Concentric Gel system att studera den Biofysikalisk roll Matrix mikromiljö på 3D Cell Migration
Summary
De mekaniska egenskaperna och mikrostrukturen hos den extracellulära matrisen påverkar starkt 3D migration av celler. En in vitro-metod för att studera spatiotemporal cellmigration beteende biofysiskt variabla miljöer, både befolkning och enskilda cellnivå, beskrivs.
Abstract
Förmågan hos celler att migrera är av avgörande betydelse i en mängd olika cellfunktioner genom hela livet från embryonal utveckling och sårläkning till tumör och cancermetastas. Trots intensiva forskningsinsatser, de grundläggande biokemiska och biofysiska principer cellmigration fortfarande inte helt klarlagda, särskilt i de fysiologiskt relevanta tredimensionella (3D) mikromiljöer. Här beskriver vi en in vitro analys utformad för att medge kvantitativ undersökning av 3D cellmigration beteenden. Metoden utnyttjar cellens mechanosensing förmåga och benägenhet att migrera in i tidigare obesatt extracellulär matris (ECM). Vi använder invasionen av höggradigt invasiva bröstcancerceller, MDA-MB-231, i kollagengeler som ett modellsystem. Spridningen av cellpopulationen och migrationen dynamiken i enskilda celler under veckors odling kan övervakas med användning av levande cell imaging och analyseras för att extrahera spatiotemporally upplösta data. VidareMetoden är lätt att anpassa för olika extracellulära matriser, vilket ger ett enkelt men kraftfullt sätt att undersöka vilken roll biofysiska faktorer i mikromiljön på cellmigration.
Introduction
Migration av celler spelar en nyckelroll i olika fysiologiska reaktioner såsom embryonal utveckling, hemostas, och immunsvar samt i patologiska processer såsom kärlsjukdomar, inflammation och cancer 1. Dissekera de biokemiska och biofysiska faktorer som ligger bakom cellmigration är därför av grundläggande betydelse inte bara för att förstå de grundläggande principerna för cellulära funktioner, men också för att avancera olika biomedicinska tillämpningar, såsom vid vävnadsteknik, anti-metastas och antiinflammatoriskt läkemedelsutveckling. Sedan in vivo observation är tekniskt utmanande, har en hel del ansträngningar fokuserats på in vitro rekapitulation av cellmigration.
In vitro metoder för att studera cellmigration har till stor del utformats för analyser på tvådimensionella (2D) ytor, notably repa eller sårläknings analys 2. Sådana analyser erbjuder enkla experimentuppställning, lätt Live-cell imaging och ge användbara insikter i olika biokemiska mekanismerna bakom cellmigration. Men dessa analyser inte hänsyn till extracellulära matrix (ECM) arkitektur och ombyggnad, vilket är kritiska aspekter i förståelsen in vivo migration. Nyligen har det alltmer uppskattat att en 3D-kultur-modellen, ofta i kollagenbaserade matriserna 3, ger en plattform som bättre liknar in vivo situationen. Faktum celler uppvisar migrational dynamik som skiljer sig från de på 2D ytor, särskilt på grund av de olika dimensionalitet av miljön 4. Dessutom biofysiska och mekaniska egenskaper i matrisen påverkar lyhört cell migration 5, bland annat i samband med tumörcellinvasion 6.
Här presenterar vi en metod för att studera 3D cellmigration beteende i ECM med biofysiska egenskaper som lätt kan varieras med beredningsförhållanden. Cellerna ärseedade i en "inre gel" och tillåts att fly in i och invadera initialt acellulärt "yttre gel". Metoden bygger på cellens förmåga att känna igen förekomsten av, och benägenhet att migrera in, cellfria områden i ytter gel, som är nära kopplad till cell mechanosensing 7. I denna studie använder vi kollagennätverk som de ECM invaderade av mycket invasiva bröstcancerceller, MD-MBA-231. De mekaniska egenskaperna och mikrostrukturen hos både de inre och yttre geler kan avstämmas 8 och karakteriseras 9 för att åstadkomma fysiologiskt relevanta betingelser. Rekonstruktion och analys av cellspåren tillåter detaljerad kvantitativ undersökning av spatiotemporal migrationsbeteende både befolkningsnivå och individuell cellnivå. Viktigt installationen av den koncentriska gelsystemet efterliknar vivo vävnads topologi in genom att migrera celler, speciellt invaderande cancerceller, vilket ger viktiga insikter i införde fysiska mekanismer för cellmigration och metastasering.
Protocol
Representative Results
Discussion
In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been lar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar W. Sun och K. Jansen för de kritiska diskussioner, och erkänna stöd av Nano Biomekanik Lab vid National University of Singapore. NAK erkänner stöd av ett Marie Curie IIF Fellowship.
Materials
| Cell culture incubator | Fisher Scientific Pte Ltd | Model: 371, S/No 318854-6055 | |
| Confocal microscope | Nikon A1R | Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
| Fluorescent CellTracker dye CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| Glass-bottom dish | IWAKI Cell Biology | 3931-035 | 35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well |
| Hemocytometer | iN CYTO | DHC-N01 (Neubauer Improved) | |
| Microprocessor pH meter | Hanna Instruments | pH 211 | |
| Nutragen Collagen | Advanced BioMatrix | #5010-D | Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2) |
| Objective lens | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45. | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| pH meter | Sartorius | S/No 29153352 | Basic pH Meter PB-11 |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 |
References
- Horwitz, R., Webb, D. Cell migration. Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3D cell migration. Curr. Prot. Cell Biol. 10, 10-17 (2010).
- Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. New dimensions in cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 743-747 (2012).
- Grinnell, F., Petroll, W. M. Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2010).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Sun, W., Kurniawan, N. A., Kumar, A. P., Rajagopalan, R., Lim, C. T. Effects of migrating cell-induced matrix reorganization on 3D cancer cell migration. Cell. Mol. Bioeng. 7 (2), 205-217 (2014).
- Achilli, M., Mantovani, D. Tailoring mechanical properties of collagen-based scaffolds for vascular tissue engineering: the effects of pH, temperature and ionic strength on gelation. Polymers. 2 (4), 664-680 (2010).
- Kurniawan, N. A., Wong, L. H., Rajagopalan, R. Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks. Biomacromolecules. 13 (3), 691-698 (2012).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. J. R. Soc. Interface. 11 (99), 20140638 (2014).
- Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. J. The effect of fibrillar matrix architecture on tumor cell invasion of physically challenging environments. Biomaterials. 35 (25), 6954-6963 (2014).
- Wolf, K., et al. Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force. J. Cell Biol. 201 (7), 1069-1084 (2013).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. Collective cell migration: a mechanistic perspective. Physiology. 28 (6), 370-379 (2013).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).
- Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).
- Mouw, J. K., et al. Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression. Nat. Med. 20 (4), 360-367 (2014).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (8), 931-941 (2009).
- Wong, L. H., Kurniawan, N. A., Too, H. -. P., Rajagopalan, R. Spatially resolved microrheology of heterogeneous biopolymer hydrogels using covalently bound microspheres. Biomech. Model. Mechanobiol. 13 (4), 839-849 (2014).
- Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration. Cell. 125 (7), 1361-1374 (2006).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95 (11), 5374-5384 (2008).
- Wolf, K., et al. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion. Nat. Cell Biol. 9 (8), 893-904 (2007).
- Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophys. J. 105 (10), 2240-2251 (2013).
