Introduction
תרבית תאים של שריר לב היא כלי קריטי במחקר הלב מודרני. cardiomyocytes עכברוש בילוד (NRCMs) נמצא בשימוש נפוץ מאז הבידוד והתרבות היא קלה יותר מזה של cardiomyocytes עכברוש המבוגר 1. שיטת NRCM עדיין יש מספר מגבלות, כולל הליך ארוך בידוד והתפשטות תאים מוגבל בצלחת. ישנם מספר רב של פרוטוקולים לבידודה של NRCMs עם רוב בדרך כלל דורש 4-48 שעות של עבודת 2-6. בנוסף, התאים לעתים קרובות מבודדים בין 1 ל גורי חולדה ישנה 2 ימים 2,4-7; העיתוי של הלידה יכול להיות בלתי צפוי וסכסוך עם עבודה אחרת במעבדה. הבידודים יכולים להיות לא יעילים ובזבזניים אם רק כמות קטנה של תאים דרושות לניסויים. רוב המאמצים בשיפור מיקוד העבודה על צמצום זמן הבידוד, אך זה לא פותר את הבעיות של תזמון הלידה של הגורים.
כחלופות, מעבדות רבות לנצלcardiomyocytes שמקורם בתאי גזע עובריים (ESCs) או תאים מושרה pluripotent גזע (iPSCs). עם זאת, תהליך תכנות מחדש ו / או בידול יכול להיות מאוד זמן רב ויקר גם כן. לא יכולה להיות בעיות אחרות בעת שימוש בתאים אלה כמודלים myocyte במבחנה. שני cardiomyocytes נגזר ESC- וiPSC- הוכח להפגין הבדלים באלקטרופיזיולוגיה מcardiomyocytes העיקרי 8-10.
NRCMs הניתק הם מסוגל להיות מאוחסן במשך כמה ימים באמצעות קירור 11, אך זה אינו מאפשר לאחסון ארוך טווח. חנקן נוזלי משמש בדרך כלל לשימור תאים לתקופה גדולה יותר של זמן, אבל דורש cryoprotectant כגון sulfoxide דימתיל (DMSO). מחקרים קודמים הראו כי הריכוז האידיאלי בין 5-10% DMSO בתקשורת ההקפאה מאפשר להקפאה של NRCMs, עדיין גם אז הכדאיות נשארה 12 נמוכים. למרות DMSO מסייע להגן על התאים במהלך חופשיזיע, זה יכול להיות רעיל לתאים בריכוזים מעל 1.5% 13. מחקרים קודמים הראו כי הסרת לאט DMSO מהתאים, עשוי לשפר את תא כדאיות 14.
אנחנו ביקשנו לשפר את היעילות של מבחני מבוססי תאי NRCM ידי cryopreserving התאים הבאים בידוד. זה מאפשר לתאים להיות מופשרים ושימוש בעת צורך, הפחתת התדירות של בידודים וצריכה של בעלי חיים. באמצעות שיטה זו, אנו מראים כי ניתן cryopreserve NRCMs ולהפשיר אותם לשימוש במועד מאוחר יותר. לאחר הפשרת התאים לשמור על כדאיות מקובלת ולייצר תרבויות NRCM כי הם חיוביים לactinin α-sarcomeric (α-SA) והחוזה באופן ספונטני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול הבא מיועד לבידוד של cardiomyocytes מהמלטה אחת מגורי יילודי חולדה (10-14 גורים). אם גודל המלטה הוא שונה באופן מהותי, ההליך עשוי להיות בקנה מידה כדי לפצות. הגורים צריכים להיות סביב 48 ± 6 שעות ישנות. כל הנהלים במסמך זה אושרו על ידי אוניברסיטת מדינה המוסדית הטיפול בבעלי חיים בצפון קרוליינה וועדת שימוש (IACUC).
1. תא בידוד הכנה
הערה: בצע את השלבים הבאים ביום שלפני הבידוד.
- החיטוי הבא: מספריים גדולים, מספריים קטנים, מלקחיים קטנים וחדים, המלקחיים גדולים. השתמש מחזור כובד במשך 60 דקות במינימום של 121 ° C וזמן ייבוש של 30 דקות.
- מניחים 40 מיליליטר של 0.1% פתרון טריפסין במקרר להפשיר O / N. הפתרון של האנק במקרר מלחים מאוזן (HBSS) אם לא קר כבר. הכן פתרון עוברי 20% בסרום שור (FBS) מניות תקשורת.
- בשנת 400 מיליליטר של Iscהתקשורת השתנה Dulbecco של אובה (IMDM) להוסיף 100 מיליליטר FBS, L-גלוטמין 5 מיליליטר (200 מ"מ), 2.5 מיליליטר גנטמיצין (מיליליטר 10 מ"ג -1), ושל 0.9 מיליליטר 2-mercaptoethanol. לעקר באמצעות מסנן אבק. תקשורת חנות ב C ° 4 עד 3 שבועות וזה ניתן להרחבה לכמויות קטנות יותר או גדולות יותר. לדלל 20% מניות תקשורת FBS 1: 1 עם IMDM לייצר 10% FBS תקשורת NRCM. לעשות רק בקבוצות קטנות כדי למנוע חימום וקירור של תקשורת חוזרים ונשנים.
יום בידוד 2. תא 1
- לבצע את העבודה הבאה במנדף תרבות על מנת למנוע זיהום של הדגימות. לעיתוי הטוב ביותר להתחיל את העבודה הזאת בשעתי אחר הצהריים שכן אין O / דגירה N.
- הכן את סביבת עבודה בתוך ברדס תרבות סטרילי. הנח כרית ספסל בשכונת התרבות. מלא שתי כוסות 250 מיליליטר עם 70% אתנול ולמקם את הכלים כירורגיים בהם. מניחים דלי קטן של קרח במכסת מנוע. לוודא שהוא גדול מספיק כדי להכיל כמה צינורות ומנת 150 מ"מ. UV לעקר את מכסה המנוע for 10 דקות. מניחים 40 מיליליטר 0.1% טריפסין על קרח.
- אחזר גורי חולדה בילוד מהאם. כדי לשמור על בעלי החיים חמים עד לשימוש, מניח אותם במכל מבודד כגון דלי קרח העטוף בכרית ספסל כדי לשמור אותם חמים.
- למלא צלחת תרבות 150 מ"מ עם 25 מיליליטר HBSS ומניח על קרח. לגולל 2-3 פודה גזה ומקום באזור עבודה. מחזיק גור בעור בצד האחורי של הצוואר, לרסס אותו עם 70% אתנול ומקום במכסת מנוע. הערה: כדי לשמור על סטריליות הטובה ביותר, זה יכול להיעשות על ידי אדם אחר שלאחר מכן מציב את הגור ניקה במכסת המנוע.
- החזק את הגור בעור בצד האחורי של הצוואר. לאחר מכן באמצעות המספריים הגדולים, בחתך אחד מהיר, חזק להרדים על ידי עריפת ראש. כתם הדם עם גזה. הערה: בשל הבדלים בדרישות IACUC, זה יכול להיות מתאים יותר כדי לנקות את הגור עם אתנול לנגב ולא ריסוס זה. הקפד לבדוק עם האוניברסיטה IACUC כלהנחיות שלהם בשלב זה.
- המשך צמצום צד קדמי של chest דרך בית החזה. לסחוט את העור בצוואר כדי לעזור לפתוח את בית החזה עד הלב גלוי. בעזרת המספריים הקטנים, להסיר את הלב ומקום בצלחת תרבות HBSS על קרח. חזור לגורים האחרים.
- הסר את כל רקמה הלא-לב מהדגימות ולערבל את HBSS בעדינות כדי לשטוף את לבם. העבר את רקמת הלב למנת תרבות אחרת המכילה HBSS הטרי ועוד לשטוף את הרקמה. חותך את הרקמה נוספת עד החתיכות 1-3 מ"מ 3, ולאחר מכן להעביר לפתרון טריפסין. הנח פתרון טריפסין על נדנדה ב 4 ° C O המקרר / N.
יום בידוד תא 2
הערה: בעוד aspirating בשלבים הבאים, להשתמש בפיפטה ולא קו ואקום. הרקמה נעה בקלות, וקו ואקום יסתום או להסיר רקמה עדיין מכיל תאים. עדיף להשתמש בפיפטה לשאיפה במקום. אם הרקמה נכנסה לפיפטה, פיפטה לגבות כדי להוציא אותה.
- הפוך taliquots HREE של 10% Media NRCM: אחד עם 25 מיליליטר ושני עם 15 מיליליטר. מניחים צינור 25 מיליליטר אחד של מדיה 37 ° C אמבט מים. הוסף 4 מיליליטר HBSS עד 5 צינורות חרוטי 15 מיליליטר שונה ולמקם את כל על קרח. כל תווית צינור # 15 מיליליטר 1-5.
- הוסף 40 מיליליטר HBSS לצינור חרוטי 50 מיליליטר. הוסף 10 מיליליטר של HBSS לCollagenase, פיפטה להשעות, ולשלב את הפתרונות כדי ליצור 50 מיליליטר של 1 מיליליטר מ"ג -1 פתרון collagenase. לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ואקום, ולאחסן בRT.
- אחזר צינור הרקמה / טריפסין לב. ודא טריפסין זה ברור, והרקמות רכות מופיעה. לאפשר לרקמות להתיישב לפינה של צינור ולשאוב נוזלים עד כמה שניתן.
- הוסף 10% FBS תקשורת NRCM 25 מיליליטר חמה לצינור והמערבולת ביד. כובע ולסובב באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. לשאוב נוזל שוב. הרקמה צריכה לצוף בשלב זה; אם כן, לשאוב מהחלק התחתון של הצינור.
- הוסף 10 מיליליטר collagenase. סובב באמבט מים במשך 2 דקות או עד הפתרון הוא מעונן. Quickly לשאוב את הנוזל. הוסף 10 מיליליטר collagenase הטרי לצינור המכיל את הרקמה ולסובב באמבט מים במשך 2 דקות. פיפטה לערבב, פתרון טרנספר לצינור # 1, ומניחה על קרח. זה יכול להיות לא ניתן להסיר את כל הנוזל. חזור על שלבים 3.2-3.6 לשלושה צינורות 15 מיליליטר חרוטי האחרים. העבר את כל נוזל שנותר לצינור # 5.
- צנטריפוגה 15 מיליליטר צינורות ב 410 RCF במשך 8 דקות. בעוד צנטריפוגה, מקום 15 מיליליטר 10% צינור תקשורת FBS NRCM באמבט מים. מניחים 40 מיקרומטר מסננת תא על גבי צינור חרוטי 50 מ"ל ורטוב עם 2 מיליליטר HBSS הקר.
- לשאוב supernatant מהתאים הסתחררו מטה. הוספת HBSS 6 מיליליטר קר על צינור אחד וגלול. תא פיפטה השעיות דרך המסננת לתוך 50 מיליליטר חרוטי להסיר את כל רקמה. יש לשטוף את הצדדים של כל שפופרת 15 מיליליטר עם HBSS הקר 3 מ"ל ולהוסיף למסננת. תאי צנטריפוגה ב410 RCF במשך 10 דקות. לשאוב supernatant. Resuspend גלולה תא ב 10 מיליליטר של 10% תקשורת FBS NRCM והעברה ל- T-75 בקבוק. יש לשטוף את חרוטי עם תקשורת 5 מ"ל ולהוסיף לflלשאול.
- דגירה עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. מניחים 15 מיליליטר 10% צינור תקשורת FBS NRCM האחרון לתוך אמבט מים. העבר את התוכן של T-75 לבקבוק T-175 חדש, לשטוף T-75 עם 15 מיליליטר תקשורת ולהוסיף ל- T-175. דגירה עבור שעה 1.
4. Cryopreservation
- הנח הקפאת תקשורת על קרח. העבר את התקשורת סלולארי מצינור חרוטי 50 מיליליטר-175 T, ולאסוף 10 μl של השעיה תא לתא הספירה באמצעות Trypan כחול. צנטריפוגה ב -410 RCF במשך 5 דקות. בעוד צנטריפוגה, לספור תאים באמצעות דלפק תא.
- תקשורת לשאוב תרבות, ותאים גלולים בהקפאת תקשורת בריכוז של 2-4 מיליון תאים לכל מיליליטר. מקום 1 מיליליטר של השעיה תא בבקבוקון קריוגני, אז מקום בקבוקוני קצב מבוקר קירור הקפאת מיכל, ומקום ב-80 O מקפיא C ° / N. בתוך 1-2 ימים, להעביר בקבוקונים בחנקן נוזלי.
5. תאי הפשרה
- צלחת מעיל בפיברונקטין על ידי המסת 250 μl60; של פיברונקטין (ריכוז מניות 1 מ"ג מיליליטר -1) ל9.75 מיליליטר מים (ריכוז סופי 0.025 מיליליטר מ"ג -1). הוסף מספיק פתרון לכיסוי צלחת התרבות ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות.
- בצינורות חרוטי ארבעה 15 מיליליטר, להפיק את תערובות DMSO / מדיה כדלקמן ידי הוספת DMSO למדיה 20%. להוסיף (5%) 9.5 מיליליטר תקשורת עם 500 μl DMSO. להוסיף (2.5%) 9.75 מיליליטר תקשורת עם 250 μl DMSO. הוסף 10 מיליליטר תקשורת (להפוך את שני אלה).
- מחממים את תערובת התקשורת האמורה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הסרת תאים מחנקן נוזלי ומניח על קרח יבש. כאשר תערובות תקשורת חמות, להפשיר תאים 37 ° C אמבט מים עד ממש מופשרים. אל תשאירו תאים באמבט מים במשך זמן רב מדי מכיוון שהם עלולים לגרום נזק לתאים.
- העבר את התוכן של בקבוקון קריוגני 5% צינור DMSO / תקשורת. צנטריפוגה ב -410 RCF במשך 8 דקות. לשאוב supernatant עוזב תא גלולה. הוסף תוכן של 2.5% צינור DMSO / תקשורת ועד לתא גלולה וresuspend. צנטריפוגה ב -410 RCF במשך 8 דקות. לשאוב supernatant עוזב תא גלולה.
- הוספת תוכן של 0% צינור DMSO / תקשורת אחד לתא גלולה וגלול. צנטריפוגה ב -410 RCF במשך 8 דקות. לשאוב supernatant עוזב תא גלולה.
- הוספת תוכן של DMSO / מדיה 0% השניה לתא גלולה וגלול. קח דוגמא קטנה לספירת תאים. צנטריפוגה ב -410 RCF במשך 8 דקות. בעוד תאי ספירת צנטריפוגה בhaemocytometer באמצעות Trypan הכחול לתייג תאים מתים. סכום שיא תא, כמו גם יכולת קיום.
- לשאוב supernatant עוזב תא גלולה. Resuspend ב 10% תקשורת NRCM (אופציונאלי: להוסיף bromodeoxyuridine 100 מיקרומטר (BrdU)) ותאי צלחת על מנות מצופים פיברונקטין.
תרבות 6. Cell
- פלייט תאים בכ 100k תאים לכל 2 סנטימטר. התאם את צפיפות הציפוי המבוססת על השימוש המיועד של התרבות. הכן 2% תקשורת NRCM על ידי דילול מדיה של 20% בIMDM ביחס 1:10. הבא הוא קווי המתאר של תרבות טיפוסית. </ Li>
- ביום 1, לשטוף תאים מתים משם עם IMDM החם, להוסיף 10% NRCM (האופציונלי 100 מיקרומטר BrdU). ביום 2, לשטוף תאים מתים משם עם IMDM החם, להוסיף 10% NRCM. יום 3-להוסיף 2% NRCM. ביום 4 להוסיף 2% NRCM. ביום 5 להבטיח שהתאים ומחוברות ומכות. לשמור על תאים בתרבית למשך כשבוע. בשלב זה fibroblasts עשוי להתחיל להיגמל באופן משמעותי את NRCMs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות הבידוד של cardiomyocytes העכברוש בילוד, התאים מוקפאים עד לחנקן נוזלי, והוא יכול להיות מאוחסן במשך לפחות כמה חודשים. בדרך כלל על הפשרה, הכדאיות נקבעת על ידי ניתוח Trypan הכחול תהיה בין 40-60%. למרות שזה יהיה נמוך מסוגי תאים אחרים, עם זריעה ותרבות ראויות התאים יתרבו (איור 1). על מנת לאמת את ההתכווצות, ניתן הדמיה התאים באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב. התאים צריכים להתחיל להתכווץ באופן ספונטני בתוך כשלושה ימים (איור 2). לimmunocytochemistry מבחני (ICC), תאים היו מצופים בשקופיות תרבות 4 היטב עם 200,000 תאים לכל טוב. כדי להראות שהתאים בתרבית הם NRCMs התאים תויגו עם α-SA וצלמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ישנם תאים חיוביים α-SA רבים המצביעים על NRCMs בתרבות (איור 4). ניסויים אחרים לא בוצעו כולל רחוב ללא מוצאNRCMs טיורינג עם exosomes מקורן בתאי גזע של הלב האנושי כדי לבדוק את מאפייני התחדשות של exosomes (איור 5).
איור 1. NRCM הפצת נשק במבחנה. תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של NRCM עם כתמים לα-SA (ירוק), Ki67 (אדום), וDAPI (כחול) לשניהם () NRCMs מבודד טרי ו( B) NRCMs אז מופשר cryopreserved. חצים מציין תאים מתרבים (Ki67-חיובי). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
התכווצות 2. איור של NRCM cryopreserved והמופשר במבחנה. Spontane NRCMsלכן הידבקות במבחנה. שלא כמו NRCMs מבודד טרי, זה עלול לקחת כמה ימים לפני ההתכווצות הוא התאוששה. וידאו נרשם חמישה ימים לאחר ההפשרה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
NRCMs איור 3. התכווצות של NRCM מבודד טרי במבחנה. מבודדת טרי התקשרות באופן ספונטני במבחנה. תאים אלה יתחילו להציג התכווצות הרבה יותר מוקדם. וידאו נרשם 3 ימים לאחר הבידוד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
איור 4. טוהר NRCM התרבות. </ Strong> תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של שניהם () המבודדים טרי NRCMs בתרבות וב( B) cryopreserved וNRCMs המופשר לאחר 5 ימים בתרבות. NRCMs להראות צביעה חיובית לα-SA (ירוק) ואילו ניתן לראות fibroblasts בי גרעינים (כחול) לא מוקפים בα-SA. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. שימוש במופשר NRCM לסלולרי מבוסס Assay. תמונה מיקרוסקופית Confocal של NRCMs, מודגש על ידי α-SA (ירוק), הודגרו עם exosomes כותרת DiI (אדומה) מתאי גזע של הלב. גרעין תא שכותרתו עם DAPI (כחול). על מנת ליצור מודל עקה חמצונית, טופלו NRCMs עם מי חמצן 100 מיקרומטר במשך 18 שעות, לפני שהודגרו עם exosomes במשך 4 שעות כדי להפוך את לחץ חמצוני. חצים מצביעים על אזורים של ריכוזי exosome גבוהים בחלק מהתאים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מאפשר לNRCMs להיות מבודד, cryopreserved, ומופשר. הפשרת התאים היא חלק חיוני של ההליך. סדרה של דילולים DMSO משמשת להסרת לאט DMSO מהתאים 14. חשוב שהחילוץ של DMSO להתבצע מהר ככל התאים רגישים במיוחד למוות מייד לאחר הפשרה. אם יותר או פחות תאים נדרשים להפשרה, הכרכים של פתרונות DMSO וניתן לשנות בהתאם לצורך.
אתגר אחד לבידוד NRCM והתרבות הוא ההתפשטות המהירה של fibroblasts. פרוטוקול זה משתמש preplating שהוכח להפחית את מספר fibroblasts 15. Preplating עבודות באמצעות צלוחיות ללא ציפוי שfibroblasts לצרף הרבה יותר מהר מאשר cardiomyocytes. הרצף של שינויים בתקשורת ניתן לשנות כדי להפחית צמיחה פיברובלסטים. Fibroblasts יהיה להיגמל NRCMs ב 10% תקשורת NRCM, אך צמיחה פיברובלסטים היא משמעותית איטי יותר ברפואת NRCM 2%IA. ישנן שיטות אחרות כגון הדרגתיים Percoll להסיר פיברובלסטים לפני ציפוי 16,17 או התוספת של BrdU להאט צמיחת 3 פיברובלסטים. צמיחת פיברובלסטים מוגזמת עלולה להיות קשה לזהות באמצעות מיקרוסקופ שלב, אבל מוצגת בקלות באמצעות NRCM צביעה ספציפית כגון α-SA (איור 3). אם יש עדיין צמיחת פיברובלסטים מוגזמת, הסכום של FBS בתקשורת יכול להיות ירידה של 2% FBS ביום 2. במידת צורך, ציפוי יכול להיעשות בתקשורת FBS 5%, אם כי זה עלול לגרום למוות של תאי גידול.
הליך זה הוא מוגבל ולא מועיל יותר אם בתרביות תאים שדורשות כמויות גדולות של תאי 18,19. במקרים בהם הסכום של תאים הדרושים מתקרב למחצית הסכום של תאים ניתן לקצור מהמלטה, הליך זה ידרוש יותר בעלי חיים שכן כמחצית מהתאים הם איבדו בשל הקפאה. היתרונות של הקפאה גדולים יותר בעת שימוש בפחות cells למבחנים כגון immunostaining.
פרוטוקול זה מדגים את השיטות לבידוד, הקפאה, ולאחר מכן של NRCMs. יש כמה חלופות, כגון רכישת תאים קפואים מיצרנים, לשימוש בשיטה זו, אך תאי רכישה עשויים להיות העלות לכמה מעבדות. השיטות שלנו רק דורשות חומרים וחומרים כימיים המשמשים בדרך כלל תרבית תאים. בנוסף, שימוש בשיטות אלה יכולים להגדיל באופן משמעותי את היעילות וגמישות של עבודת מעבדה, תוך צמצום השימוש בחיות מעבדה. השיטות שתוארו לייצר תרבויות קיימא שיכול לשמש שללאחר מכן במחקרי מבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM (+25 mM HEPES +L-glutamine) | Gibco | 12440-046 | With added 25 mM HEPES and L-glutamine |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| HBSS (+Ca +Mg) | Corning | 21-020-CV | With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4 |
| Trypsin 0.25% | Gibco | 25300-056 | |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | Freezing media |
| Cryogenic Vial | Corning | 430659 | |
| Collagenase | Sigma | C1889-50MG | |
| 40 μm Cell Strainer | Greiner Bio-One | 542040 | |
| Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) | Corning | 431118 | |
| 50 ml Conical | Corning | 430828 | |
| 15 ml Conical | Corning | 430790 | |
| trypan blue | Cellgro | 25-900-CI | |
| Mr Frosty Freezing Container | ThermoScientific | 5100-0001 | |
| Millicell EZ SLIDES | Millipore | PEZGS0416 | |
| α-sarcomeric actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 51-7581KZ |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Miragoli, M., Salvarani, N., Rohr, S. Myofibroblasts Induce Ectopic Activity in Cardiac Tissue. Circulation Research. 101, 755-758 (2007).
- Simpson, P., Savion, S. Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol. Circulation Research. 50 (1), 101-116 (1982).
- Simpson, P., McGrath, a, Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Rohr, S., Flückiger-Labrada, R., Kucera, J. P. Photolithographically defined deposition of attachment factors as a versatile method for patterning the growth of different cell types in culture. Pflügers Archive : European Journal of Physiology. 446 (1), 125-132 (2003).
- Zhang, B., Green, J. V., Murthy, S. K., Radisic, M. Label-free enrichment of functional cardiomyocytes using microfluidic deterministic lateral flow displacement. PloS One. 7 (5), e37619 (2012).
- Boateng, S. Y., Hartman, T. J., Ahluwalia, N., Vidula, H., Desai, T. Inhibition of fibroblast proliferation in cardiac myocyte cultures by surface microtopography. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 285 (1), C171-C182 (2003).
- Fu, J. -D., Li, J., et al. Crucial role of the sarcoplasmic reticulum in the developmental regulation of Ca2+ transients and contraction in cardiomyocytes derived from embryonic stem cells. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (1), 181-183 (2006).
- Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. a Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Uchida, T., Nagayama, M., Taira, T., Shimizu, K., Sakai, M., Gohara, K. Optimal temperature range for low-temperature preservation of dissociated neonatal rat cardiomyocytes. Cryobiology. 63 (3), 279-284 (2011).
- Miyamura, K., Nagayama, M., et al. Evaluation of viability of cryopreserved rat cardiac myocytes and effects of dimethyl sulfoxide concentration on cryopreservation. Cryobiology. 59 (3), 375 (2010).
- Rana, P., Anson, B., Engle, S., Will, Y. Characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: bioenergetics and utilization in safety screening. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 130 (1), 117-131 (2012).
- Yokomuro, H., Mickle, D. aG., Weisel, R. D., Li, R. -K. Optimal conditions for heart cell cryopreservation for transplantation. Molecular and Cellular Biochemistry. 242 (1-2), 109-114 (2003).
- Simpson, P., McGrath, a, Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Evans, H. J., Western Goodwin, R. L. array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Molecular and Cellular Biochemistry. 303 (1-2), 189-199 (2007).
- Golden, H. B., Gollapudi, D., et al. Methods in Molecular Biology. , 205-214 (2012).
- Zlochiver, S., Muñoz, V., Vikstrom, K. L., Taffet, S. M., Berenfeld, O., Jalife, J. Electrotonic myofibroblast-to-myocyte coupling increases propensity to reentrant arrhythmias in two-dimensional cardiac monolayers. Biophysical Journal. 95 (9), 4469-4480 (2008).
- Chang, M. G., Zhang, Y., et al. Spiral waves and reentry dynamics in an in vitro model of the healed infarct border zone. Circulation Research. 105 (11), 1062-1071 (2009).
