Summary

מדידת התנגדות סטרס חמצוני של<em> Elegans Caenorhabditis</em> בצלחות microtiter 96-היטב

Published: May 09, 2015
doi:

Summary

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Abstract

סטרס חמצונים, אשר הוא התוצאה של חוסר איזון בין ייצור וסילוק רעלים של מיני חמצן מגיבים, הוא תורם עיקרי להפרעות אנושיות כרוניות, כוללים לב וכלי דם ומחלות ניווניות, סוכרת, הזדקנות וסרטן. לכן, חשוב ללמוד סטרס חמצונים לא רק במערכות תא אלא גם באמצעות כל האורגניזמים. ג elegans הוא אורגניזם מודל אטרקטיבי ללמוד את הגנטיקה של מסלולי חמצוני אות מתח התמרה, אשר השמורים ביותר מבחינה אבולוציונית.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול למדידת התנגדות סטרס חמצונים בג elegans בנוזל. ריאגנטים לזמן קצר, ROS-התרמה כגון paraquat (PQ) ו- H 2 O 2 מומסים במאגר M9, ופתרונות aliquoted בבארות של צלחת microtiter 96 גם. L4 המסונכרן / מבוגרים צעירים ג בעלי החיים elegans מועברים לבארות (5-8 בעלי חיים / טוב) והישרדות נמדדתבכל שעה עד שרוב התולעים מתים. בעת ביצוע assay התנגדות סטרס חמצונים באמצעות ריכוז נמוך של לחץ בצלחות, הזדקנות עשויה להשפיע על התנהגותם של בעלי חיים על סטרס חמצונים, אשר עלול להוביל לפרשנות שגויה של הנתונים. עם זאת, בassay תאר במסמך זה, בעיה זה לא סביר שיתרחש שכן רק בעלי חיים מבוגרים צעירים L4 / נמצאים בשימוש. יתר על כן, פרוטוקול זה הוא זול ותוצאות מתקבלות ביום אחד, אשר הופך את הטכניקה הזאת אטרקטיבית למסכים גנטיים. בסך הכל, זה יעזור להבין מסלולי העברת אותות עקה חמצונית, שיכול להיות מתורגם לאפיון טוב יותר של הפרעות אנושיות הקשורים סטרס חמצונים.

Introduction

באאוקריוטים, זרחון חמצוני מתרחשים בשרשרת הובלת אלקטרונים של המיטוכונדריה הוא הנהג העיקרי של ייצור אנרגיה בצורה של ה- ATP. מיני חמצן מגיבים (ROS) הם תוצר לוואי טבעי של תהליך זה. למרות תפקידם החשוב כמולקולות איתות, ROS מוגזם יכול לגרום לנזק לדנ"א, carbonylation חלבון, וחמצון שומנים בדם. חוסר איזון בין ייצור וסילוק הרעלים ROS גורם ללחץ חמצוני, מה שמוביל לדלדול אנרגיה, נזק לתאים, וגורם לתא מוות 1,2. סטרס חמצונים תורמים להזדקנות וההתפתחות של מחלות מסכנות חיים רבות, כולל סרטן, סוכרת, לב וכלי דם ומחלות ניווניות 3-9.

תאים התפתחו אסטרטגיות הגנה האנזימטית ואינם אנזימטית כדי לשמור על רמות ROS נכונים ולהגן על בוחריהם מפני נזק חמצוני 1,2. סופראוקסיד דיסמוטאז אנזימים (SOD) לפעול ראשון לconveסופראוקסיד RT לH 2 O 2, אשר מאוחר יותר הופך למים על ידי catalase או אנזימי peroxidase. אסטרטגיות הגנה האנזימטית ללא כוללות בעיקר מולקולות המגיבות מהר יותר עם ROS בהשוואה למקרו-מולקולות תאיות, הגנה על מרכיבים תאיים חיוניים. למרות התפקיד המגן של ROS הטיהור אנזימים, כמה מולקולות ROS לברוח מנגנוני הגנה נוגדי חמצון ולגרום לנזק חמצוני. איתור, תיקון, והשפלה של המרכיבים התאיים הפגומים אסטרטגיות הגנה חיוניות בסטרס החמצונים 1,2.

מסלולי איתות מעורבים בהתנגדות ללחץ ומתח במיוחד חמצוני הם מאוד שמורים באבולוציה 10,11. בניגוד לניסויי תא תרבות שבה תנאי האורגניזם הם בתמונות באופן חלקי בלבד, המחקר של סטרס חמצונים באורגניזמים מודל 12,13 יש משמעות רבה. ג elegans הוא נמטודות חיים חופשיים שיכול להיות בקלות ובזול רחוב ללאשניחן בדשא חיידקים על תקשורת אגר. הוא קטן בגודלם (כ 1 מ"מ אורך) ובדרך כלל גדל כאנדרוגינוס דישון עצמי, המאפשר מניפולציות גנטיות. יש לה מחזור חיים מהיר ויכולת רבייה גבוהה, הפקה כ -300 צאצאים לדור, מה שהופך אותו לכלי רב עוצמה כדי לבצע מסכי גנטיים בקנה מידה גדולה 14. ג הגנום elegans הוא רצף באופן מלא ו40-50% מהגנים הם חזו להיות homologues של גנים הקשורים למחלות אנושיים 15-18. מציאה של גנים של עניין באמצעות RNAi היא מהירה וקל בג elegans. ג'ין את הרגולציה יכול להיות מושגת על ידי האכלת בעלי החיים א חיידקי coli כי נמל פלסמיד המבטא את RNA פעמיים תקועים שמכוון את ה- mRNA של עניין 19. לכן, קביעת תפקוד גן באמצעות מסכי RNAi בקנה מידה גדולה יש השפעה רבה על הבנת מחלות בבני אדם, כולל סרטן 20,21.

מחקרים של oהתנגדות מתח xidative בג elegans הוביל לזיהוי של מנגנוני שימור של התנגדות ללחץ חמצוני 13,22. כמה מסלולים המזוהים הם מסלולים נפוצים שלווסת אריכות ימים והתנגדות ללחצים אחרים, כמו גם כמו היפוקסיה, חום, ולחץ האוסמוטי. מסלולים אלה כוללים את איתות האינסולין, איתות TOR, וautophagy. מסלולים מרכזיים אחרים כרוכים סילוק רעלים של ROS כגון אנזימי סופראוקסיד דיסמוטאז ואנזימי catalase, או בתיקון נזק כגון חלבוני הלם חום ומלווה 11,13,22.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לקבוע את ההתנגדות ללחץ חמצוני של ג elegans בנוזל. השתמשנו flcn-1 (ok975) וחיות בר-סוג להפגין הפרוטוקול מאז שהראינו בעבר התנגדות מוגברת ללחץ חמצוני על אובדן flcn-1 (ok975) בג elegans 23. יש לנו גם הראה כי התנגדות מוגברת זה תלויהעל AMPK וautophagy, ציר איתות שמשפר bioenergetics הסלולרי ומקדם התנגדות מתח 23. PQ הוא לחץ חמצוני שמפריע לשרשרת הובלת אלקטרונים כדי לייצר מיני חמצן מגיב 24. אותו assay יכול להיות מותאם ומקורות ROS אחרים או תרכובות יצירת ROS יכולים לשמש כגון H 2 O 2 וrotenone. מבחני דומים פותחו על צלחות שבו ריכוזים נמוכים של PQ משמשים 25,26. היתרון של assay זה הוא שזה מאוד מהר, ויכול להיות שהושגו התוצאות ביום אחד. בנוסף, ההיקף הכולל של נוזל המשמש לביצוע assay התנגדות סטרס החמצונים ב 96 צלחות גם הוא נמוך בהשוואה לנפח המשמש להכנת לוחות PQ המכיל. לפיכך, הסכום של PQ משמש הוא בassay הנוזלי הוא נמוך, שהופך את assay זול ומגביל את הייצור של פסולת רעילה. עם זאת, מגבלות של assay זה בהשוואה למבחני צלחת כוללות להck של מזון בassay הנוזלי והריכוז הנמוך של חמצן בנוזל בהשוואה לאוויר. אלה הם גורמים חשובים שבמקרים מסוימים, עלול להשפיע על התוצאות. לכן, המאשר שחזור תוך שימוש בשיטות אחרות של התנגדות ללחץ חמצוני מומלץ לתמוך תוצאות שהתקבלו בassay זה.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים הכנת מדיה לג צמיחת elegans (במקרה זה, חיות בר-סוג ובעלי חיים flcn-1 (ok975) מוטציה). כן השתנה Bacto-peptone בלבד (MYOB) התערובת היבשה של Youngren המכילה 5.5 גרם של ט?…

Representative Results

השוואת wild-type ג elegans לflcn-1 (ok975) בעלי חיים מוטציה כאן אנו משמשים 100 מ"מ PQ כדי לקבוע את ההתנגדות של ג wild-type elegans בעלי חיים בהשוואה לflcn-1 (ok975) אשר הוכח להתנגד סטרס חמצונים, חום, ואנוקסיה 23. לאחר 4 שעות של טיפול, 48.3% …

Discussion

סי אלגנס הוא אורגניזם מודל אטרקטיבי ללמוד התנגדות מתח גנטי חמצוני in vivo שכן הוא יכול להיות בקלות בתרבית, ומהירות מוביל למספר רב של צאצאים זהים גנטי. מספר שיטות למדידת התנגדות סטרס חמצונים תוארו בעבר והם מבוססים על התוספים של צלחות תרבות עם מקורות ROS שונים כגו…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מכירים את מרכז Caenorhabditis הגנטיקה לג זני elegans. תמיכת מימון ניתן על ידי טרי פוקס מכון המחקר. אנחנו גם מכירים תמיכה שניתנה לEP מRolande ומרסל גוסלין בוגר Studentship ומענק אימון CIHR / FRSQ בFRN53888 חקר הסרטן של חקר סרטן תכנית הכשרת מקגיל המשולבת.

Materials

Agar bacteriological grade Multicell 800-010-LG
Bacteriological peptone Oxoid LP0037
Sodium chloride biotechnology grade Bioshop 7647-14-5
Cholesterol Sigma C8503-25G
UltraPure tris hydrochloride Invitrogen 15506-017
Tris aminomethane Bio Basic Canada Inc 77-86-1
IPTG Santa Cruz Biotechnology sc-202185A
Ampicillin Bioshop 69-52-3
Yeast extract Bio Basic Inc. 8013-01-2
Methyl viologen dichloride hydrate Aldrich chemistry 856177-1G
Petri dish 60x15mm Fisher FB0875713A
Pipet 10ml Fisher 1367520
Potassium phosphate monobasic G-Biosciences RC-084
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M-5921
Sodium phosphate dibasic Bioshop 7558-79-4
Discovery v8 stereo zeiss microscope
96 well clear microtiter plate
flcn-1 RNAi source Ahringer Library

References

  1. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Curr Biol. 24, R453-R462 (2014).
  2. Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, 936486 (2012).
  3. Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
  4. Di Carlo, M., Giacomazza, D., Picone, P., Nuzzo, D., San Biagio, P. L. Are oxidative stress and mitochondrial dysfunction the key players in the neurodegenerative diseases. Free Radic Res. 46, 1327-1338 (2012).
  5. Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, 428010 (2012).
  6. Trushina, E., McMurray, C. T. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Neuroscience. 145, 1233-1248 (2007).
  7. Touyz, R. M., Briones, A. M. Reactive oxygen species and vascular biology: implications in human hypertension. Hypertens Res. 34, 5-14 (2011).
  8. Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nat Rev Drug Discov. 12, 931-947 (2013).
  9. Sosa, V., et al. Oxidative stress and cancer: an overview. Ageing research reviews. 12, 376-390 (2013).
  10. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxid Redox Signal. 13, 1911-1953 (2010).
  11. Baumeister, R., Schaffitzel, E., Hertweck, M. Endocrine signaling in Caenorhabditis elegans controls stress response and longevity. J Endocrinol. 190, 191-202 (2006).
  12. Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnol J. 5, 1261-1276 (2010).
  13. Rodriguez, M., Snoek, L. B., De Bono, M., Kammenga, J. E. Worms under stress: C. elegans stress response and its relevance to complex human disease and aging. Trends Genet. 29, 367-374 (2013).
  14. Hope, I. A. . Practical approach series. , 282 (1999).
  15. C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  16. Ahringer, J. Turn to the worm!. Current opinion in genetics & development. 7, 410-415 (1997).
  17. Wheelan, S. J., Boguski, M. S., Duret, L., Makalowski, W. Human and nematode orthologs–lessons from the analysis of 1800 human genes and the proteome of Caenorhabditis elegans. Gene. 238, 163-170 (1999).
  18. Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Hum Mol Genet. 9, 869-877 (2000).
  19. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  20. Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 127-138 (2006).
  21. Poulin, G., Nandakumar, R., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screens in Caenorhabditis elegans: impact on cancer research. Oncogene. 23, 8340-8345 (2004).
  22. Moreno-Arriola, E., et al. Caenorhabditis elegans: A Useful Model for Studying Metabolic Disorders in Which Oxidative Stress Is a Contributing Factor. Oxid Med Cell Longev. , 705253 (2014).
  23. Possik, E., et al. Folliculin regulates ampk-dependent autophagy and metabolic stress survival. PLoS Genet. 10, e1004273 (2014).
  24. Fukushima, T., Tanaka, K., Lim, H., Moriyama, M. Mechanism of cytotoxicity of paraquat. Environ Health Prev Med. 7, 89-94 (2002).
  25. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Superoxide dismutase is dispensable for normal animal lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 5785-5790 (2012).
  26. Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metab. 6, 280-293 (2007).
  27. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  28. Timmons, L. Delivery methods for RNA interference in. C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 119-125 (2006).
  29. Wang, B. Y., et al. Caenorhabditis elegans Eyes Absent Ortholog EYA-1 Is Required for Stress Resistance. Biochemistry (Mosc). 79, 653-662 (2014).
  30. Paz-Gomez, D., Villanueva-Chimal, E., Navarro, R. E. The DEAD Box RNA helicase VBH-1 is a new player in the stress response in C. elegans. PLoS One. 9, 97924 (2014).
  31. Ward, J. D., et al. Defects in the C. elegans acyl-CoA synthase, acs-3, and nuclear hormone receptor, nhr-25, cause sensitivity to distinct, but overlapping stresses. PLoS One. 9, 92552 (2014).
  32. Staab, T. A., Evgrafov, O., Knowles, J. A., Sieburth, D. Regulation of synaptic nlg-1/neuroligin abundance by the skn-1/Nrf stress response pathway protects against oxidative stress. PLoS Genet. 10, e1004100 (2014).
  33. Greer, E. L., et al. An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in. C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).
  34. Allen, E., Walters, I. B., Hanahan, D. Brivanib, a dual FGF/VEGF inhibitor, is active both first and second line against mouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance to VEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, 5299-5310 (2011).
  35. Apfeld, J., O’Connor, G., McDonagh, T., DiStefano, P. S., Curtis, R. The AMP-activated protein kinase AAK-2 links energy levels and insulin-like signals to lifespan in C. elegans. Genes Dev. 18, 3004-3009 (2004).
  36. Lee, H., et al. The Caenorhabditis elegans AMP-activated protein kinase AAK-2 is phosphorylated by LKB1 and is required for resistance to oxidative stress and for normal motility and foraging behavior. J Biol Chem. 283, 14988-14993 (2008).
  37. Honda, Y., Honda, S. The daf-2 gene network for longevity regulates oxidative stress resistance and Mn-superoxide dismutase gene expression in Caenorhabditis elegans. FASEB J. 13, 1385-1393 (1999).
  38. Restif, C., Metaxas, D. Tracking the swimming motions of C. elegans worms with applications in aging studies. Med Image Comput Comput Assist Interv. 11, 35-42 (2008).
  39. Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry. BMC Neurosci. 10, 84 (2009).

Play Video

Cite This Article
Possik, E., Pause, A. Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates. J. Vis. Exp. (99), e52746, doi:10.3791/52746 (2015).

View Video