Protocol
1. Получение 3% 2-гидроксиэтил агарозном
- В чистую, сухую стеклянную колбу на 100 мл, добавляют 0,9 г 2-гидроксиэтил агарозы (агарозном VII) с последующим 30 мл дистиллированной воды.
- Микроволновая печь смесь в течение 15 сек и нежно вихревой. Повторите этот шаг, по крайней мере еще три раза, пока агарозном порошок полностью не растворится.
- Автоклав, содержащий раствор бутылку в течение 15 мин.
- Разрешить раствор агарозы остыть до комнатной температуры перед дальнейшим использованием. Хранить раствор при комнатной температуре.
2. Подготовка нижнего слоя: 0,6% агарозном геле
- Предварительно теплой несколько 5 мл и 10 мл пипетки в 37 ° С инкубатор, чтобы предотвратить затвердевание агарозы в пипетку при обращении.
- Частично ослабить крышку бутылки и микроволновой печью готовые 3% 2-гидроксиэтил раствор агарозы в течение 15 сек. Затем нежно вихревой решение и микроволновая печь еще 15 сек. ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны при закрученной AgaroРаствор существу, потому что раствор поднимается при контакте с воздухом, и может распространиться.
- Если остаточная твердый гель в бутылке, микроволновая печь на несколько секунд.
- Держите бутылку, содержащую агарозы решение в водяной бане при 45 ° в течение следующих шагов по предотвращению раствора агарозы затвердевание преждевременно.
- Теплый MCF10DCIS СМИ в С на водяной бане 37 °. Примечание: MCF10DCIS носитель состоит из DMEM / F12, 5% лошадиной сыворотки, 5% пенициллина стрептомицина.
- Передача 3 мл 3% -ного раствора агарозы с использованием подогретого пипетки в стерильный 50 мл коническую пробирку.
- Сразу добавить 12 мл теплой MCF10DCIS СМИ и аккуратно переверните коническую трубку, чтобы смешать агарозы со СМИ. Старайтесь не образуют пузырьки, как это будет мешать колонии считая позже.
- Осторожно добавляют 2 мл этой смеси в каждую лунку планшета для культивирования 6-луночный без образования пузырьков воздуха.
- Выдержите культура пластины Horizonta 6-аLLY на плоской поверхности при 4 ° С в течение 1 ч, чтобы дать смеси затвердеть.
- После того как смесь затвердеет, поместите пластину в 37 ° C инкубаторе в течение 30 мин. Нижний слой готов к использованию.
3. Подготовка клетки, содержащие слой: 0,3% агарозном геле
- Trypsinize MCF10DCIS клетки и разбавить их концентрации клеток 4 х 10 4 / мл.
- Возьмите 2 мл 3% агарозы с использованием подогретого пипеток и передать в стерильный 50 мл коническую трубку.
- Сразу добавить 8 мл MCF10DCIS СМИ конической трубе и аккуратно переверните смешать агарозы со СМИ. Избегайте образования пузырьков.
- Принимать 2 мл клеток MCF10DCIS (4 х 10 4 / мл) и обработать BB-CLA (0 мкм (ДМСО) или 1 мкМ).
- В разведении 1: 1, смесь клеток с 0,6% агарозы.
- Принимать по 1 мл смеси клеток-агарозы и осторожно добавить на нижнем слое культуральной р 6-луночногоконце (2 х 10 4 клеток / мл).
- Место культуры пластины 6-а горизонтально на плоской поверхности при 4 ° С в течение не менее 15 мин, чтобы верхний слой затвердевать.
- После того как смесь затвердеет, поместите пластину в 37 ° C инкубаторе в течение недели, прежде чем добавлять фидерного слоя.
4. Подготовка фидерного слоя: 0,3% агарозном геле
- Микроволновая печь готовые 3% 2-гидроксиэтил раствор агарозы в течение 15 сек. нежно вихревой решение и микроволновая печь еще 15 сек.
- Равновесие агарозы бутылку раствора в водяной бане при 45 ° C.
- Теплый СМИ MCF10DCIS на водяной бане 37 ° C.
- Смешайте 1 мл 3% раствора агарозы с 9 мл теплой MCF10DCIS СМИ в 50 мл коническую трубку и аккуратно переверните смешать агарозы со СМИ. Избегайте образования пузырьков воздуха.
- Treat смеси с BB-CLA (0 мкм (ДМСО) или 1 мкМ).
- Аккуратно добавить 1 мл этой смеси (без дляМин пузырьков) в каждую лунку культуральной пластины 6-луночный содержащей дно и мягкие слои.
- Место культуры пластины 6-а горизонтально на плоской поверхности при 4 ° С в течение не менее 15 мин, чтобы дать смеси затвердеть.
- После подачи слой затвердевает, поместите пластину в 37 ° C инкубатора.
- Повторите эту процедуру кормления еженедельно путем наложения 1 мл 0,3% раствора агарозы / средний / лечения на существующей фидерного слоя для пополнения клетки с новыми СМИ, пока не наблюдается образование колоний. Примечание: Агар в мягких и фидерных слоях очень мягким и, следовательно, добавлены питательные вещества из фидерного слоя будет легко диффундируют в слой клеток, содержащих достичь клетки.
5. Сбор данных
- Через 2,5 недели роста клеток в мягком агаре, подсчитывают количество колоний в каждой лунке с помощью светового микроскопа. Для облегчения количественного, распечатать сетку на прозрачности и прикрепите сетку6-луночный планшет, чтобы помочь определить, где клетки во время подсчета голосов. Так размер колонии (как количественно диаметра каждой колонии) будет изменяться, заранее определить размер опорного колоний, чтобы определить, какие колонии будет забито. Например, включают размеры колонии 70 мкм или больше, при анализе данных.
- Хранить образцы при температуре 4 ° С, чтобы предотвратить дальнейшее образование колоний и для будущего подсчета. Печать культуру пластину 6-а с парафильмом, чтобы предотвратить гели от высыхания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мягком агаре анализа образования колоний может быть использован для широкого диапазона приложений, документирующих онкогенность раковых клеток. Основным преимуществом этого метода является то, что полутвердой матрице избирательно способствует росту клеток, которые могут размножаться в опоре-независимым способом. Эта черта в основном выставлены раковых клеток, но не нормальные клетки. Мы в первую очередь использовать эту технику, чтобы проверить эффективность торможения роста опухоли по наркотикам и для проверки влияния повышенной экспрессией или истощения наших генов интерес, в том числе генов PADI, на туморогенности клеток рака молочной железы. Здесь мы оценили воздействие BB-CLA на онкогенного ингибирования PADI2 сверхэкспрессией MCF10DCIS клетки (фиг.1 и 2).
Результаты показывают, что BB-CLA значительно ингибирует образование MCF10DCIS клеток, полученных колоний. Рисунок 3 показывает, что в присутствии ингибитора PADI, т Здесь отмечено снижение как образование колоний и колонии размера по сравнению с контролем ДМСО. [Примечание:. BB-КЛК растворяли в ДМСО и таким образом, ДМСО использовали в качестве контроля] Размер колоний для BB-CLA обрабатывают MCF10DCIS клетки были преимущественно в пределах от 20 до 100 мкм, а размер колоний для ДМСО контроль выставлены более широкий диапазон от 70 до 150 мкм после 2,5 недель роста.
Колонии больше, чем 70 мкм подсчитывали и анализировали (рисунок 4). Был в среднем 3536 колоний в контроле ДМСО в то время как только 1967 колонии были замечены в BB-CLA группе, получавшей после 2,5 недель мягкой агаровой культуры. Это представляет собой 44% -ное снижение средней образования колоний в присутствии 1 мкМ BB-CLA, что указывает на значительное онкогенного ингибирование раковых клеток молочной железы (MCF10DCIS клетки) ингибитором PADI.
pload / 52727 / 52727fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Химическая структура BB-CLA.
Рисунок 2. Схема Обзор протокола для формирования анализе Мягкая агар колонии. В каждую лунку с культурой пластин 6-а был сначала покрывают 0,6% агарозном геле (нижний слой). Смесь агарозном геле 0,3%, содержащий клетки MCF10DCIS и либо BB-CLA ингибитор (1 мкМ) или ДМСО (контроль), то слой поверх на 0,6% геле. Раз в неделю, 0,3% агарозном геле смесь (содержащую BB-CLA) добавили в верхней части слоя мягкой. После 2 до 4 недель, образование колоний наблюдалось и подсчитывали для анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Количественное определение MCF10DCIS колонии номер после BB-КЛК Лечение. MCF10DCIS клетки выращивали в мягком агаре при различных концентрациях BB-CLA (0 мкМ (ДМСО), или 1 мкМ BB-CLA). Через 2,5 недели, отдельные колонии больше гоА.Н. 70 мкм подсчитывали. Эксперименты были повторены 4 раза (п = 4). Статистическая значимость общей разницей между клеточной массы контрольных образцов и лечения определяли по т-двухвыборочный Стьюдента (* р <0,005).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Скорость образования колоний в мягком агаре варьируется в зависимости от типа клеток 9. Таким образом, количество клеток, чтобы начать с должны быть оптимизированы и соответствующим образом скорректированы. Предложил начать диапазон от 5 × 10 2 до 1 · 10 4 клеток на лунку, используя 6-луночный планшет. Кроме того, размер колонии изменяется в зависимости от скорости роста каждой клетки. Таким образом, предопределенный отсечки по размеру колонии необходимо, чтобы комментировать отдельные колонии для последующих количественных анализов. Здесь колонии больше, чем 70 мкм были количественно, чтобы избежать включения не-пролиферирующие клетки, полученные от первоначального посева.
Для оптимального роста, делая 3D-агарозном геле, целесообразно использовать тот же клеточную культуральную среду, обычно используемую для культур клеток 2D. Это потому, что изменение среды часто раз изменяет скорость роста клеток, что требует дополнительного пассирования, чтобы позволить клеткам адаптироваться к новой среде. Например, MCF10DCIS клетки могут быть выращены в оптимальной среде RPMI-1640, DMEM или DMEM / F12 средах. Однако, когда MCF10DCIS культуральные среды изменяется от RPMI-1640 с DMEM / F12, имеется заметное уменьшение скорости пролиферации клеток. Кроме того, следует соблюдать осторожность, чтобы поддерживать концентрацию в сыворотке на постоянном уровне, поскольку, без сыворотки, образование колоний будет запрещено 10. Кроме того, после того, агарозу в микроволновой печи, позволяют бутылка для уравновешивания в водяной бане при 45 ° перед смешиванием с среду, содержащую клетки, чтобы предотвратить перегрев клетки. Учитывая, что в агарозном быстро затвердевает при комнатной температуре, мы рекомендуем, чтобы все пипетки и культуральные планшеты 6-луночные предварительно нагревают в 37 ° C инкубаторе перед добавлением раствора агарозы, чтобы предотвратить преждевременное затвердевание при работе.
В то время как метод мягкой агар образование колоний является ценным инструментом для измерения онкогенность в диапазоне линий раковых клеток, некоторые линии не растут в мягком агаре. Anotее потенциальный недостаток метода состоит в том, что жизнеспособные клетки не могут быть восстановлены, как только они высевают в мягком агаре. Кроме того, если соединение имеет более короткий период биодоступность, шаг подачи нужно будет проводить чаще (т.е. каждый день), и образцы должны быть собраны менее чем за семь дней. Порог размера колонии также должны быть сокращены, а еще учитывая возможные различия между образцами, которые необходимо соблюдать. В этих случаях, управления должны быть включены, чтобы оптимизировать параметры экспериментальных чтобы свести к минимуму ложные-положительных и ложно-отрицательные результаты. Кроме того, этот метод может быть трудоемким и сложным при тестировании большого количества образцов. Тем не менее, технологические достижения помогли преодолеть некоторые из этих ограничений. Обычный мягкий агар анализ (как описано в этой статье), как правило, использует культуры пластины 6-а или 6мм культуры блюда. С автоматизированных пластинчатых читателей, однако, Умножитье образцы могут быть обработаны в пластинах 384-луночных 11. Например, исследователи предварительно загружены опухолевые клетки с красителями, такими как AlamarBlue и тетразольных красителей и колоний количественно с помощью планшет-ридер, таким образом, устраняя необходимость вручную рассчитывать колонии номер 11. Эта возможность высокой пропускной, следовательно, пригодны для крупномасштабных экранов наркотиков рака.
В целом, мягкая агар анализ является ценным доклинические метод, который может быть использован для оценки онкогенность широкого диапазона раковых клеток (рак молочной железы, простаты, яичников и других) в отношении их чувствительности к препаратам, гормонов, тепла, гипоксия, и множество других условий лечения. Анализ продолжает предоставлять простой и информативный инструмент для рака исследователей, которые хотят, чтобы лучше понять механизмы опухолевой прогрессии и проверить потенциал анти-опухолевого новых методов лечения рака.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Axiopot | Carl Zeiss Microscopy | 1021859251 | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
| HyClone Donor Equine Serum | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| 2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |
References
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197, 461-463 (1977).
- Wang, L. H. Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells. Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).
- Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).
- Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction. J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).
- Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis. Biochem Res Int. , 895343 (2012).
- McElwee, J. L., et al. Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. BMC Cancer. 12, 500 (2012).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice. Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).
- Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).
- Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations. J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).
- Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum. Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).
- Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound. J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).
