Introduction
El cultivo celular de los cardiomiocitos es una herramienta fundamental en la investigación cardiaca moderna. Cardiomiocitos de rata neonatal (NRMCR) son de uso general ya que el aislamiento y la cultura es más fácil que la de los cardiomiocitos de rata adulta 1. El método NRCM todavía tiene varias limitaciones, incluyendo un procedimiento de aislamiento de largo y la proliferación celular limitado en el plato. Hay numerosos protocolos para el aislamiento de NRMCR con la mayoría requiriendo generalmente 4-48 hr de trabajo 2-6. Además, las células se aíslan con frecuencia de 1 a cachorros de 2 días de edad de rata 2,4-7; el momento del nacimiento puede ser impredecible y el conflicto con otros trabajos en el laboratorio. Los aislamientos pueden ser ineficiente y derrochador si se necesita sólo una pequeña cantidad de células para los experimentos. La mayoría de los esfuerzos en mejorar el enfoque del flujo de trabajo en la reducción del tiempo de aislamiento, sin embargo, esto no resuelve el problema de medir el tiempo del nacimiento de las crías.
Como alternativas, muchos laboratorios utilizancardiomiocitos derivados de células madre embrionarias (CES) o las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). Sin embargo, el proceso de reprogramación y / o diferenciación puede ser muy lento y costoso también. No puede haber otros problemas al utilizar estas células como modelos miocitos in vitro. Ambos cardiomiocitos derivados Esc- y iPSC- han demostrado que presentan diferencias en la electrofisiología de cardiomiocitos primarios 8-10.
NRMCR disociadas son capaces de ser almacenado durante varios días utilizando refrigeración 11, sin embargo, esto no permiten el almacenamiento a largo plazo. El nitrógeno líquido se utiliza típicamente para preservar las células de un mayor período de tiempo, sino que requiere un crioprotector tal como sulfóxido de dimetilo (DMSO). Investigaciones anteriores han demostrado que la concentración ideal entre 5-10% de DMSO en los medios de congelación permite la criopreservación de NRMCR, pero aun así la viabilidad sigue siendo baja 12. Aunque DMSO ayuda a proteger las células durante gratuitazing, puede ser tóxico para las células a concentraciones por encima de 1,5% 13. Estudios anteriores han demostrado que la eliminación lentamente DMSO de las células, puede mejorar la viabilidad celular 14.
Hemos tratado de mejorar la eficiencia de los ensayos basados en células NRCM por criopreservar las células después del aislamiento. Esto permite que las células se descongelaron y se utilizan cuando sea necesario, reduciendo la frecuencia de aislamientos y el consumo de los animales. Usando este método, se muestra que es posible criopreservar NRMCR y descongelar para su uso en un momento posterior. Después de descongelar las células mantienen una viabilidad aceptable y producen culturas NRCM que son positivas para α-actinina sarcomérica (α-SA) y el contrato de forma espontánea.
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Protocol
El siguiente protocolo está diseñado para el aislamiento de cardiomiocitos de una camada de cachorros de rata neonatal (10-14 PUP). Si el tamaño de camada es significativamente diferente, el procedimiento puede tener que ser reducido para compensar. Los cachorros deben ser alrededor de 48 ± 6 horas de edad. Todos los procedimientos en este documento han sido aprobados por la Universidad de Carolina del Norte Estado Institucional Cuidado de Animales y el Comité de Uso (IACUC).
1. Preparación celda de aislamiento
NOTA: Realice los siguientes pasos el día antes del aislamiento.
- Autoclave los siguientes: grandes tijeras, tijeras pequeñas, pequeñas pinzas cortantes, grandes pinzas. Use un ciclo de la gravedad durante 60 minutos a un mínimo de 121 ° C y un tiempo de secado de 30 min.
- Colocar 40 ml de solución de tripsina 0,1% en el refrigerador para descongelar O / N. Refrigere de Hank sales equilibradas Solution (HBSS) si no está ya frío. Preparar una solución madre de los medios de comunicación 20% de suero bovino fetal (FBS).
- En 400 ml de Iscmedios modificado de Dulbecco de OVE (IMDM) añadir 100 ml de FBS, 5 ml L-glutamina (200 mM), 2,5 ml de gentamicina (10 mg ml -1), y 0,9 ml de 2-mercaptoetanol. Esterilizar mediante filtro de vacío. De la tienda a 4 ° C durante un máximo de 3 semanas y esto es escalable para volúmenes más pequeños o más grandes. Diluir 20% de FBS Stock medios de comunicación 1: 1 con IMDM para producir 10% de FBS NRCM medios de comunicación. Sólo hacer en lotes pequeños para evitar el calentamiento y enfriamiento de los medios de comunicación repetida.
2. celda de aislamiento Día 1
- Realice el siguiente trabajo en una campana de cultivo para evitar la contaminación de las muestras. Para mejor momento comenzar este trabajo de la tarde ya que hay un / incubación O N.
- Preparar espacio de trabajo dentro de una campana de cultivo estéril. Coloque la almohadilla de banco en campana de cultivo. Llene dos vasos de precipitados de 250 ml con 70% de etanol y colocar herramientas quirúrgicas en ellos. Coloque pequeño cubo de hielo en la campana. Asegúrese de que sea lo suficientemente grande como para contener varios tubos y un plato de 150 mm. UV esterilizar el capó for 10 min. Colocar 40 ml de 0,1% de tripsina en hielo.
- Recuperar crías de ratas neonatales de la madre. Para mantener a los animales caliente hasta su uso, colocarlos en un recipiente aislado, como un cubo de hielo envuelto en una plataforma de banca para mantenerlos calientes.
- Llenar una placa de cultivo de 150 mm con 25 ml de HBSS y colocar en hielo. Separar 2-3 gasas y lugar en el área de trabajo. Sosteniendo cachorro por la piel en la parte posterior del cuello, rociar con etanol al 70% y el lugar en el capó. NOTA: Para mantener mejor la esterilidad, esto se puede hacer por otra persona que luego coloca el cachorro limpiado en el capó.
- Mantenga el cachorro por la piel en la parte posterior del cuello. Luego, utilizando las tijeras grandes, en un rápido corte fuerte, la eutanasia por decapitación. Seque la sangre con una gasa. NOTA: Debido a las variaciones en los requerimientos IACUC, puede ser más apropiado para limpiar el cachorro con una mezcla de etanol en lugar de limpiar rociándolo. Asegúrese de consultar con la universidad IACUC como a sus directrices para este paso.
- Continuar reduciendo cara anterior del chest a través de la caja torácica. Apriete la piel en el cuello para ayudar a abrir la caja torácica hasta que el corazón es visible. Usando las tijeras pequeñas, retire el corazón y colocar en la placa de cultivo HBSS en hielo. Repita el procedimiento para los otros cachorros.
- Retire cualquier tejido no corazón de las muestras y haga girar la HBSS suavemente para limpiar los corazones. Transferir el tejido del corazón a otra placa de cultivo que contiene frescos HBSS y lavar aún más el tejido. Cortar el tejido más hasta que las piezas son de 1-3 mm 3, y luego traslado a la solución de tripsina. Coloque solución de tripsina en eje de balancín en 4 ° C refrigerador O / N.
Aislamiento de células Día 2
NOTA: mientras se aspira en los pasos siguientes, utilizar una pipeta en lugar de una línea de vacío. El tejido se mueve con facilidad, y una línea de vacío va a obstruir o remover el tejido todavía contiene células. Lo mejor es usar una pipeta de aspiración en su lugar. Si el tejido entra en la pipeta, pipetas atrás para extraerla.
- Haga talícuotas res de 10% NRCM Medios: una con 25 ml y dos con 15 ml. Coloque un tubo de 25 ml de medios de comunicación en 37 ° C baño de agua. Añadir 4 ml de HBSS a 5 diferentes 15 ml tubos cónicos y colocar todo en hielo. Etiqueta de cada 15 ml tubo # 1-5.
- Añadir 40 ml de HBSS a un tubo cónico de 50 ml. Añadir 10 ml de HBSS a la colagenasa, una pipeta de suspender, y combinan las soluciones para crear 50 ml de 1 mg ml -1 solución de colagenasa. Esterilizar usando 0,22 micras filtro de vacío, y almacenar a temperatura ambiente.
- Recuperar tubo de tejido / tripsina corazón. Asegúrese de que la tripsina es clara, y el tejido parece esponjoso. Deje que el tejido se deposite en la esquina de tubo y aspirar todo el líquido posible.
- Añadir 25 ml tibia 10% de FBS NRCM medios de comunicación para el tubo y agitar a mano. Cap y girar en 37 ° C baño de agua durante 2 min. Aspirar el líquido de nuevo. El tejido debe flotar en este paso; Si es así, aspirado desde el fondo del tubo.
- Añadir 10 ml de colagenasa. Gire en baño de agua durante 2 minutos o hasta que la solución está turbia. Quickly aspirar el líquido. Añadir 10 ml de colagenasa reciente al tubo que contiene el tejido y girar en baño de agua durante 2 min. Pipeta para mezclar, solución de transferencia de tubo # 1, y el lugar en el hielo. Puede que no sea posible eliminar todo el líquido. Repetir los pasos 3.2 a 3.6 para los otros tres tubos de 15 ml cónicos. Transferir el líquido restante en el tubo # 5.
- Centrífuga de tubos de 15 ml a 410 rcf durante 8 min. Mientras centrifugación, colocar 15 ml de 10% de tubo medios FBS NRCM en baño de agua. Coloque 40 micras filtro de células en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml y mojado con 2 ml de HBSS frío.
- Aspirar el sobrenadante de las células centrifugadas. Añadir 6 ml de HBSS fría a cada tubo y resuspender. Suspensiones de células de la pipeta a través del filtro en 50 ml cónica para retirar cualquier tejido. Enjuague lados de cada tubo de 15 ml con 3 ml de HBSS frío y añadir al colador. Centrifugar las células a 410 rcf durante 10 min. Aspirar el sobrenadante. Resuspender pellet de células en 10 ml 10% de FBS NRCM medios de comunicación y la transferencia de T-75 matraz. Enjuague cónica con medios de 5 ml y añadir a flpreguntar.
- Incubar durante 1 h a 37 ° C y 5% de CO 2. Coloque el pasado 15 ml 10% de tubo medios FBS NRCM en baño de agua. Transferir contenido del T-75 a un nuevo matraz T-175, enjuague T-75 con 15 ml de medio y añadir a T-175. Incubar durante 1 hora.
4. Criopreservación
- Coloca medio de congelación en el hielo. Traslado medio celular de T-175 a 50 ml tubo cónico, y recoger 10 l de suspensión celular para celular recuento usando azul tripán. Centrifugar a 410 rcf durante 5 min. Mientras centrifugación, contar las células utilizando un contador de células.
- Aspirar los medios de cultivo y las células volver a suspender en medio de congelación a una concentración de 2 a 4.000.000 de células por ml. Colocar 1 ml de suspensión celular en vial criogénico, luego ubicar los viales una velocidad controlada de refrigeración congelación contenedor, y el lugar en el congelador a -80ºC O / N. Dentro de 1-2 días, transferir viales en nitrógeno líquido.
5. Las células de descongelación
- Escudo plato en la fibronectina mediante la disolución de 250 l60; de la fibronectina (concentración madre de 1 mg ml -1) en 9,75 ml de agua (concentración final 0,025 mg ml -1). Agregue suficiente solución para cubrir la placa de cultivo y se incuba a 37 ° C durante al menos 30 minutos.
- En cuatro de 15 ml tubos cónicos, hacer las mezclas DMSO / medios de la siguiente añadiendo DMSO al 20% de Medios. Añadir (5%) 9,5 ml de medio con 500 l de DMSO. Añadir (2,5%) 9,75 ml de medio con 250 l de DMSO. Añadir 10 ml de medio (hacer dos de ellos).
- Calentar las mezclas de los medios mencionados en baño a 37 ° C. Eliminar las células de nitrógeno líquido y colocar en hielo seco. Cuando mezclas de medios de comunicación son cálidos, descongelar las células en 37 ° C baño de agua hasta que estén descongelados. No deje las células en un baño de agua durante demasiado tiempo, ya que puede causar daño a las células.
- Transferir contenido del vial criogénico al 5% tubo DMSO / media. Centrifugar a 410 rcf durante 8 min. Aspirar el sobrenadante dejando sedimento celular. Añadir el contenido de 2,5% tubo DMSO / media a teléfonos de pellets y resuspend. Centrifugar a 410 rcf durante 8 min. Aspirar el sobrenadante dejando sedimento celular.
- Añadir el contenido de un 0% tubo DMSO / media a la celda de pellets y resuspender. Centrifugar a 410 rcf durante 8 min. Aspirar el sobrenadante dejando sedimento celular.
- Añadir el contenido de segunda 0% DMSO / medios de comunicación para sedimento celular y resuspender. Tome pequeña muestra para el recuento celular. Centrifugar a 410 rcf durante 8 min. Mientras centrifugación células recuento en un hemocitómetro usando azul tripán para marcar las células muertas. Cantidad de células Record, así como la viabilidad.
- Aspirar el sobrenadante dejando sedimento celular. Resuspender en 10% NRCM medios (opcional: añadir 100 mM bromodesoxiuridina (BrdU)) y células de la placa en placas recubiertas de fibronectina.
6. Cultivo Celular
- Células de la placa en unos 100 mil células por cm 2. Ajustar la densidad de placas basado en el uso previsto de la cultura. Preparar 2% NRCM medios de comunicación mediante la dilución de 20% de medios en IMDM en una proporción de 1:10. El siguiente es un resumen de una cultura típica. </ Li>
- El día 1, enjuagar las células muertas de distancia con IMDM tibia, agregue 10% NRCM (opcional 100 mM BrdU). El día 2, enjuagar las células muertas de distancia con IMDM tibia, agregue 10% NRCM. Día 3-añadir 2% NRCM. El día 4 añadir 2% NRCM. El día 5 aseguran que las células son confluentes y paliza. Mantener las células en cultivo por alrededor de una semana. En ese momento, los fibroblastos pueden comenzar a superar significativamente los NRMCR.
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Representative Results
Después del aislamiento de los cardiomiocitos de rata neonatal, las células se congelaron en nitrógeno líquido, y se pueden almacenar durante al menos varios meses. Típicamente después de la descongelación, la viabilidad se determinó por análisis de azul de tripano será de entre 40-60%. Aunque esto es más bajo que otros tipos de células, con la siembra y la cultura propia de las células se proliferan (figura 1). Con el fin de verificar la contractilidad, las células pueden ser imágenes utilizando un microscopio de contraste de fase. Las células deben comenzar a contraerse espontáneamente dentro de unos tres días (Figura 2). Para (ICC) ensayos de inmunocitoquímica, las células se sembraron en 4 pocillos cultura diapositivas con 200.000 células por pocillo. Con el fin de demostrar que las células en cultivo son NRMCR las células se marcaron con α-SA y la imagen mediante microscopía de fluorescencia. Hay numerosas células positivas α-SA indican NRMCR en el cultivo (Figura 4). Otros experimentos se han realizado incluyendo culNRMCR de Turing con exosomas derivados de células madre cardíacas humanas para comprobar propiedades regenerativas de exosomas (Figura 5).
Figura 1. NRCM proliferación en imagen de microscopía de fluorescencia de NRCM con tinción de α-SA (verde), Ki67 (rojo) Vitro., Y DAPI (azul) para ambos (A) NRMCR recién aisladas y (B) criopreservados NRMCR luego descongeladas. Las flechas indica células en proliferación (Ki67 positivas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La contracción de Criopreservados y descongelada NRCM In Vitro. NRMCR Spontaneormente contraer in vitro. A diferencia NRMCR recién aisladas, puede tardar unos días antes de que se recuperó la contractilidad. Vídeo se registraron cinco días después de la descongelación. Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.
Figura 3. Contracción de recién aisladas NRCM In Vitro. Recién aislado NRMCR contraer espontáneamente in vitro. Estas células comienzan a exhibir la contractilidad mucho antes. Vídeo se registraron 3 días después del aislamiento. Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.
Figura 4. NRCM Pureza de Cultura. </ Strong> imágenes de microscopio de fluorescencia de ambos (A) recién aisladas NRMCR en la cultura y (B) criopreservado y NRMCR descongelados después de 5 días de cultivo. NRMCR muestran tinción positiva para α-SA (verde) mientras que los fibroblastos se pueden ver en los núcleos (azul) no están rodeados de α-SA. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Uso de Thawed NRCM para Ensayo basado en células. Imagen de microscopía confocal de NRMCR, resaltado por α-SA (verde), se incubaron con exosomas marcadas con Dil (rojo) a partir de células madre cardiacas. Los núcleos celulares marcadas con DAPI (azul). Con el fin de crear un modelo de estrés oxidativo, NRMCR se trataron con peróxido de hidrógeno 100 mM durante 18 horas, antes de ser incubados con exosomes durante 4 horas para revertir el estrés oxidativo. Las flechas indican las regiones de altas concentraciones exosome en algunas células. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo permite a los NRMCR a ser aislados, criopreservadas y descongeladas. Descongelación de las células es una parte crucial del procedimiento. Una serie de diluciones de DMSO se utiliza para eliminar lentamente DMSO de las células 14. Es importante que la extracción de DMSO realizarse rápidamente ya que las células son particularmente sensibles a morir inmediatamente después de la descongelación. Si se requieren células más o menos para la descongelación, los volúmenes de las soluciones de DMSO que pueden ser escalados según sea necesario.
Uno de los retos para el aislamiento y cultivo NRCM es la rápida proliferación de los fibroblastos. Este protocolo utiliza preplating que se ha demostrado para reducir el número de fibroblastos 15. Preplating obras mediante el uso de frascos sin recubrir para que los fibroblastos se adhieren mucho más rápido que los cardiomiocitos. La secuencia de los cambios de medios puede ser alterado para reducir el crecimiento de fibroblastos. Los fibroblastos se superan NRMCR en 10% NRCM medios de comunicación, pero el crecimiento de fibroblastos es significativamente más lento en 2% NRCM media. Hay otros métodos tales como gradientes de Percoll para eliminar los fibroblastos antes de chapado 16,17 o la adición de BrdU al lento crecimiento de fibroblastos 3. De crecimiento de fibroblastos excesivo puede ser difícil de detectar mediante microscopía de fase, pero se muestra fácilmente usando NRCM tinción específica tales como α-SA (Figura 3). Si sigue habiendo crecimiento de fibroblastos excesiva, la cantidad de FBS en los medios de comunicación se puede reducir a 2% de FBS en el día 2. Si es necesario, el chapado se puede realizar en 5% FBS, aunque esto puede resultar en un aumento de la muerte celular.
Este procedimiento es limitada y ya no beneficioso si usando cultivos de células que requieren grandes cantidades de células 18,19. En los casos en que la cantidad de células necesarias se acerca la mitad de la cantidad de células posible cosechar de una camada, este procedimiento requerirá más animales ya que aproximadamente la mitad de las células se pierden debido a la criopreservación. Los beneficios de la crioconservación son mayores cuando se utilizan menos cells para ensayos tales como la inmunotinción.
Este protocolo ilustra los métodos para el aislamiento, la criopreservación, y posterior de NRMCR. Hay pocas alternativas, tales como la compra de células congeladas de los vendedores, a la utilización de este método, pero las células que compran pueden costar prohibitivo para algunos laboratorios. Nuestros métodos sólo requieren materiales y reactivos usados comúnmente en cultivo celular. Además, la utilización de estos métodos puede aumentar en gran medida la eficiencia y flexibilidad de trabajo de laboratorio, mientras que la reducción del uso de animales de laboratorio. Los métodos descritos producen cultivos viables que pueden ser utilizados para la posterior en estudios in vitro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM (+25 mM HEPES +L-glutamine) | Gibco | 12440-046 | With added 25 mM HEPES and L-glutamine |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| HBSS (+Ca +Mg) | Corning | 21-020-CV | With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4 |
| Trypsin 0.25% | Gibco | 25300-056 | |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | Freezing media |
| Cryogenic Vial | Corning | 430659 | |
| Collagenase | Sigma | C1889-50MG | |
| 40 μm Cell Strainer | Greiner Bio-One | 542040 | |
| Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) | Corning | 431118 | |
| 50 ml Conical | Corning | 430828 | |
| 15 ml Conical | Corning | 430790 | |
| trypan blue | Cellgro | 25-900-CI | |
| Mr Frosty Freezing Container | ThermoScientific | 5100-0001 | |
| Millicell EZ SLIDES | Millipore | PEZGS0416 | |
| α-sarcomeric actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 51-7581KZ |
References
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