Концентрические Гель Система по изучению биофизических роли матриксных микроокружения на 3D миграции клеток
Summary
Механические свойства и микроструктура внеклеточного матрикса сильно влияют 3D миграцию клеток. Метод в пробирке для изучения пространственно-временной миграционного поведения клеток в биофизически переменных среды, на численности населения и индивидуальном уровнях клеток, описывается.
Abstract
Способность клеток к миграции имеет решающее значение в самых разнообразных клеточных функций на протяжении всей жизни из эмбрионального развития и заживления ран в опухоли и метастазов рака. Несмотря на интенсивные усилия научно-исследовательских, основные биохимические и биофизические принципы миграции клеток до сих пор до конца не изучен, особенно в физиологически соответствующих трехмерных (3D) микросреды. Здесь мы опишем анализа в пробирке разработана, чтобы позволить количественное изучение 3D миграции клеток поведения. Метод основан на использовании способности mechanosensing ячейки и склонность к миграции в ранее не заселенных внеклеточного матрикса (ЕСМ). Мы используем вторжение высоко инвазивных клеток рака молочной железы, MDA-MB-231, в коллагеновых гелях в качестве модельной системы. Распространение популяции клеток и динамика миграции отдельных клеток в течение нескольких недель культуры можно контролировать с помощью визуализации живых клеток и проанализированы, чтобы извлечь spatiotemporally разрешенных данных. Кроме того, Метод легко адаптируется для различных внеклеточного матрикса, тем самым предлагая простой, но эффективный способ изучения роли биофизических факторов в микросреде по миграции клеток.
Introduction
Миграция клеток играет ключевую роль в различных физиологических реакций, таких как эмбриональное развитие, гемостаз, и иммунного ответа, а также в патологических процессах, таких как сосудистых заболеваний, воспаления, рака и 1. Пройдя биохимические и биофизические факторы, лежащие в основе миграции клеток, следовательно, принципиально важно не только понять основные принципы клеточных функций, но и для продвижения различных биомедицинских приложений, таких как в тканевой инженерии, анти-метастазирования и противовоспалительное разработки лекарственных препаратов. Так наблюдение в естественных условиях является технически сложным, много усилий было сосредоточено на повторении в пробирке миграции клеток.
В способах пробирке для изучения миграции клеток были в значительной степени предназначены для анализов на двумерных (2D) поверхности, что особенно царапины или заживления ран анализа 2. Такие анализы предложить простой экспериментальной установки, легко Live-ячейки изображения, а также обеспечить полезную информацию в различные биохимические механизмы, лежащие в основе миграции клеток. Тем не менее, эти анализы не учитывают внеклеточного матрикса (ЕСМ) архитектуры и реконструкции, которые представляют собой критические аспекты в понимании в естественных условиях миграции. Недавно было более понятно, что 3D модель культуры, часто в коллагеновых матриц на основе 3, обеспечивает платформу, которая лучше, напоминает в естественных условиях ситуацию. Действительно, клетки обладают миграционные динамику, которые отличаются от тех, на 2D поверхностях, особенно в связи с различной размерностью окружающей среды 4. Кроме того, биофизические и механические свойства матрицы чувствительно влияет клеточную миграцию 5, в том числе в контексте опухолевых клеток вторжения 6.
Здесь мы представляем метод для изучения 3D миграционного поведения клеток в ECM с биофизических свойств, которые могут легко изменяться с условиями подготовки. Клеткивысевают в "внутренней гель" и позволили бежать в вторгаются первоначально ацеллюлярную "внешнюю гель". Метод основан на способности клеток распознавать присутствие, и склонность к миграции в, бесклеточными регионов во внешней гель, который тесно связан с клеточной mechanosensing 7. В этом исследовании мы используем коллагена сетей, как ЕСМ вторглись высоко инвазивных клеток рака молочной железы, MD-MBA-231. Механические свойства и микроструктура обоих внутренних и наружных гелей могут быть настроены 8 и 9 характеризуются достичь физиологически соответствующие условия. Реконструкция и анализ клеточных треков разрешить детальную количественную экспертизу пространственно-временной миграционного поведения на обоих популяционном уровне и на индивидуальном уровне клеток. Важно отметить, что установка системы концентрических гель имитирует естественных условиях ткани топологию в которой сталкиваются мигрирующих клеток, особенно вторжение раковых клеток, таким образом предлагая важную информацию вна физические механизмы миграции клеток и метастазирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been lar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность В. ВС и К. Янсен для критических дискуссий и благодарят за поддержку со стороны Nano Биомеханика лаборатории в Национальном университете Сингапура. НАК подтверждает поддержку со стороны Марии Кюри IIF общения.
Materials
| Cell culture incubator | Fisher Scientific Pte Ltd | Model: 371, S/No 318854-6055 | |
| Confocal microscope | Nikon A1R | Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
| Fluorescent CellTracker dye CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| Glass-bottom dish | IWAKI Cell Biology | 3931-035 | 35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well |
| Hemocytometer | iN CYTO | DHC-N01 (Neubauer Improved) | |
| Microprocessor pH meter | Hanna Instruments | pH 211 | |
| Nutragen Collagen | Advanced BioMatrix | #5010-D | Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2) |
| Objective lens | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45. | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| pH meter | Sartorius | S/No 29153352 | Basic pH Meter PB-11 |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 |
References
- Horwitz, R., Webb, D. Cell migration. Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3D cell migration. Curr. Prot. Cell Biol. 10, 10-17 (2010).
- Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. New dimensions in cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 743-747 (2012).
- Grinnell, F., Petroll, W. M. Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2010).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Sun, W., Kurniawan, N. A., Kumar, A. P., Rajagopalan, R., Lim, C. T. Effects of migrating cell-induced matrix reorganization on 3D cancer cell migration. Cell. Mol. Bioeng. 7 (2), 205-217 (2014).
- Achilli, M., Mantovani, D. Tailoring mechanical properties of collagen-based scaffolds for vascular tissue engineering: the effects of pH, temperature and ionic strength on gelation. Polymers. 2 (4), 664-680 (2010).
- Kurniawan, N. A., Wong, L. H., Rajagopalan, R. Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks. Biomacromolecules. 13 (3), 691-698 (2012).
- Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy. J. R. Soc. Interface. 11 (99), 20140638 (2014).
- Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. J. The effect of fibrillar matrix architecture on tumor cell invasion of physically challenging environments. Biomaterials. 35 (25), 6954-6963 (2014).
- Wolf, K., et al. Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force. J. Cell Biol. 201 (7), 1069-1084 (2013).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. Collective cell migration: a mechanistic perspective. Physiology. 28 (6), 370-379 (2013).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).
- Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).
- Mouw, J. K., et al. Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression. Nat. Med. 20 (4), 360-367 (2014).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (8), 931-941 (2009).
- Wong, L. H., Kurniawan, N. A., Too, H. -. P., Rajagopalan, R. Spatially resolved microrheology of heterogeneous biopolymer hydrogels using covalently bound microspheres. Biomech. Model. Mechanobiol. 13 (4), 839-849 (2014).
- Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration. Cell. 125 (7), 1361-1374 (2006).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95 (11), 5374-5384 (2008).
- Wolf, K., et al. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion. Nat. Cell Biol. 9 (8), 893-904 (2007).
- Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophys. J. 105 (10), 2240-2251 (2013).
