Medición de la resistencia de estrés oxidativo<em> Caenorhabditis elegans</em> 96 pocillos en placas de microtitulación
Summary
C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.
Abstract
El estrés oxidativo, que es el resultado de un desequilibrio entre la producción y la desintoxicación de especies reactivas del oxígeno, es un importante contribuyente a trastornos humanos crónicas, incluyendo enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas, diabetes, envejecimiento, y cáncer. Por lo tanto, es importante para estudiar el estrés oxidativo no sólo en sistemas celulares, sino también el uso de organismos enteros. C. elegans es un organismo modelo atractivo para estudiar la genética de las vías de transducción de señales de estrés oxidativo, que se conservan altamente evolutivamente.
Aquí, ofrecemos un protocolo para medir la resistencia al estrés oxidativo en C. elegans en líquido. Reactivos Brevemente, ROS inductores como el paraquat (PQ) y H 2 O 2 se disuelven en tampón M9, y las soluciones se dividen en partes alícuotas en los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos. L4 Sincronizada / joven C. elegans animales se transfieren a los pocillos (5-8 animales / pocillo) y se mide la supervivenciacada hora hasta que la mayoría de los gusanos están muertos. Cuando se realiza un ensayo de resistencia al estrés oxidativo usando una baja concentración de factores de estrés en las placas, el envejecimiento podría influir en el comportamiento de los animales sobre el estrés oxidativo, lo que podría dar lugar a una interpretación errónea de los datos. Sin embargo, en el ensayo descrito en el presente documento, este problema es poco probable que ocurra ya que se están utilizando sólo L4 / animales adultos jóvenes. Por otra parte, este protocolo es de bajo costo y los resultados se obtienen en un día, lo que hace que esta técnica atractiva para pantallas genéticos. En general, esto le ayudará a entender las vías de transducción de señales de estrés oxidativo, lo que podría traducirse en una mejor caracterización de los trastornos humanos con el estrés oxidativo asociado.
Introduction
En eucariotas, la fosforilación oxidativa que tiene lugar en la cadena de transporte de electrones de la mitocondria es el principal motor de la producción de energía en forma de ATP. Especies reactivas del oxígeno (ROS) son un subproducto natural de este proceso. A pesar de su importante papel como moléculas de señalización, excesiva ROS puede conducir a daños en el ADN, carbonilación de proteínas, y la oxidación de los lípidos. Un desequilibrio entre la producción y la desintoxicación ROS causa el estrés oxidativo, que conduce a agotamiento de la energía, el daño celular, y desencadena la muerte celular 1,2. El estrés oxidativo contribuye al envejecimiento y al desarrollo de muchas enfermedades que amenazan la vida, incluyendo cáncer, diabetes, enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas 3-9.
Las células han desarrollado estrategias de defensa enzimáticos y no enzimáticos para mantener los niveles de ROS adecuadas y para proteger a sus electores contra el daño oxidativo 1,2. La superóxido dismutasa (SOD) enzimas actúan primero en convert superóxido a H 2 O 2, que más tarde se convierte en el agua por la catalasa o enzimas peroxidasa. Estrategias para no enzimáticos de defensa incluyen principalmente moléculas que reaccionan más rápidamente con ROS en comparación con macromoléculas celulares, protegiendo los componentes celulares esenciales. A pesar de la función protectora de ROS desintoxicación enzimas, algunas moléculas ROS escapan los mecanismos de defensa antioxidante y conducen al daño oxidativo. Detección, reparación, y la degradación de los componentes celulares dañados son estrategias esenciales de defensa durante el estrés oxidativo 1,2.
Vías de señalización implicadas en la resistencia a la tensión y el estrés oxidativo en concreto son altamente conservadas evolutivamente 10,11. A diferencia de los experimentos de cultivo de células, donde las condiciones organismal son sólo parcialmente reproducidos, el estudio del estrés oxidativo en organismos modelo 12,13 tiene un gran significado. C. elegans es un nematodo de vida libre que puede ser fácil y económicamente culrado en un césped de bacterias en medios de agar. Es de tamaño pequeño (alrededor de 1 mm de longitud) y normalmente crece como un hermafrodita auto-fertilización, lo que facilita las manipulaciones genéticas. Tiene un ciclo de vida rápido y una alta capacidad reproductiva, produciendo aproximadamente 300 crías por generación, por lo que es una poderosa herramienta para realizar cribados genéticos a gran escala 14. El C. elegans genoma está completamente secuenciado y el 40-50% de los genes se predice para ser homólogos de genes asociados a enfermedades humanas 15-18. La caída de los genes de interés utilizando RNAi es rápida y fácil en C. elegans. génica por la regulación se puede lograr mediante la alimentación de animales de la E. bacterias coli que albergan un plásmido que expresa el ARN de doble cadena que se dirige el mRNA de interés 19. Por lo tanto, la determinación de la función de genes utilizando pantallas de RNAi gran escala tiene un gran impacto en la comprensión de las enfermedades humanas como el cáncer 20,21.
Estudios de oresistencia al estrés xidative en C. elegans han conducido a la identificación de conservados mecanismos de resistencia al estrés oxidativo 13,22. Algunas vías identificadas son vías comunes que modulan la longevidad y la resistencia a otros factores de estrés, así como la hipoxia, el calor, y el estrés osmótico. Estas vías incluyen la señalización de la insulina, la señalización de TOR y la autofagia. Otras vías importantes implican la desintoxicación de ROS como las enzimas superóxido dismutasa y catalasa enzimas, o en la reparación de daños tales como choque térmico y chaperón proteínas 11,13,22.
Este protocolo describe cómo determinar la resistencia al estrés oxidativo de C. elegans en líquido. Utilizamos FLCN-1 (ok975) y de tipo salvaje animales para demostrar el protocolo ya que hemos demostrado anteriormente una mayor resistencia al estrés oxidativo sobre la pérdida de FLCN-1 (ok975) en C. elegans 23. También hemos demostrado que este aumento de la resistencia dependeen AMPK y la autofagia, un eje de señalización que mejora la bioenergética celular y promueve la resistencia al estrés 23. PQ es un factor de estrés oxidativo que interfiere con la cadena de transporte de electrones para producir especies de oxígeno reactivo 24. El mismo ensayo se podría adaptar y otras fuentes de ROS o compuestos que generan ROS podría ser utilizado como H 2 O 2 y rotenona. Ensayos similares se han desarrollado en las placas donde se utilizan bajas concentraciones de PQ 25,26. La ventaja de este ensayo es que es muy rápido, y los resultados se podría obtener en un día. Además, el volumen total de líquido usado para llevar a cabo el ensayo de la resistencia al estrés oxidativo en placas de 96 pocillos es baja en comparación con el volumen utilizado para preparar placas PQ-que contienen. Por lo tanto, la cantidad de PQ es utilizado en el ensayo de líquido es bajo, lo que hace que el ensayo de bajo costo y limita la producción de desechos tóxicos. Sin embargo, las limitaciones de este ensayo en comparación con los ensayos de placa incluyen el lack de comida en el ensayo de líquido y la menor concentración de oxígeno en el líquido en comparación con el aire. Estos son factores importantes que en algunos casos, podrían influir en los resultados. Por lo tanto, lo que confirma la reproducibilidad utilizando otros métodos de la resistencia al estrés oxidativo se recomienda para apoyar los resultados obtenidos en este ensayo.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans es un organismo modelo atractivo para estudiar la resistencia al estrés oxidativo genéticamente in vivo, ya que puede ser fácilmente cultivada, y rápidamente conduce a un gran número de descendencia genéticamente idéntica. Múltiples métodos para medir la resistencia al estrés oxidativo se han descrito anteriormente y se basan en la administración de suplementos de placas de cultivo con varias fuentes de ROS tales como PQ, rotenona, H 2 O 2, y juglone 25,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos el Centro de Genética Caenorhabditis para C. cepas elegans. El apoyo financiero fue proporcionado por el Instituto de Investigación de Fox Terry. También reconocemos el apoyo otorgado a EP de la Rolande y Marcel Gosselin Graduate Beca y la beca de formación CIHR / FRSQ en FRN53888 investigación del cáncer del Programa de Formación de Investigación del Cáncer de McGill Integrado.
Materials
| Agar bacteriological grade | Multicell | 800-010-LG | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Sodium chloride biotechnology grade | Bioshop | 7647-14-5 | |
| Cholesterol | Sigma | C8503-25G | |
| UltraPure tris hydrochloride | Invitrogen | 15506-017 | |
| Tris aminomethane | Bio Basic Canada Inc | 77-86-1 | |
| IPTG | Santa Cruz Biotechnology | sc-202185A | |
| Ampicillin | Bioshop | 69-52-3 | |
| Yeast extract | Bio Basic Inc. | 8013-01-2 | |
| Methyl viologen dichloride hydrate | Aldrich chemistry | 856177-1G | |
| Petri dish 60x15mm | Fisher | FB0875713A | |
| Pipet 10ml | Fisher | 1367520 | |
| Potassium phosphate monobasic | G-Biosciences | RC-084 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M-5921 | |
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | |
| Discovery v8 stereo zeiss microscope | |||
| 96 well clear microtiter plate | |||
| flcn-1 RNAi source | Ahringer Library | ||
References
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