गाढ़ा जेल प्रणाली 3 डी सेल प्रवास पर मैट्रिक्स microenvironment के biophysical का भूमिका का अध्ययन करने के लिए
Summary
यांत्रिक गुणों और बाह्य मैट्रिक्स के microstructure दृढ़ता से कोशिकाओं के 3 डी प्रवास प्रभावित करते हैं। इन विट्रो विधि जनसंख्या और अलग-अलग सेल दोनों स्तरों पर biophysically चर वातावरण में spatiotemporal सेल प्रवास व्यवहार का अध्ययन करने के लिए, वर्णित है।
Abstract
विस्थापित करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता ट्यूमर और कैंसर मेटास्टेसिस को भ्रूण के विकास से जीवन और घाव भरने के दौरान सेल कार्यों की एक विस्तृत विविधता में महत्वपूर्ण है। गहन अनुसंधान के प्रयासों के बावजूद, सेल प्रवास के बुनियादी जैव रासायनिक और biophysical सिद्धांतों अभी भी पूरी तरह से विशेष रूप से physiologically प्रासंगिक तीन आयामी (3 डी) microenvironments में, समझ नहीं रहे हैं। यहाँ, हम 3 डी सेल प्रवास व्यवहार का मात्रात्मक परीक्षा की अनुमति के लिए बनाया गया एक में इन विट्रो परख का वर्णन है। विधि पहले से खाली बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में विस्थापित करने के लिए सेल के mechanosensing क्षमता और प्रवृत्ति का लाभ उठाते। हम एक मॉडल प्रणाली के रूप में कोलेजन जैल में अत्यधिक आक्रामक स्तन कैंसर की कोशिकाओं के आक्रमण, एमडीए MB-231, का उपयोग करें। संस्कृति के हफ्तों में सेल की आबादी के प्रसार और व्यक्ति की कोशिकाओं के प्रवास गतिशीलता रहते सेल इमेजिंग का उपयोग पर नजर रखी और spatiotemporally हल डेटा निकालने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। और भी, विधि इस प्रकार सेल प्रवास पर microenvironment में biophysical कारकों की भूमिका की जांच के लिए एक सरल अभी तक शक्तिशाली तरीका पेशकश, विविध कोशिकी matrices के लिए आसानी से अनुकूल है।
Introduction
कोशिकाओं के प्रवास ऐसी भ्रूण के विकास, haemostasis, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में इस तरह के वाहिका रोगों, सूजन, कैंसर और एक के रूप में रोग प्रक्रियाओं में विभिन्न शारीरिक प्रतिक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सेल प्रवास अंतर्निहित जैव रासायनिक और biophysical कारकों विदारक सेलुलर कार्यों के बुनियादी सिद्धांतों को समझने के लिए, लेकिन यह भी इस तरह के ऊतक इंजीनियरिंग, विरोधी मेटास्टेसिस और विरोधी भड़काऊ दवा के विकास के रूप में विभिन्न जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों, अग्रिम करने के लिए न केवल इसलिए मूल रूप से महत्वपूर्ण है। इन विवो अवलोकन तकनीकी रूप से चुनौती दे रहा है के बाद से, के प्रयासों का एक बहुत सेल प्रवास के इन विट्रो आवृत्ति पर ध्यान केंद्रित किया गया है।
सेल प्रवास का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो के तरीकों में काफी हद तक सबसे विशेष रूप से, दो आयामी (2 डी) सतहों पर assays के लिए खरोंच या डिजाइन परख दो घाव भरने की गई है। ऐसे assays सरल प्रयोगात्मक स्थापना का प्रस्ताव है, आसान live-सेल इमेजिंग, और सेल प्रवास अंतर्निहित विभिन्न जैव रासायनिक तंत्र में उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। हालांकि, इन assays विवो प्रवास में समझ में महत्वपूर्ण पहलू हैं जो बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) वास्तुकला और remodeling, के लिए खाते में नहीं है। हाल ही में, यह तेजी से एक 3 डी संस्कृति मॉडल, अक्सर कोलेजन आधारित matrices के तीन में, बेहतर vivo स्थिति जैसा एक मंच प्रदान करता है कि सराहना की गई है। दरअसल, कोशिकाओं को विशेष रूप से की वजह से पर्यावरण 4 के विभिन्न dimensionality करने के लिए, 2 डी सतहों पर उन लोगों से अलग कर रहे हैं कि migrational गतिशीलता दिखा रहे हैं। इसके अलावा, मैट्रिक्स के biophysical और यांत्रिक गुणों संवेदनशीलता ट्यूमर सेल आक्रमण 6 के संदर्भ में, सहित सेल प्रवास 5 प्रभावित करते हैं।
यहाँ, हम तैयारी शर्तों के साथ आसानी से अलग किया जा सकता है कि biophysical गुणों के साथ ईसीएम में 3 डी सेल प्रवास व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। कोशिकाओं रहे हैंएक 'आंतरिक जेल "में वरीयता प्राप्त और में बचने के लिए और शुरू में अकोशिकीय" बाहरी जेल "पर आक्रमण करने की अनुमति दी जाती है। विधि बारीकी सेल 7 mechanosensing से जुड़ा हुआ है, जो बाहरी जेल में सेल मुक्त क्षेत्रों में विस्थापित करने के लिए सेल की उपस्थिति पहचान करने की क्षमता है, और प्रवृत्ति पर निर्भर करता है। इस अध्ययन में, हम अत्यधिक आक्रामक स्तन कैंसर की कोशिकाओं, एमडी-एमबीए-231 द्वारा हमला ECMs के रूप में कोलेजन नेटवर्क को रोजगार। यांत्रिक गुणों और दोनों आंतरिक और बाह्य जैल के microstructure 8 देखते और physiologically प्रासंगिक शर्तों को प्राप्त करने के लिए 9 लक्षण वर्णन किया जा सकता है। सेल पटरियों के पुनर्निर्माण और विश्लेषण जनसंख्या के स्तर पर और व्यक्तिगत सेल दोनों स्तर पर spatiotemporal प्रवास व्यवहार का विस्तृत मात्रात्मक परीक्षा अनुमति देते हैं। महत्वपूर्ण बात है, गाढ़ा जेल प्रणाली की स्थापना के इस प्रकार में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि की पेशकश की, विशेष रूप से कैंसर की कोशिकाओं पर हमला, पलायन कोशिकाओं द्वारा सामना में विवो ऊतक टोपोलॉजी mimicsसेल प्रवास और मेटास्टेसिस के शारीरिक तंत्र के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been lar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों महत्वपूर्ण विचार विमर्श के लिए डब्ल्यू सूर्य और लालकृष्ण Jansen धन्यवाद, और सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय में नैनो बायोमैकेनिक्स लैब द्वारा समर्थन को स्वीकार करते हैं। NAK एक मैरी क्यूरी IIF फैलोशिप द्वारा समर्थन मानता है।
Materials
| Cell culture incubator | Fisher Scientific Pte Ltd | Model: 371, S/No 318854-6055 | |
| Confocal microscope | Nikon A1R | Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
| Fluorescent CellTracker dye CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| Glass-bottom dish | IWAKI Cell Biology | 3931-035 | 35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well |
| Hemocytometer | iN CYTO | DHC-N01 (Neubauer Improved) | |
| Microprocessor pH meter | Hanna Instruments | pH 211 | |
| Nutragen Collagen | Advanced BioMatrix | #5010-D | Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2) |
| Objective lens | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45. | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| pH meter | Sartorius | S/No 29153352 | Basic pH Meter PB-11 |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 |
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