Protocol
1. Framställning av 3% 2-hydroxietyl Agaros
- Till en ren, torr 100 ml glasflaska, tillsätt 0,9 g 2-hydroxietyl agaros (Agarose VII) följt av 30 ml destillerat vatten.
- Microwave blandningen under 15 sekunder och snurra försiktigt. Upprepa detta steg åtminstone tre gånger tills agarospulvret upplöses helt.
- Autoklavera lösningen innehållande flaska för 15 minuter.
- Låt agaroslösningen svalna till RT innan ytterligare användning. Förvara lösningen vid RT.
2. Framställning av det undre skiktet: 0,6% agarosgel
- Pre-varm flera 5 ml och 10 ml pipetter i en 37 ° C inkubator för att förhindra agarosen stelnar i pipetten vid hantering.
- Delvis lossa locket flaskan och mikrovågsugn den färdiga 3% 2-hydroxietyl agaroslösningen i 15 sek. Sedan, virvla lösningen försiktigt och mikrovågsugn för ytterligare 15 sekunder. VARNING: Var försiktig när du snurra AgaroSE lösning eftersom lösningen stiger upp när de utsätts för luft och kan spilla över.
- Om det finns rest fast gel i flaskan, mikrovågsugn för några sekunder.
- Håll flaskan innehåller agaroslösningen i en 45 ° C vattenbad under nästa steg för att förhindra att agaroslösningen stelnar i förtid.
- Varm MCF10DCIS media i en 37 ° C vattenbad. Obs: MCF10DCIS media består av DMEM / F12, 5% hästserum, 5% penicillin streptomycin.
- Överför 3 ml av agaroslösningen 3% genom att använda förvärmda pipetter i en steril 50 ml koniska rör.
- Omedelbart lägga 12 ml varm MCF10DCIS media och vänd försiktigt koniska röret för att blanda agaros med media. Försök att inte bilda några bubblor eftersom det kommer att störa kolonin räknar senare.
- Försiktigt till 2 ml av denna blandning i varje brunn i en 6-brunnars odlingsplatta utan att bilda några luftbubblor.
- Inkubera 6-brunnars odlingsplatta horizontally på en plan yta vid 4 ° C under 1 h för att låta blandningen stelna.
- Efter det att blandningen stelnar, placeras plattan i en 37 ° C inkubator i 30 minuter. Det understa lagret är nu klar för användning.
3. Framställning av cellinnehållande lager: 0,3% agarosgel
- Trypsinize MCF10DCIS celler och späd dem till en cellkoncentration av 4 x 10 4 / ml.
- Ta 2 ml av 3% agaros med hjälp av förvärmda pipetter och överför till en steril 50 ml koniska rör.
- Omedelbart till 8 ml MCF10DCIS media till den koniska röret och vänd försiktigt för att blanda agaros med media. Undvik att bilda några bubblor.
- Ta 2 ml av de MCF10DCIS celler (4 x 10 4 / ml) och behandla med BB-CLA (0 ^ M (DMSO) eller 1 ^ M).
- I en 1: 1 utspädning, blanda cellerna med 0,6% agaros.
- Ta 1 ml av cell agaros blandningen och försiktigt lägga på bottenskiktet i 6-brunnars odlings psen (2 x 10 4 celler / ml).
- Placera 6-brunnars odlingsplatta horisontellt på en plan yta vid 4 ° C under minst 15 min för att tillåta det översta lagret stelna.
- Efter det att blandningen stelnar, placeras plattan i en 37 ° C inkubator under en vecka före tillsats matningsskiktet.
4. Beredning av matarskikt: 0,3% agarosgel
- Mikrovågsugn den färdiga 3% 2-hydroxietyl agaroslösning under 15 sek. virvla lösningen försiktigt och mikrovågsugn för ytterligare 15 sekunder.
- Jämvikta agaroslösningen flaskan i ett 45 ° C vattenbad.
- Värm MCF10DCIS media i en 37 ° C vattenbad.
- Blanda 1 ml 3% -ig lösning med 9 ml varm MCF10DCIS medier i en 50 ml koniska rör och vänd försiktigt för att blanda agaros med media. Undvik att bilda luftbubblor.
- Behandla blandningen med BB-CLA (0 iM (DMSO) eller 1 mikrometer).
- Försiktigt tillsätt 1 ml av denna blandning (utan förming bubblor) i varje brunn på 6-brunnars odlingsplatta innehållande botten och mjuka lager.
- Placera 6-brunnars odlingsplatta horisontellt på en plan yta vid 4 ° C under minst 15 min för att låta blandningen stelna.
- Efter matarskikt stelnar, placeras plattan i en 37 ° C inkubator.
- Upprepa detta utfodringsförfarande veckovis genom att lägga 1 ml 0,3% agaros / medium / behandlingslösning på det befintliga matarskikt för att fylla cellerna med nya medier tills kolonibildning observeras. Obs: agar i de mjuka och matarskikt är mycket mjuk och därför kommer de tillsatta näringsämnen från matarskikt lätt diffundera in i cellinnehållande skiktet för att nå cellerna.
5. Datainsamling
- Efter 2,5 veckor av celltillväxt i mjuk agar, räkna antalet kolonier i varje brunn med användning av ett ljusmikroskop. För att underlätta kvantifiering, skriva ut ett rutnät på en öppenhet och fäst gallret till6-brunnar för att hjälpa till att lokalisera där cellerna är under räkning. Sedan kolonistorlek (som kvantifieras genom diametern av varje koloni) kommer att variera, fördefiniera en referenskolonistorlek för att bestämma vilka kolonier görs. Till exempel, bland annat koloni storlekar av 70 um eller större i dataanalysen.
- Lagra proverna vid 4 ° C för att förhindra ytterligare kolonibildning och för framtida räkning. Täta 6-brunnars odlingsplatta med Parafilm för att förhindra gelerna från att torka ut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den mjukagar-kolonibildningsanalys kan användas för ett brett spektrum av tillämpningar som dokumenterar tumorigeniciteten av cancerceller. En stor fördel med denna teknik är att den halvfasta matrisen gynnar selektivt tillväxten av celler som kan proliferera i ett förankringsoberoende sätt. Detta drag är huvudsakligen uppvisas av cancerceller men inte av normala celler. Vi använder främst denna teknik för att testa effekten av tumörtillväxthämning av droger och att testa effekten av överuttryck eller utarmning av våra gener av intresse, inklusive PADI gener på tumorigeniciteten av bröstcancerceller. Här bedömde vi effekten av BB-CLA på tumörogen hämning av PADI2-överuttryck MCF10DCIS celler (Figur 1 och 2).
Resultaten visar att BB-CLA hämmar signifikant bildningen av MCF10DCIS cellhärledda kolonier. Figur 3 visar att, i närvaro av en PADI-inhibitor, t här var en minskning av både kolonibildning och kolonistorlek jämfört med DMSO-kontroll. [Anm.: BB-CLA löstes i DMSO och sålunda var DMSO användes som kontroll] Storleken på kolonierna för BB-CLA behandlade MCF10DCIS celler var huvudsakligen inom området 20 till 100 ^ m, medan storleken på kolonierna för DMSO kontroll uppvisade ett större utbud av 70 till 150 um efter 2,5 veckors tillväxt.
Kolonier större än 70 pm räknades och analyserades (Figur 4). Det fanns i genomsnitt 3536 kolonier i DMSO kontroll medan endast 1967 kolonier ses i BB-CLA-behandlade gruppen efter 2,5 veckors mjuk agar kultur. Detta representerar en 44% minskning av den genomsnittliga kolonibildning i närvaro av en iM BB-CLA, vilket tyder på en betydande tumörframkallande inhibering av bröstcancerceller (MCF10DCIS celler) genom PADI inhibitorn.
pload / 52.727 / 52727fig1.jpg "/>
Figur 1. kemiska strukturen hos BB-CLA.
Figur 2. Schematisk översikt av protokollet för Soft Agar kolonibildningsanalys. Varje brunn i 6-brunnsodlingsplattor belades först med 0,6% agarosgel (bottenskikt). En 0,3% agarosgel blandning innehållande MCF10DCIS celler och antingen BB-CLA-inhibitor (1 pM) eller DMSO (kontroll) till därefter skiktades på toppen av 0,6% gel. En gång i veckan, ades agarosgelen blandningen 0,3% (innehållande BB-CLA) sattes på toppen av det mjuka skiktet. Efter 2 till 4 veckor, var kolonibildning observeras och räknades för dataanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Bilder av kolonibildning i BB-CLA-behandlade MCF10DCIS celler. MCF10DCIS celler odlades i mjuk agar i närvaro (1 | iM BB-CLA) eller frånvaro av BB-CLA (0 ^ M DMSO). Efter 2,5 veckor, kolonier avbildas med ett inverterat mikroskop för låg förstoring bilder och ett ljusmikroskop för hög förstoring bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Kvantifiering av MCF10DCIS koloniantal efter BB-CLA behandling. MCF10DCIS celler odlades i mjuk agar vid olika koncentrationer av BB-CLA (0 ^ M (DMSO), eller en iM BB-CLA). Efter 2,5 veckor, individuella kolonier större then 70 pm räknades. Experimenten upprepades fyra gånger (n = 4). Den statistiska signifikansen av totala skillnaden celltal mellan kontroll- och behandlingsproverna bestämdes genom två-prov t-test (* p <0,005).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hastigheten för kolonibildning i mjuk agar varierar beroende på celltypen 9. Därför, för att antalet celler att börja med bör optimeras och justeras i enlighet därmed. En föreslagen start intervall är mellan 5 x 02 till 01 oktober x 10 4 celler per brunn med en 6-brunnar. Dessutom varierar kolonistorlek beroende på tillväxthastigheten för varje cell. Därför behövs ett fördefinierat en cut-off för kolonistorlek att kommentera enskilda kolonier för nedströms kvantitativa analyser. Här, kolonier större än 70 | im kvantifierades för att undvika införandet av icke-prolifererande celler härledda från den initiala pläteringen.
För optimal tillväxt, när du gör 3D agarosgeler, är det lämpligt att använda samma cellodlingsmedium som normalt används för 2D cellkulturer. Detta beror på att ändra mediet ofta gånger förändrar celler tillväxthastighet, vilket sålunda nödvändiggör ytterligare passage för att tillåta cellerna att anpassa sig till det nya mediet. Till exempelKan MCF10DCIS odlas optimalt i RPMI-1640, DMEM, eller DMEM / F12-medium. När emellertid MCF10DCIS odlingsmedier ändras från RPMI-1640 till DMEM / F12, finns det en märkbar minskning av cellproliferationshastighet. Dessutom bör försiktighet iakttas för att upprätthålla serumkoncentrationer vid en konstant nivå, eftersom utan serum kommer kolonibildning hämmas 10. Vidare, efter det att agarosen är microwaved, låta flaskan uppnå jämvikt i en 45 ° C vattenbad före blandning med medium innehållande celler för att förhindra överhettning av cellerna. Med tanke på att agaros stelnar snabbt vid rumstemperatur, rekommenderar vi också att alla pipetter och 6-brunnars odlingsplattor förvärms i en 37 ° C inkubator före tillsats agaroslösning för att förhindra för tidig stelning vid hantering.
Medan mjukagar-kolonibildning teknik är ett värdefullt verktyg för att mäta tumorigenicitet i en rad olika cancercellinjer, inte några rader inte växa i mjuk agar. Anothennes potentiell nackdel med metoden är att viabla celler inte kan återvinnas när de stryks ut i mjukagar. Dessutom, om en förening har en kortare biotillgänglighet period, kommer matnings steg måste utföras oftare (dvs. varannan dag) och proverna kommer att behöva samlas in mindre än sju dagar. Tröskeln för kolonin storlek kommer också att behöva minskas samtidigt tillåta för potentiella skillnader mellan de prover som ska observeras. I dessa fall skulle kontroller måste införlivas för att optimera experimentella parametrar för att minimera falskt positiva och falskt negativa resultat. Dessutom kan denna teknik vara tidskrävande och svårt när testa ett stort antal prover. Emellertid har tekniska framsteg bidragit till att övervinna några av dessa begränsningar. Den konventionella mjuk agar analys (vilket framgår av detta manuskript) använder normalt 6-brunnars odlingsplattor eller 6mm odlingsskålar. Med automatiserade plattläsare, dock Multiple prover kan behandlas i 384-brunnsplattor 11. Till exempel, utredare förinstallerade tumörceller med färgämnen såsom alamarBlue och tetrazoliumsalter färgämnen och kolonier kvantifieras med hjälp av plattläsare, vilket undanröjer behovet av att manuellt räkna koloni nummer 11. Denna hög genomströmning förmåga är därför mottaglig för storskaliga cancer drogskärmar.
Sammanfattningsvis är den mjuka agar analysen ett värdefullt preklinisk teknik som kan användas för att bedöma tumorigeniciteten av ett brett utbud av cancerceller (bröst, prostata, äggstockar och andra) med avseende på deras känslighet för läkemedel, hormoner, värme, hypoxi, och en mängd andra villkor behandling. Analysen fortsätter att ge en enkel och informativ verktyg för cancerforskare som vill att bättre förstå mekanismerna bakom cancerutveckling och testa antitumörpotential av nya cancerterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Axiopot | Carl Zeiss Microscopy | 1021859251 | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
| HyClone Donor Equine Serum | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| 2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |
References
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197, 461-463 (1977).
- Wang, L. H. Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells. Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).
- Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).
- Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction. J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).
- Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis. Biochem Res Int. , 895343 (2012).
- McElwee, J. L., et al. Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. BMC Cancer. 12, 500 (2012).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice. Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).
- Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).
- Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations. J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).
- Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum. Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).
- Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound. J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).
