 gauge needle BD 329652
BSA Sigma A7906
Collagenase Worthington LS004196
Stomacher Seward Labsystems Stomacher 80 Biomaster
Microstomacher bag Stomacher Lab Systems BA6040/Micro
ACK Lysis Buffer Gibco A10492-01
Millicell culture plate insert Millipore PICM01250
Cell-Tak Corning 354240

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bast, R. C., Hennessy, B., Mills, G. B. The biology of ovarian cancer: new opportunities for translation. Nature Reviews Cancer. 9 (6), 415-428 (2009).
  2. Bowtell, D. D. L. The genesis and evolution of high-grade serous ovarian cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (11), 803-808 (2010).
  3. Colgan, T. J., Chang, M. C. Chapter 18 Familial Cancer and Prophylactic Surgery. Diagnostic Pathology of Ovarian Tumors. , 277-288 (2011).
  4. Clark, R., et al. Milky Spots Promote Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Peritoneal Adipose in Experimental Models. The American Journal of Pathology. 183 (2), 576-591 (2013).
  5. Platell, C., Cooper, D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. The omentum. World Journal Of Gastroenterology: WJG. 6 (2), 169-176 (2000).
  6. Hagiwara, A., et al. Milky spots as the implantation site for malignant cells in peritoneal dissemination in mice. Cancer Research. 53 (3), 687-692 (1993).
  7. Gerber, S. A., et al. Preferential Attachment of Peritoneal Tumor Metastases to Omental Immune Aggregates and Possible Role of a Unique Vascular Microenvironment in Metastatic Survival and Growth. The American Journal of Pathology. 169 (5), 1739-1752 (2010).
  8. Liebermann-Meffert, D. The greater omentum. Anatomy, embryology, and surgical applications. The Surgical Clinics of North America. 80 (1), 275-293 (2000).
  9. Collins, D., Hogan, A. M., O’Shea, D., Winter, D. C. The Omentum: Anatomical, Metabolic, and Surgical Aspects. Journal of Gastrointestinal Surgery. 13 (6), 1138-1146 (2009).
  10. Khan, S. M., et al. In vitro metastatic colonization of human ovarian cancer cells to the omentum. Clinical, & Experimental Metastasis. 27 (3), 185-196 (2010).
  11. Shimizu, S. Routes of Administration. The Laboratory Mouse. Hans, H. , Academic Press. 527-542 (2004).
  12. Vang, R., Shih, I. -M., Kurman, R. J. Fallopian tube precursors of ovarian low- and high-grade serous neoplasms. Histopathology. 62 (1), 44-58 (2012).
  13. Folkins, A. K., Jarboe, E. A., Roh, M. H., Crum, C. P. Precursors to pelvic serous carcinoma and their clinical implications. Gynecologic Oncology. 113 (3), 391-396 (2009).
  14. Li, J., Fadare, O., Xiang, L., Kong, B., Zheng, W. Ovarian serous carcinoma: recent concepts on its origin and carcinogenesis. Journal of Hematology, & Oncology. 5 (1), 8 (2012).
  15. Kurman, R. J., Shih, I. -M. The origin and pathogenesis of epithelial ovarian cancer: a proposed unifying theory. The American Journal Of Surgical Pathology. 34 (3), 433-443 (2010).
  16. Crum, C. P., et al. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Current Opinion In Obstetrics, & Gynecology. 19 (1), 3-9 (2007).
  17. Crum, C. P., et al. Lessons from BRCA: The Tubal Fimbria Emerges as an Origin for Pelvic Serous Cancer. Clinical Medicine, & Research. 5 (1), 35-44 (2007).
  18. Foulkes, W. D., Narod, S. A. Ovarian cancer risk and family history. The Lancet. 349, 878 (1997).
  19. Antoniou, A., et al. Average Risks of Breast and Ovarian Cancer Associated with BRCA1 or BRCA2 Mutations Detected in Case Series Unselected for Family History: A Combined Analysis of 22 Studies. The American Journal of Human Genetics. 72 (5), 1117-1130 (2003).
  20. King, M. -C., Marks, J. H., Mandell, J. B. New York Breast Cancer Study Group Breast and ovarian cancer risks due to inherited mutations in BRCA1 and BRCA2. Science. 302 (5645), 643-646 (2003).
  21. Kjær Krüger, S., Gayther, S. Ovarian cancer and genetic susceptibility in relation to the BRCA1 and BRCA2 genes. Occurrence, clinical importance and intervention. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 85 (1), 93-105 (2006).
  22. Easton, D. F., Ford, D., Bishop, D. T. Breast and ovarian cancer incidence in BRCA1-mutation carriers. Breast Cancer Linkage Consortium. American Journal of Human Genetics. 56 (1), 265-271 (1995).
  23. Rebbeck, T. R., et al. Prophylactic Oophorectomy in Carriers of BRCA1or BRCA2Mutations. New England Journal of Medicine. 346 (21), 1616-1622 (2002).
  24. Olivier, R. I., et al. Clinical outcome of prophylactic oophorectomy in BRCA1/BRCA2 mutation carriers and events during follow-up. British Journal Of Cancer. 90 (8), 1492-1497 (2004).

Tags

Tıp Sayı 104 sütlü noktalar omentum yumurtalık kanseri periton adipoz deneysel metastaz metastatik kolonizasyon
<em>Vivo</em> ve <em>Ex Vivo</em> Periton yağ içinde Samanyolu Nokta Yapıların Yumurtalık Kanseri Metastatik Kolonizasyon Eğitim Yaklaşımlar <em>içinde</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Krishnan, V., Clark, R., Chekmareva, … More

Krishnan, V., Clark, R., Chekmareva, M., Johnson, A., George, S., Shaw, P., Seewaldt, V., Rinker-Schaeffer, C. In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose. J. Vis. Exp. (104), e52721, doi:10.3791/52721 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter