Summary

Gel System Concentric para estudiar el papel de Biofísica de Matrix Microambiente en la migración de células en 3D

Published: April 03, 2015
doi:

Summary

Las propiedades mecánicas y la microestructura de la matriz extracelular afectan fuertemente a la migración de las células 3D. Un método in vitro para estudiar el comportamiento de la migración celular espaciotemporal en entornos biofísico variables, tanto a la población y los niveles de células individuales, se describe.

Abstract

La capacidad de las células para migrar es crucial en una amplia variedad de funciones celulares durante toda la vida desde el desarrollo embrionario y la curación de heridas de tumor y la metástasis del cáncer. A pesar de intensos esfuerzos de investigación, los principios básicos bioquímicos y biofísicos de la migración de las células aún no se entienden completamente, especialmente en los microambientes (3D) tridimensionales fisiológicamente relevantes. Aquí se describe un ensayo in vitro diseñado para permitir el examen cuantitativo de los comportamientos de migración celular en 3D. El método explota la capacidad mechanosensing de la célula y la propensión a migrar en la matriz extracelular previamente desocupada (ECM). Usamos la invasión de células de cáncer de mama altamente invasivas, MDA-MB-231, en geles de colágeno como un sistema modelo. La difusión de la población de células y la dinámica de migración de las células individuales durante semanas de cultivo pueden ser monitoreados utilizando imágenes de células vivas y se analizan para extraer datos espaciotemporalmente resueltas. Además, El método es fácilmente adaptable para diversas matrices extracelulares, lo que ofrece una manera simple pero potente para investigar el papel de los factores biofísicos en el microambiente sobre la migración celular.

Introduction

La migración de las células juega un papel clave en diversas respuestas fisiológicas, tales como el desarrollo embrionario, la hemostasia, y la respuesta inmune, así como en procesos patológicos tales como enfermedades vasculares, la inflamación y el cáncer 1. La disección de los factores bioquímicos y biofísicos subyacentes migración celular es, por tanto, fundamentalmente importante no sólo para entender los principios básicos de las funciones celulares, sino también para avanzar diversas aplicaciones biomédicas, tales como en la ingeniería de tejidos, anti-metástasis y el desarrollo de fármacos antiinflamatorios. Dado que la observación in vivo es técnicamente difícil, una gran cantidad de esfuerzos se ha centrado en la recapitulación in vitro de la migración celular.

Los métodos in vitro para estudiar la migración celular en gran medida han sido diseñados para los ensayos en dos superficies dimensionales (2D), en particular el cero o cicatrización de la herida ensayo 2. Dichos ensayos ofrecen configuración experimental simple, fácil ganadoimágenes de células, y proporcionar información útil sobre diversos mecanismos bioquímicos que subyacen a la migración celular. Sin embargo, estos ensayos no dan cuenta de la matriz (ECM), la arquitectura y la remodelación extracelular, que son aspectos críticos en la comprensión de la migración vivo. Recientemente, se ha apreciado cada vez que un modelo de cultivo 3D, a menudo en matrices a base de colágeno-3, proporciona una plataforma que mejor se asemeja a la situación in vivo. De hecho, las células presentan dinámicas migratorios que son distintos de los de las superficies en 2D, especialmente debido a la diferente dimensionalidad del medio ambiente 4. Por otra parte, las propiedades biofísicas y mecánicas de la matriz afectan sensiblemente la migración celular 5, incluso en el contexto de la invasión de células tumorales 6.

A continuación, presentamos un método para estudiar el comportamiento de la migración celular 3D en ECM con propiedades biofísicas que pueden ser fácilmente variado, con condiciones de preparación. Las células sonsembradas en un "gel interior" y se les permite escapar hacia e invadir el "exterior de gel" inicialmente acelular. El método se basa en la capacidad de la célula para reconocer la presencia de, y la propensión a migrar a regiones libres de células en el exterior de gel, que está estrechamente vinculado a la celda mechanosensing 7. En este estudio, utilizamos redes de colágeno como las ECMs invadidos por las células del cáncer de mama altamente invasivos, MD-MBA-231. Las propiedades mecánicas y la microestructura tanto de los geles de interior y exterior se pueden sintonizar 8 y 9 caracterizan para lograr condiciones fisiológicamente relevantes. Reconstrucción y el análisis de las vías celulares permiten examen cuantitativo detallado del comportamiento de la migración espacio-temporal, tanto a nivel de población y nivel de células individuales. Es importante destacar que la configuración del sistema de gel concéntrica imita el tejido vivo topología en enfrentado mediante la migración de las células, especialmente las células invasoras de cáncer, ofreciendo así importantes conocimientos ena los mecanismos físicos de la migración celular y la metástasis.

Protocol

Cosecha 1. celular Obtener MD-MBA-231 desde la 37 ° C, 5% de CO2. Separe las células de la placa de cultivo de tejidos utilizando la solución de tripsina-EDTA 0,5%. Usar 1 ml de solución de tripsina-EDTA para células cultivadas en un matraz T25. Precipitar las células en un tubo cónico de 15 ml mediante centrifugación a 200 × g durante 4 min, aspirar el sobrenadante, y Resuspender las células en 5 ml de medio de cultivo. Contar la densidad celular, ρ, usando …

Representative Results

El ensayo de gel concéntrica que aquí se presenta se realizó utilizando células de cáncer de mama altamente invasivas, MDA-MB-231, con 2,4 mg / ml de gel de colágeno interior y una densidad de siembra de células de = 2 × 10 6 células / ml, como un ejemplo. Como se muestra en la Figura 2, por lo general después de unos días de cultivo, las células incumplieron la interfaz gel interior-exterior y comenzaron a invadir el exterior de gel. La población de células propaga predominante…

Discussion

In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been lar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen W. Sol y K. Jansen para los debates críticos, y reconocen el apoyo de la Nano Biomecánica Lab de la Universidad Nacional de Singapur. NAK reconoce el apoyo de una Beca Marie Curie IIF.

Materials

Cell culture incubator Fisher Scientific Pte Ltd Model: 371, S/No 318854-6055
Confocal microscope Nikon A1R Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 10082-147
Fluorescent CellTracker dye CMTMR Life Technologies C2927
Glass-bottom dish IWAKI Cell Biology 3931-035 35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well
Hemocytometer iN CYTO DHC-N01 (Neubauer Improved)
Microprocessor pH meter Hanna Instruments pH 211
Nutragen Collagen Advanced BioMatrix #5010-D Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2)
Objective lens Nikon CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
pH meter Sartorius S/No 29153352 Basic pH Meter PB-11
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054

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Cite This Article
Kurniawan, N. A., Chaudhuri, P. K., Lim, C. T. Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration. J. Vis. Exp. (98), e52735, doi:10.3791/52735 (2015).

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