Introduction
Coltura cellulare di cardiomiociti è uno strumento fondamentale per la ricerca cardiaca moderna. Cardiomiociti di ratto neonatale (NRCMs) sono comunemente usati poiché l'isolamento e la cultura è più facile di quello di cardiomiociti di ratto adulto 1. Il metodo NRCM ha ancora diverse limitazioni, tra cui una lunga procedura di isolamento e la proliferazione cellulare limitata nel piatto. Ci sono numerosi protocolli per l'isolamento di NRCMs con più generalmente richiedono 4-48 ore di lavoro 2-6. Inoltre, le cellule sono spesso isolate da 1 a 2 giorni cuccioli di ratto vecchio 2,4-7; i tempi della nascita può essere imprevedibile e in conflitto con altri lavori in laboratorio. I isolamenti possono essere inefficiente e dispendioso se solo una piccola quantità di cellule sono necessari per gli esperimenti. La maggior parte degli sforzi per migliorare l'attenzione sul flusso di lavoro riducendo il tempo di isolamento, ma questo non risolve il problema della temporizzazione della nascita dei cuccioli.
Come alternativa, molti laboratori utilizzanocardiomiociti derivati da cellule staminali embrionali (ESC) o di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs). Tuttavia, il processo di riprogrammazione e / o differenziazione può essere molto lungo e costoso pure. Ci possono essere altri problemi quando si utilizzano queste cellule come modelli miociti in vitro. Sia ESC- e iPSC- cardiomiociti derivati hanno dimostrato di esporre le differenze di elettrofisiologia di cardiomiociti primari 8-10.
NRCMs dissociati sono in grado di essere conservato per diversi giorni con refrigerazione 11, ma questo non consente per la conservazione a lungo termine. L'azoto liquido è tipicamente usato per conservare le cellule per un maggiore periodo di tempo, ma richiede un crioprotettore come dimetil solfossido (DMSO). Precedenti ricerche hanno dimostrato che la concentrazione ideale tra il 5-10% DMSO nei media congelamento consente per la crioconservazione di NRCMs, ma anche allora la redditività rimane bassa 12. Sebbene DMSO aiuta a proteggere le cellule durante gratiszing, può essere tossico per le cellule a concentrazioni superiori a 1,5% 13. Studi precedenti hanno dimostrato che la rimozione lentamente DMSO dalle cellule, può migliorare la vitalità cellulare 14.
Abbiamo cercato di migliorare l'efficienza dei saggi cellulari NRCM dai cryopreserving cellule dopo l'isolamento. Questo permette alle cellule di essere scongelati e utilizzati quando necessario, riducendo la frequenza di isolamenti e consumo di animali. Usando questo metodo, si dimostra che è possibile cryopreserve NRCMs e scongelare per uso in un secondo momento. Dopo lo scongelamento le cellule mantengono una redditività accettabile e producono culture NRCM che sono positivi per la α-sarcomerica actinina (α-SA) e del contratto spontaneamente.
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Protocol
Il seguente protocollo è stato progettato per l'isolamento di cardiomiociti da una cucciolata di cuccioli di ratto neonatale (10-14 PUP). Se la dimensione cucciolata è significativamente diverso, la procedura può avere per essere scalata a compensare. I cuccioli devono essere di circa 48 ± 6 ore fa. Tutte le procedure qui sono stati approvati dalla North Carolina State University Istituzionale cura degli animali e Comitato Usage (IACUC).
1. cella di isolamento Preparazione
NOTA: Effettuare le seguenti operazioni il giorno prima di isolamento.
- Autoclave le seguenti: grandi forbici, forbicine, piccole pinze taglienti, grandi pinze. Utilizzare un ciclo di gravità per 60 min a un minimo di 121 ° C e un tempo di essiccazione di 30 min.
- Mettere 40 ml di soluzione di tripsina 0,1% in frigo a scongelare O / N. Mettete in frigorifero di Hank Sali Balanced Solution (HBSS) se non già freddo. Preparare un siero bovino fetale (FBS) soluzione madre dei media al 20%.
- In 400 ml di Iscsupporti Modified Dulbecco del ove (IMDM) aggiungere 100 ml di FBS, 5 ml di L-glutammina (200 mm), 2,5 ml di gentamicina (10 mg ml -1), e 0,9 ml di 2-mercaptoetanolo. Sterilizzare con filtro a vuoto. Conservare i supporti a 4 ° C per un massimo di 3 settimane e questo è scalabile per volumi più piccoli o più grandi. Diluire il 20% FBS magazzino supporti 1: 1 con IMDM per produrre il 10% FBS NRCM media. Fare solo in piccoli lotti per evitare il riscaldamento ripetute e raffreddamento dei media.
2. cella di isolamento Day 1
- Eseguire i seguenti lavori in una cappa di coltura per evitare la contaminazione dei campioni. Per una migliore tempistica iniziare questo lavoro nel pomeriggio poiché non vi è un O / N di incubazione.
- Preparare lavoro all'interno di una cappa di coltura sterile. Mettere panchina pad in cappa di coltura. Riempire due 250 ml bicchieri con il 70% di etanolo e inserire gli strumenti chirurgici in loro. Mettere piccolo secchio di ghiaccio nella cappa. Assicurarsi che sia abbastanza grande da contenere diversi tubi e un piatto di 150 mm. UV sterilizzare il cofano for 10 min. Porre 40 ml 0,1% tripsina su ghiaccio.
- Recupera ratti neonatali dalla madre. Per mantenere gli animali al caldo fino al momento dell'uso, mettetele in un contenitore isolato come un secchio di ghiaccio avvolto in un pad panchina per tenerli al caldo.
- Riempire un piatto di coltura di 150 mm con 25 ml di HBSS e disporli sul ghiaccio. Separa 2-3 garze e in luogo di lavoro. Tenendo pup dalla pelle sulla parte posteriore del collo, spruzzare con 70% etanolo e posto in cappuccio. NOTA: Per mantenere meglio la sterilità, questo si può essere fatto da un'altra persona che poi mette il cucciolo pulito nella cappa.
- Mantenere il cucciolo dalla pelle sul retro del collo. Quindi con i grandi forbici, in una rapida, forte taglio eutanasia per decapitazione. Asciugare il sangue con una garza. NOTA: A causa di variazioni nei requisiti IACUC, potrebbe essere più appropriato per pulire il cucciolo con un etanolo pulire anziché spruzzo. Assicuratevi di controllare con l'università IACUC da loro linee guida per questo passo.
- Continuare a tagliare verso il basso lato anteriore chest attraverso la gabbia toracica. Stringere la pelle del collo per aiutare ad aprire la gabbia toracica fino a quando il cuore è visibile. Utilizzando le piccole forbici, rimuovere il cuore e il luogo nel piatto cultura HBSS sul ghiaccio. Ripetere l'operazione per gli altri cuccioli.
- Rimuovere qualsiasi tessuto non-cardiaco dai campioni e agitare la HBSS delicatamente per lavare i cuori. Trasferire il tessuto cardiaco di un altro piatto di coltura contenente fresco HBSS e lavare ulteriormente il tessuto. Tagliare il tessuto ulteriormente fino a quando i pezzi sono 1-3 mm 3, e poi trasferire alla soluzione tripsina. Mettere soluzione tripsina il rocker a 4 ° C frigorifero O / N.
Isolamento cellulare Day 2
NOTA: Mentre aspirazione nei seguenti passaggi, utilizzare una pipetta piuttosto che una linea del vuoto. Il tessuto si muove facilmente, e una linea di vuoto intasare o rimuovere il tessuto ancora contenente cellule. E 'meglio utilizzare una pipetta per l'aspirazione, invece. Se il tessuto entra nella pipetta, pipetta indietro per rimuoverlo.
- Fai taliquote hree 10% NRCM media: uno con 25 ml e due con 15 ml. Posizionare un tubo 25 ml di media in 37 ° C bagnomaria. Aggiungere 4 ml HBSS a 5 tubi conici diversi da 15 ml e mettere tutti sul ghiaccio. Etichettare ogni 15 ml provetta # 1-5.
- Aggiungere 40 ml HBSS ad una provetta conica da 50 ml. Aggiungere 10 ml di HBSS per collagenasi, pipetta di sospendere, e combinano le soluzioni per creare 50 ml di 1 mg ml -1 soluzione collagenasi. Sterilizzare con 0,22 micron filtro a vuoto, e conservare a temperatura ambiente.
- Recupera cuore tubo tessuto / tripsina. Assicurarsi che la tripsina è chiara, e il tessuto appare soffice. Lasciare che il tessuto a stabilirsi a angolo di tubo e aspirare quanto più liquido possibile.
- Aggiungere 25 ml calda 10% FBS NRCM supporto al tubo e agitare a mano. Cap e ruotare in 37 ° C bagnomaria per 2 min. Aspirare il liquido di nuovo. Il tessuto deve galleggiare in questa fase; in caso affermativo, aspirare dal fondo della provetta.
- Aggiungere 10 ml di collagenasi. Ruotare in bagno d'acqua per 2 minuti o fino a quando la soluzione è torbida. Quickly aspirare il liquido. Aggiungere 10 ml di collagenasi fresco al tubo contenente il tessuto e ruotare in bagnomaria per 2 min. Pipetta a mescolare, soluzione di trasferimento a tubo # 1, e posto sul ghiaccio. Può non essere possibile rimuovere tutto il liquido. Ripetere i passaggi 3,2-3,6 per gli altri tre tubi da 15 ml coniche. Trasferire il liquido in eccesso al tubo # 5.
- Centrifugare 15 ml provette a 410 rcf per 8 minuti. Mentre centrifugazione, posizionare 15 ml 10% FBS NRCM tubo supporti a bagnomaria. Inserire 40 micron filtro cella sulla cima di una provetta conica da 50 ml e bagnato con 2 ml HBSS freddo.
- Aspirare il surnatante dalle cellule filate in giù. Aggiungere 6 ml HBSS freddo ad ogni provetta e risospendere. Sospensioni cellulari pipetta attraverso il filtro in 50 ml conica per rimuovere qualsiasi tessuto. Sciacquare i lati di ciascun tubo 15 ml con 3 ml HBSS freddo e aggiungere al filtro. Cellule centrifugare a 410 rcf per 10 min. Aspirare il surnatante. Risospendere pellet cellulare in 10 ml 10% dei media FBS NRCM e trasferimento a T-75 pallone. Sciacquare conica con i media 5ml e aggiungere al flchiedere.
- Incubare per 1 ora a 37 ° C e 5% CO 2. Posizionare lo scorso 15 ml 10% FBS NRCM tubo supporti in bagno d'acqua. Trasferire contenuto di T-75 in un pallone a T-175, T-75 lavare con 15 ml media e aggiungere al T-175. Incubare per 1 ora.
4. Crioconservazione
- Mettere congelamento media su ghiaccio. Media Transfer cellulare da T-175 a 50 ml tubo conico, e raccogliere 10 ml di sospensione cellulare per il conteggio delle cellule con Trypan blu. Centrifugare a 410 rcf per 5 min. Mentre centrifugazione, contare le cellule con un contatore di cellule.
- Aspirare i media cultura, e risospendere le cellule in congelamento dei media ad una concentrazione di 2-4 milioni di cellule per ml. Inserite 1 ml di sospensione cellulare in flacone criogenico, quindi posto fiale velocità controllata di raffreddamento congelamento container, e il luogo in -80 ° C freezer O / N. Entro 1-2 giorni, trasferire fiale in azoto liquido.
5. Le cellule scongelamento
- Piatto Coat in fibronectina sciogliendo 250 microlitri60, di fibronectina (concentrazione magazzino 1 mg ml -1) in 9,75 ml di acqua (concentrazione finale 0,025 mg ml -1). Aggiungere la soluzione sufficiente a coprire piastra di coltura e incubare a 37 ° C per almeno 30 minuti.
- In quattro 15 ml conici, fare le miscele DMSO / multimediali come segue aggiungendo DMSO al 20% di media. Aggiungi (5%) di 9,5 ml media con 500 microlitri DMSO. Aggiungi (2,5%) 9.75 ml media con 250 microlitri DMSO. Aggiungere 10 ml multimediale (fare due di questi).
- Riscaldare le miscele di media di cui sopra a 37 ° C bagnomaria. Rimuovere le cellule da azoto liquido e mettere in ghiaccio secco. Quando le miscele dei media sono calde, scongelare le cellule in 37 ° C bagnomaria fino a poco scongelati. Non lasciare le celle a bagnomaria per troppo tempo in quanto ciò potrebbe causare danni alle cellule.
- Trasferire contenuto del flacone criogenico al 5% tubo DMSO / media. Centrifugare a 410 rcf per 8 minuti. Aspirare il surnatante lasciando pellet. Aggiungi contenuto del 2,5% tubo DMSO / media per cella pellet e resuspend. Centrifugare a 410 rcf per 8 minuti. Aspirare il surnatante lasciando pellet.
- Aggiungere il contenuto di una 0% tubo DMSO / media alla cella pellet e risospendere. Centrifugare a 410 rcf per 8 minuti. Aspirare il surnatante lasciando pellet.
- Aggiungi contenuto del secondo 0% DMSO / media a pellet e risospendere. Prendete piccolo campione per il conteggio delle cellule. Centrifugare a 410 rcf per 8 minuti. Mentre centrifugazione cellule di conteggio in una emocitometro utilizzando Trypan Blue per etichettare le cellule morte. Quantità delle cellule Record, nonché redditività.
- Aspirare il surnatante lasciando pellet. Risospendere in 10% NRCM supporti (optional: aggiungere 100 micron bromodeossiuridina (BrdU)) e le cellule piastra su piatti fibronectina rivestite.
Cultura 6. cellulare
- Cellule piastra a circa 100k cellule per cm 2. Regolare la densità di placcatura basata sull'uso previsto della cultura. Preparare 2% NRCM supporti diluendo il 20% di media in IMDM in un rapporto di 1:10. Di seguito una descrizione di una cultura tipica. </ Li>
- Il giorno 1, lavare le cellule morte via con IMDM caldo, aggiungere il 10% NRCM (optional 100 micron BrdU). Il giorno 2, lavare via le cellule morte con IMDM caldo, aggiungere il 10% NRCM. Giorno 3-aggiungere 2% NRCM. Il giorno 4 aggiungere 2% NRCM. Il giorno 5 in modo che le cellule sono confluenti e percosse. Mantenere le cellule in coltura per circa una settimana. A quel punto i fibroblasti possono iniziare a superare in modo significativo i NRCMs.
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Representative Results
Dopo l'isolamento dei cardiomiociti neonatali di ratto, le cellule vengono congelate fino azoto liquido, e possono essere conservati per almeno diversi mesi. Tipicamente allo scongelamento, la vitalità determinata mediante analisi Trypan Blue sarà tra 40-60%. Anche se questo è inferiore rispetto ad altri tipi di cellule, con una corretta semina e coltura le cellule proliferano (Figura 1). Per verificare contrattilità, le cellule possono essere esposte utilizzando un microscopio a contrasto di fase. Le cellule dovrebbero iniziare a contrarsi spontaneamente entro circa tre giorni (Figura 2). Per immunocitochimica (ICC) saggi, le cellule sono state seminate in 4 pozzetti diapositive cultura con 200.000 cellule per bene. Al fine di dimostrare che le cellule in coltura sono NRCMs le cellule sono state contrassegnate con α-SA e ripreso con microscopia a fluorescenza. Ci sono numerose cellule positive α-SA indicano NRCMs nella cultura (Figura 4). Altri esperimenti sono stati condotti compresi culNRCMs Turing con exosomes derivati dalle cellule staminali cardiache umane per testare le proprietà rigenerative di esosomi (Figura 5).
Figura 1. NRCM proliferazione In Immagine di microscopia a fluorescenza di NRCM con colorazione per α-SA (verde), Ki67 (rosso) Vitro., E DAPI (blu) per entrambi (A) NRCMs appena isolate e (B) crioconservati NRCMs poi scongelati. Frecce indica cellule proliferanti (Ki67-positivo). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Contrazione della congelate e riutilizzate NRCM in vitro. NRCMs spontaneneamente contrazione in vitro. A differenza NRCMs appena isolati, potrebbero essere necessari alcuni giorni prima che la contrattilità è recuperato. Video sono stati registrati cinque giorni dopo lo scongelamento. Clicca qui per vedere il video.
Figura 3. Contrazione di Freshly Isolato NRCM In Vitro. Appena isolato NRCMs contrarre spontaneamente in vitro. Queste cellule cominceranno ad esporre la contrattilità molto prima. Video sono stati registrati 3 giorni dopo l'isolamento. Clicca qui per vedere il video.
Figura 4. La purezza di NRCM cultura. </ Strong> immagini al microscopio a fluorescenza di entrambi (A) NRCMs della cultura e (B) crioconservati e scongelati NRCMs appena isolate dopo 5 giorni di coltura. NRCMs mostrano positività per α-SA (verde), mentre i fibroblasti possono essere visti in cui nuclei (blu) non sono circondati da α-SA. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Utilizzo di Scongelato NRCM per Cell-Based Assay. Immagine di microscopia confocale di NRCMs, evidenziato da α-SA (verde), incubate con esosomi DII-etichettati (rosso) da cellule staminali cardiache. Nuclei cellulari marcati con DAPI (blu). Al fine di creare un modello di stress ossidativo, NRCMs sono stati trattati con 100 mM perossido di idrogeno per 18 ore, prima di essere incubate con exosomes per 4 ore per invertire lo stress ossidativo. Le frecce indicano le regioni di alte concentrazioni di exosome in alcune cellule. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo permette ai NRCMs di essere isolati, crioconservati e scongelati. Scongelamento delle cellule è una parte essenziale del procedimento. Una serie di diluizioni DMSO viene utilizzato per rimuovere lentamente DMSO dalle cellule 14. È importante che l'estrazione di DMSO essere eseguita rapidamente le cellule sono particolarmente sensibili a morire immediatamente dopo lo scongelamento. Se sono richieste celle più o meno per scongelamento, i volumi delle soluzioni DMSO possono essere scalati come necessario.
Una sfida per l'isolamento e la cultura NRCM è la rapida proliferazione di fibroblasti. Questo protocollo utilizza preplating che ha dimostrato di ridurre il numero dei fibroblasti 15. Preplating opere utilizzando palloni non rivestiti a cui i fibroblasti attaccano molto più veloce di cardiomiociti. La sequenza di cambiamenti dei media può essere modificato per ridurre la crescita dei fibroblasti. I fibroblasti saranno troppo grande NRCMs nel 10% NRCM media, ma la crescita dei fibroblasti è significativamente più lenta in 2% med NRCMia. Ci sono altri metodi quali gradienti di Percoll per rimuovere fibroblasti prima placcatura 16,17 o l'aggiunta di BrdU per rallentare la crescita dei fibroblasti 3. La crescita dei fibroblasti eccessivo può essere difficile da rilevare usando la microscopia fase, ma è facilmente dimostrato con NRCM colorazione specifica come α-SA (Figura 3). Se rimane eccessiva crescita dei fibroblasti, la quantità di FBS nei media può essere ridotto al 2% FBS il giorno 2. Se necessario, la placcatura può essere realizzata in 5% FBS mezzi, anche se questo può causare una aumentata morte cellulare.
Questa procedura è limitato e non è più vantaggioso se usando colture cellulari che richiedono grandi quantità di cellule 18,19. Nei casi in cui la quantità di cellule necessari approcci metà quantità di cellule possibili per raccogliere da una cucciolata, questa procedura richiederà più animali dal momento che circa la metà delle cellule sono persi a causa di crioconservazione. I vantaggi di crioconservazione sono maggiori quando si utilizza meno cells per saggi quali immunostaining.
Questo protocollo illustra i metodi per l'isolamento, crioconservazione, e successiva di NRCMs. Ci sono poche alternative, come ad esempio l'acquisto di cellule congelate dai fornitori, di utilizzare questo metodo, ma le cellule di acquisto possono essere un costo proibitivo per alcuni laboratori. I nostri metodi richiedono solo materiali e reagenti comunemente usati nelle cellule in coltura. Inoltre, utilizzando questi metodi può aumentare notevolmente l'efficienza e la flessibilità del lavoro di laboratorio, riducendo l'uso di animali da laboratorio. I metodi descritti producono colture vitali che possono essere utilizzati per la successiva studi in vitro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM (+25 mM HEPES +L-glutamine) | Gibco | 12440-046 | With added 25 mM HEPES and L-glutamine |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| HBSS (+Ca +Mg) | Corning | 21-020-CV | With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4 |
| Trypsin 0.25% | Gibco | 25300-056 | |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | Freezing media |
| Cryogenic Vial | Corning | 430659 | |
| Collagenase | Sigma | C1889-50MG | |
| 40 μm Cell Strainer | Greiner Bio-One | 542040 | |
| Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) | Corning | 431118 | |
| 50 ml Conical | Corning | 430828 | |
| 15 ml Conical | Corning | 430790 | |
| trypan blue | Cellgro | 25-900-CI | |
| Mr Frosty Freezing Container | ThermoScientific | 5100-0001 | |
| Millicell EZ SLIDES | Millipore | PEZGS0416 | |
| α-sarcomeric actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 51-7581KZ |
References
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