Sistema de Gel Concentric para estudar o papel Biofísica da Matrix Microenvironment sobre a migração celular 3D

Summary

As propriedades mecânicas e a micro estrutura da matriz extracelular afectar fortemente a migração de células 3D. Um método in vitro para estudar o comportamento de migração celular no espaço-temporal ambientes biofísico variáveis, tanto na população e os níveis de células individuais, é descrito.

Abstract

A capacidade das células para migrar é crucial numa grande variedade de funções celulares ao longo da vida do desenvolvimento embrionário e na cicatrização de tumor e a metástase do cancro. Apesar dos esforços intensos de investigação, os princípios bioquímicos e biofísicos básicos de migração de células ainda não são totalmente compreendidos, especialmente nas três dimensões (3D) microambientes fisiologicamente relevantes. Aqui, nós descrevemos um ensaio in vitro concebido para permitir a análise quantitativa de 3D ​​comportamentos de migração celular. O método explora mechanosensing capacidade da célula e propensão para migrar para dentro da matriz extracelular previamente desocupado (ECM). Usamos a invasão de células do cancro da mama altamente invasivos, MDA-MB-231, em géis de colagénio, tal como um sistema modelo. A disseminação da população de células e as dinâmicas migratórias de células individuais ao longo de semanas de cultura pode ser controlada por meio de imagens ao vivo de células e analisados ​​para extrair dados espaço-temporalmente-resolvidos. Além Do Mais, O método é facilmente adaptável para diversas matrizes extracelulares, oferecendo assim uma maneira simples e poderosa para investigar o papel dos factores biofísicos no microambiente sobre a migração celular.

Introduction

A migração de células desempenha um papel chave em várias respostas fisiológicas, tais como o desenvolvimento embrionário, hemostase, e resposta imunitária, bem como em processos patológicos tais como doenças vasculares, inflamação e cancro ^1. Dissecando os factores bioquímicos e biofísicos subjacentes a migração celular é portanto fundamentalmente importante não só para compreender os princípios básicos de funções celulares, mas também para fazer avançar várias aplicações biomédicas, tais como em engenharia de tecidos, anti-metástases e desenvolvimento de drogas anti-inflamatórias. Desde observação in vivo é tecnicamente desafiador, uma série de esforços tem sido focada em in vitro recapitulação da migração celular.

Os métodos in vitro para estudar a migração de células têm sido amplamente concebido para ensaios em duas superfícies (2D) dimensionais, mais notavelmente o arranhão ou ferimento ensaio ² de cura. Tais ensaios oferecem configuração experimental simples, fácil live-imagens de células, e fornecer informações úteis sobre vários mecanismos bioquímicos subjacentes migração celular. No entanto, estes ensaios não têm em conta a arquitetura da matriz extracelular (ECM) e remodelação, que são aspectos críticos na compreensão da migração vivo. Recentemente, tem sido cada vez mais apreciado que um modelo de cultura 3D, muitas vezes em matrizes à base de colagénio ^3, fornece uma plataforma que melhor se assemelha à situação in vivo. De fato, as células apresentam dinâmicas migratórias que são distintas daquelas em superfícies 2D, especialmente devido à diferente dimensionalidade do meio ambiente ^4. Além disso, as propriedades biofísicas e mecânicas da matriz afecta sensivelmente a migração celular ^5, nomeadamente no contexto de invasão de células tumorais ^6.

Aqui, apresentamos um método para estudar o comportamento de migração celular 3D em ECM com propriedades biofísicas que podem ser facilmente variado, com condições de preparação. As células sãosemeadas em um "gel interior" e estão autorizados a escapar para dentro e invadir o "gel exterior" inicialmente acelular. O método baseia-se na capacidade da célula para reconhecer a presença de, e a propensão para migrar para dentro, regiões livres de células no exterior de gel, que está intimamente ligado à célula mechanosensing ^7. Neste estudo, utilizamos redes de colágeno que a ECMs invadidas por células de câncer de mama altamente invasivos, MD-MBA-231. As propriedades mecânicas e microestrutura de ambos os géis de interiores e exteriores pode ser sintonizado ⁸ e ⁹ caracterizado para atingir as condições f isiologicamente relevantes. Reconstrução e análise das faixas de células permitir o exame quantitativa detalhada do comportamento de migração espaço-temporais, tanto a nível da população e nível de célula individual. É importante notar que a configuração do sistema de gel concêntrico imita a topologia de tecido in vivo enfrentado pelas células migrantes, especialmente células cancerosas invasoras, oferecendo, assim, conhecimentos importantespara os mecanismos físicos de migração celular e metástase.

Protocol

Colheita 1. celular Obter MD-MBA-231 a partir do 37 ° C, 5% de CO2. Separar as células do tecido placa de cultura utilizando-se 0,5% de solução de Tripsina-EDTA. Use 1 ml de solução de tripsina-EDTA para células cultivadas num frasco T25. Células de pellets em um tubo de 15 ml por centrifugação a 200 x g durante 4 min, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de meio de cultura. Contagem de densidade celular, ρ, utilizando um hemocitómetro. …

Representative Results

O ensaio de gel concêntrico aqui apresentada foi realizada utilizando células de cancro da mama altamente invasivos, MDA-MB-231, com 2,4 mg / ml de gel de colagénio interior e uma densidade de sementeira de células de = 2 x 10 6 células / ml, como um exemplo. Como mostrado na Figura 2, tipicamente depois de alguns dias de cultura, as células violou a interface gel interior-exterior e começou a invadir o exterior de gel. A população de células predominantemente espalhar radialmente p…

Discussion

In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration¹³, which has to date been lar…

Materials

Cell culture incubator	Fisher Scientific Pte Ltd	Model: 371, S/No 318854-6055
Confocal microscope	Nikon A1R		Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	10082-147
Fluorescent CellTracker dye CMTMR	Life Technologies	C2927
Glass-bottom dish	IWAKI Cell Biology	3931-035	35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well
Hemocytometer	iN CYTO	DHC-N01 (Neubauer Improved)
Microprocessor pH meter	Hanna Instruments	pH 211
Nutragen Collagen	Advanced BioMatrix	#5010-D	Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2)
Objective lens	Nikon		CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122
pH meter	Sartorius	S/No 29153352	Basic pH Meter PB-11
Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054