The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.
Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for α-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.
Cell kultur av hjärtmuskelceller är ett viktigt verktyg inom modern hjärtforskning. Neonatal råttkardiomyocyter (NRCMs) används vanligtvis eftersom isoleringen och kultur är lättare än för vuxna råttkardiomyocyter en. Den NRCM metoden har fortfarande flera begränsningar, inklusive en lång isoleringsförfarande och begränsad celltillväxt i skålen. Det finns många protokoll för isolering av NRCMs med mest allmänt kräver 4-48 tim arbete 2-6. Dessutom är cellerna ofta isoleras från 1 till 2 dagar gamla råttungar 2,4-7; tidpunkten för födseln kan vara oförutsägbara och konflikt med annat arbete i labbet. De isoleringar kan vara ineffektivt och oekonomiskt om endast en liten mängd celler som behövs för experiment. De flesta ansträngningar på att förbättra arbetsflödet fokus på att minska isoleringen tiden, men detta löser inte problemen med tids födelsen av valparna.
Som alternativ, många laboratorier utnyttjarkardiomyocyter härledda från embryonala stamceller (ESCS) eller inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). Emellertid kan omprogrammering och / eller differentiering processen vara mycket tidskrävande och kostsamt också. Det kan finnas andra problem när du använder dessa celler som in vitro myocyt modeller. Både ESC- och iPSC- härledda hjärtmuskelceller har visats uppvisa skillnader i elektrofysiologi från primära kardiomyocyter 8-10.
Dissocierade NRCMs är kan lagras i flera dagar med kylning 11, men detta gör det möjligt för långtidsförvaring. Flytande kväve används typiskt för att bevara celler under en längre tidsperiod, men kräver ett kryoskyddsmedel såsom dimetylsulfoxid (DMSO). Tidigare forskning har visat att den ideala koncentrationen mellan 5-10% DMSO i frysmedier möjliggör frysförvaring av NRCMs, men även då lönsamheten är fortsatt låg 12. Även DMSO skyddar cellerna under frizing, kan det vara toxiska för celler vid koncentrationer över 1,5% 13. Tidigare studier har visat att långsamt avlägsna DMSO från cellerna, kan förbättra cellviabilitet 14.
Vi sökte att förbättra effektiviteten i NRCM cellbaserade analyser genom cryopreserving cellerna efter isolering. Detta möjliggör för cellerna att tinas och användas när det är nödvändigt, vilket minskar frekvensen av isoleringar och konsumtion av djur. Med användning av denna metod, visar vi att det är möjligt att cryopreserve NRCMs och tina dem för användning vid ett senare tillfälle. Efter upptining cellerna bibehålla en acceptabel lönsamhet och producera NRCM kulturer som är positiva för α-sarcomeric actinin (α-SA) och kontrakts spontant.
Detta protokoll möjliggör för NRCMs skall isoleras, frysförvarade, och tinas. Upptining av cellerna är en avgörande del av förfarandet. En serie DMSO utspädningar används för att sakta ut DMSO från cellerna 14. Det är viktigt att extraktionen av DMSO utföras snabbt när cellerna är särskilt känsliga för att dö omedelbart efter upptining. Om fler eller färre celler erfordras för upptining, kan volymerna av DMSO-lösningar skalas efter behov.
En utmaning till NRC…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by funding from American Heart Association 12BGIA12040477, NC State University Chancellor’s Faculty Excellence Program, and National Natural Science Foundation of China H020381370216.
IMDM (+25mM HEPES +L-glutamine) | Gibco | 12440-046 | With added 25mM HEPES and L-glutamine |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
HBSS (+Ca +Mg) | Corning | 21-020-CV | With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4 |
Trypsin 0.25% | Gibco | 25300-056 | |
Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | Freezing media |
Cryogenic Vial | Corning | 430659 | |
Collagenase | Sigma | C1889-50MG | |
40μm Cell Strainer | Greiner Bio-One | 542040 | |
Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) | Corning | 431118 | |
50mL Conical | Corning | 430828 | |
15mL Conical | Corning | 430790 | |
trypan blue | Cellgro | 25-900-CI | |
Mr Frosty Freezing Container | ThermoScientific | 5100-0001 | |
Millicell EZ SLIDES | Millipore | PEZGS0416 | |
α-sarcomeric actinin antibody | Sigma | A7811 | |
Fibronectin | Corning | 356008 | |
Bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 51-7581KZ |