Abstract
Nylige fremskritt i bruk av benmarg stamceller (BMMSC) for behandling av sene og ligamentskader i hesten foreslår forbedret utfallsmål i både eksperimentelle og kliniske studier. Selv om BMMSC blir implantert i senen lesjon i store antall (vanligvis 10 - 20 millioner celler), bare et relativt lite antall overleve (<10%), selv om disse kan vare i opptil 5 måneder etter implantasjon. Dette synes å være en vanlig observasjon i andre arter hvor BMMSC har blitt implantert i andre vev, og det er viktig å forstå når dette tapet inntreffer, hvor mange som overlever den første implantasjon prosessen og hvorvidt cellene er fjernet inn i andre organer. Sporing skjebnen til cellene kan oppnås ved å radiomerke de BMMSC før implantering som tillater ikke-invasiv in vivo avbildning av celleplassering og kvantifisering av celletall.
Denne protokollen beskriver en celle labeling prosedyre som bruker Technetium-99m (Tc-99m), og sporing av disse celler etter implantasjon i flexor skadede sener i hester. Tc-99m er en kortvarig (t 1/2 av 6,01 time) isotop som sender ut gammastråler, og kan internaliseres av celler i nærvær av det lipofile forbindelsen hexamethylpropyleneamine oksim (HMPAO). Disse egenskapene gjør den ideell for bruk i nukleærmedisin klinikker for diagnostisering av mange forskjellige sykdommer. Skjebnen til de merkede cellene kan følges på kort sikt (opp til 36 timer) ved gamma-scintigrafi for å kvantifisere både antallet celler som holdes tilbake i lesjonen, og fordelingen av cellene i lungene, skjoldbruskkjertel og andre organer. Denne teknikken er tilpasset fra merkingen av blodleukocytter og kan brukes til å bilde BMMSC implantert i andre organer.
Introduction
Regenerative strategier for reparasjon av syke eller skadde vev er basert på multipotente stamceller avledet fra en rekke forskjellige vev, og implantert inn i det berørte området. Nylige fremskritt i bruk av autolog BMMSC for behandling av sene og ligamentskader i hesten har vist bedret utfallsmål i både eksperimentell 1-5 og kliniske studier 6. Hesten er en spesielt attraktiv modell for å vurdere effekten av stamcellerelaterte behandlinger fordi den lider av alder og overanstrenge relaterte skader i senene i distale forbena, det er en atletisk dyr, og det er en stor, tilrettelegging benmarg utvinning og nøyaktig implantasjon. Sene skader leges naturlig med fibrose men helbredet senen er funksjonelt dårligere 7 og har en høy risiko for ny skade åtte. Den overfladiske digitale flexor sene (SDFT) er mest påvirket som det har utviklet seg til å fungere som en elastisk energibutikk og opplevelser høy lastestreker for å oppnå energieffektive og høy hastighet bevegelse. Gjenopprette funksjon etter skade er derfor avgjørende. Disse skadene er lik de som påvirker akillessenen i mennesker som utfører en lignende funksjon ni. Det finnes ingen gode behandlingsalternativer for å behandle eller oppnå god reparasjon for slike skader, derfor Cell-baserte regenerative strategier tilby en attraktiv mulighet til å forbedre resultatene og redusere re-skade.
I de fleste studiene fem - 20 millioner kroner autologt BMMSC blir injisert direkte inn i lesjonen som vanligvis forekommer i kjernen av den sene legeme som derfor fungerer som en beholder for cellene. Skjebnen til cellene når injisert ikke er klare og forskjellige cellemerkingsmetoder for å spore cellene er nylig blitt beskrevet. Celler merket med en fluorescens-tag ble vist å overleve kun i forholdsvis små tall (<10%) 10,11. Fluorescens etiketter nødvendigvev ekstraksjon og snitte for histologiske analyser som er tidkrevende og ikke lett lette temporal analyse i et stort dyremodell eller i kliniske tilfeller. I nyere arbeid har vi brukt radioisotop 99m Tc å merke celler og følge deres skjebne ved gamma scintigrafi en. Denne metoden gir raske sammenligninger gjøres mellom ulike ruter av celle levering, inkludert intralesional, intravenøse via jugularvenen en eller regional perfusjon via intra-arterielle 12 eller intravenøse 1,12 injeksjoner. Det utholdenhet og fordelingen av cellene kan deretter bli avbildet ved gamma-scintigrafi av forskjellige organer. Dette har vist at bare 24% av cellene injisert intralesjonalt forble i lesjonen med 24 hr 1, og dette er støttet av en annen studie ved hjelp av eksperimentelt laget lesjoner, og ved hjelp av den samme radiomarkøren 5. Videre cellene viser begrenset evne til å hjem i sene lesjoner når delivered av regional perfusjon eller intravenøst, men er dispergert i lungene hos de sistnevnte rutene 4.
BMMSC merket med jernnanopartikler er en alternativ metode for å spore celler implantert i forbena sener 13. Selv om jern nanopartikkel merkede celler tillate celle sporing in vivo ved MRI, blir tidsmessige undersøkelser i et stort dyr er begrenset av antall ganger anestesi kan administreres ved hvert tidspunkt for utførelse av MR. Videre jern nanopartikler er hypointense på MR som begrenser informasjonen på migrering av merkede celler i senen kroppen. Andre radioisotoper som kan benyttes, innbefatter indium-111, men dette lider av den ulempe at en lengre halveringstid enn Tc-99m (2,8 dager vs 6,0 time), og høyere gammastråleemisjon energi. I tillegg har celleviabilitet blitt rapportert å bli redusert når det merkes med Indium-111 14. Tc-99m, på den annen side, blir rutinemessig brukt i både equine og human nukleærmedisin for å merke perifere mononukleære blodceller og følge deres fordeling in vivo ved scintigrafi. Det kan være forholdsvis lett tatt opp av cellene ved hjelp av HMPAO som en linker molekyl for å binde technetium, som Tc-99m-HMPAO, til celler. Tc-99m-HMPAO merket BMMSC viser god levedyktighet og kan spre seg in vitro 4. Denne protokollen beskriver merking og sporing av hest autolog BMMSC implantert i naturlig forekommende lesjoner i forbena SDFT.
Det er viktig å merke seg at protokollen er kun ment å bli brukt som et forskningsverktøy. Dens bruk som et klinisk terapeutisk modalitet er ikke anbefalt som effekten av radiomarkøren på cellulær fenotype er ikke blitt fullstendig klarlagt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sakene som er beskrevet her ble utført følgende Etisk tillatelse gitt av dyreetikk og velferdskomiteen i Colegio de Veterinarios de Malaga, Spania, og Royal Veterinary College, North Mymms, UK de prosedyrer som brukes på hester er basert på godkjente protokoller som er brukes i klinikk på hester som fikk stamcellebaserte behandlingsformer som inkluderer sedasjon, benmarg aspirasjon, intra-sene injeksjon, regional perfusjon, intravenøs injeksjon, post-prosessuelle behandling og smertebehandling og oppfølging etter implantasjon.
1. Nøkkel Ordninger som skal gjøres på forhånd
- Oppsøk institusjonelle etikk og dyrevelferd godkjenning og følge lokale lover og regler før du starter arbeidet.
- Oppsøk institusjonelle godkjenning til å arbeide med ioniserende stråling som diktert av lokale og juridiske regler, herunder riktig nivå av beskyttelse av personell og miljø og disponering av contaminated avfall.
- Bruk følgende inklusjonskriterier: hester stede med en ikke-traumatisk overanstrenge skaden (sene eller desmopathy) til den overfladiske flexor digitale sene av forbena og lesjoner resulterer i en defekt i den sene og defekten er omgitt av intakt sene og / eller paratenon .
Merk: undersøkelse og diagnose for slike skader og klinisk forberedelse av hestene for celle implantasjon er blitt beskrevet andre steder 6,15.
Merk: isolasjon og ekspansjon i kulturen i BMMSC avledet fra benmargen av hester har blitt beskrevet tidligere 6,16. Den nåværende protokoll for injisering BMMSC for SDFT skader i hesten bruker 10 millioner celler per ml 4 av autolog benmargs supernatant (BMS) 16. - Bruke celler som har gjennomgått mer enn 4 passasjer for in vivo implantasjon for å unngå potensiell cellulær fenotype eller genetiske endringer forbundet med høy passasje nummer calen.
- Levere det nødvendige antall celler i BMS (innen 24 timer i en kjøleboks ved 4 - 8 o C) til veterinær klinikk hvor cellen implantering skal utføres.
Merk: klinisk bruk av stamceller i beinmargen supernatant er en patentert prosedyre eies av ReCellerate Inc (USA) og bruken kan kreve autorisasjon.
Merk: Tc-99m er en gamma-emitter (140 keV) med en relativt kort halveringstid (6,0058 hr derfor nesten 94% av det faller til sin stabile form av 99 Tc i 24 timer). Den gamma energi gjør den egnet for deteksjon av gammakamera (scintigrafi) og kort halveringstid resulterer i svært begrenset stråling tid til både hesten og dyrehåndterings personell. Denne protokollen beskriver merking av celler ved hjelp av Tc-99m-HMPAO [HMPAO merket med Tc-99m (som natrium perteknetat)] på stedet. - Bestill Tc-99m frisk fra leverandøren slik at den er levert og brukt til merking av celler viddhin 2 timer av eluering fra Tc-99m generator. Kontroller at Tc-99m leveres som en GBq i en 1 ml oppløsning (leverandørens standard buffer).
- Bruk alle buffere ved RT. Utfør merkningsmetode, implantering av cellene og bildebehandling (gamma-scintigrafi) i en isotop inneslutning med alt utstyr vaskes med alkohol kluter før starten av arbeidet.
2. Utarbeidelse av hest og Ultralyd av forbena sene
- Record ultralyd ved første inngang for skade (når benmargs aspireres), og deretter på det tidspunkt når radiomerkede celler blir injisert.
- Utføre ultralyd og celle implantasjon med hesten bærer vekten jevnt i en stall og under står sedasjon (i stedet for narkose). Administrere sedasjon ved anvendelse av en blanding av detomidin HCl og butorphanoltartrat, hver på 0,01 til 0,02 mg / kg iv.
Merk: Recovery er rask og postoperativ behandling krever ingenspesielle hensyn. - Etter perinevral anestesi blir tilført (trinn 2.6) i armen eller benet, holde hesten ved stasjonen i henhold til sedering for å redusere bevegelse av hesten under behandlingen. Sjekk visuelt riktig nivå av sedasjon dømt fra senket hode posisjon og oppførsel av hesten og at hesten er komfortabel under celle injeksjon og bevegelser av gammakamera under oppkjøpet av scintigrafiske bilder.
Merk: Det er ikke nødvendig å søke veterinær salve på øynene (for å hindre tørrhet) fordi det under sedasjon blink påvirkes ikke og hesten er i stand til å opprettholde hydrering av øynene. Overvåkingen etter implantering av cellene er ikke-invasiv (ultralyd og y-scintigrafi). - Klippet tett håret liggende den sene (med hest hårklippe) rengjør deretter klippet området ved hjelp av en kombinasjon av en klorheksidin kirurgisk kratt og til slutt alkohol.
- Påfør akustisk kobling gel til området ogskann metodisk å registrere skanninger av den komp palmar metacarpale region, sekvensielt nivåer merket 1 - 7 17, med en lineær transduser (12 MHz eller lignende) for å oppnå serie on-forekomst tverrgående og langsgående bilder. Lagre bildene digitalt, slik at tverrsnittsarealet og den maksimale skadesonen 4 kan oppnås ved hjelp av programvare for bildeanalyse.
- Forbered området liggende de palmar nervene umiddelbart distalt for carpus for aseptisk injeksjon av lokalbedøvelse for å sikre fullstendig desensitivisering av huden overliggende senen og den overfladiske digitale flexor sene. Injisere 2 ml mepivicaine både subkutant og grenser til palmar nerver (i sin sub-fascial plassering) mellom flexor sener og suspensory ligament umiddelbart distalt for carpus på begge sider av lem.
- Når den foreløpige skanningen er utført forberede implantasjonsstedet ved å skrubbe området med klorheksidin kirurgiske scrub oppløsningen i minst 5 min, og til slutt alkohol med gjennomvåt gasbind. Utføre alle påfølgende trinn i en aseptisk måte.
3. Tc-99m-merking av Equine stamceller
Merk: celle merkingsfremgangsmåten kan utføres under ultralyd av forbena, da dette vil redusere isotop nedbrytning mellom cellemerking og implantering av merkede celler i sene.
- Fjern BMS fra cellene som det forstyrrer opptaket av isotopen. For å gjøre dette, hente hetteglasset med BMMSC (10 millioner celler i 1 ml av BMS) fra chill boksen og pellet cellene i en mikro ved 350 xg i 5 min ved RT. Fjern forsiktig supernatanten med en 18G eller 19G nål (knyttet til en 2 ml sprøyte), og etterlater en liten dråpe (≤0.1 ml) i røret for å lette celle resuspensjon. Lagre supernatanten (BMS) i et sterilt mikrosentrifugerør og holde på is for senere gjenbruk.
- Suspender cellene i den gjenværende dråpe av supernatanten ved flicking røret forsiktig med fingrene (snarere enn vortex) og la røret i et rack på RT. Sørg for at cellene er helt resuspendert og at det er ingen synlige celleklumper.
- Klargjør Tc-99m som følger. Overføre 1 ml av technetium pertechnetat inn i en ampulle med HMPAO anvendelse av en 1 ml sprøyte og nål. Bland forsiktig, men grundig og la stå i 5 min bak bly skjerming. Merk: Dette trinnet kan utføres mens cellene spinner i trinn 2,1.
- Legg alt av Tc-99m-HMPAO blanding med en 1 ml sprøyte og kanyle til cellene og bland forsiktig. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur før bly skjerming.
- For de neste trinnene ved å bruke en tang (eller et stykke silkepapir) for å åpne lokket på mikrosentrifugerør for å minimalisere forurensning av isotop (hansker) tommel og deretter annet utstyr. Bruk en 2 ml sprøyte og 21 G nål til å legge til eller fjerne vaskebuffer.
Merk: Bruken av et felt isotop monitor er oppfordret til å overvåke forurensning av overflater og utstyr. Tilsett 1 ml PBS til Tc-99m-HMPAO-celleblanding, lukker lokket, bland forsiktig og spin til pellet cellene som i trinn 3.1. - Fjerne PBS nøye til et nytt rør (lagre denne bak bly skjerming og etiketten som W1). Cellepelleten suspenderes i 1 ml frisk PBS. Sentrifuger røret og fjern supernatanten som ovenfor (lagre dette og etiketten som W2).
- Beregne effektiviteten av merking ved å måle tellingene i W1 og W2 rør og i cellepelleten. Gjør dette ved å plassere hver rør i et Vel isotop dosekalibratoren instrument og opptak av radioaktivitet som tellinger per minutt (CPM). Beregn merking effektivitet as (Radioaktivitet som CPM av celler) / (Radioaktivitet av celler + supernatant) x 100.
- Suspender cellene grundig i rest PBS og deretter legge til BMS reddet fra trinn 3.1. Cellene er klare for intralesjonal implantasjon.
4. Implantasjon av Tc-99m-HMPAO merkede Cells
- Intralesjonal implantasjoninn i senen ledes med ultralyd
- Sakte innføre en 1,5 eller 2 tommer (50 mm) 20 G nål inn den maksimale skadesonen av lesjon i en langsgående retning med ultralyd transducer, dekket av et sterilt drapere, på linje med nålen, slik at lengden av nålen kan identifiseres ultrasonographically og spissen at nålen er nøyaktig plassert i sentrum av lesjonen.
- Ved hjelp av egnet skjerming, samle cellene inn i en 2 ml sprøyte (Luer-lås, for å minimere risikoen for ytre forurensning og i en bly-skjermet sprøyte cover) ved anvendelse av en 20 G nål. Kast nålen være forsiktig med å miste noe væske. Nå fester sprøyten med de merkede cellene bort på nålen forhånds ligger i senen.
- Plasser ultralydprobe under nålen slik at nålen kanalen i vevet er tydelig synlig. Injisere cellene på en langsom, men jevn fart inn i lesjonen. Pass på at det ikke er noen motstand mot injeksjon. Hvis dette er oppståttnøye omplassere nål under ultralyd veiledning. Sjekk at væsken mate inn i lesjonen er synlig på ultralydbildet som ekkofritt væske som inneholder hyperechogenic luftbobler.
- Trekke nålen og umiddelbart plassere trykk over nålen hullet for å hindre tap av injiserte celler, og for å minimere spredning av isotopen i løpet av den ytre overflate av benet. Umiddelbart kle lem med ett lag med autoadhesive bandasje. Hesten er nå klar for gamma scintigrafi. Utfør dette umiddelbart.
Merk: Etter å injisere cellene inn i senen, få en telling av den tomme sprøyten og kanylen for å vurdere mulig direkte tap av celler som kan forbli i sprøyten.
- Regional perfusjon av Tc-99m-HMPAO-merkede celler
- Følg trinn 2.4.
- Påfør en 100 mm gummi tourniquet bandasje på den proksimale metacarpus med to 100 mm bomull roll gasbind bandasje plassert medialt og lateralt.
- Aseptisk forberede the huden over det laterale palmar digital vene i høyde med den laterale sesamoid proksimale benet ved skrubbing området med en klorheksidin kirurgisk skrubb oppløsningen i minst 5 minutter og til slutt med gas fuktet med alkohol. Utføre alle påfølgende trinn i en aseptisk måte.
- Forbered en 100 mm forlengelsessett med en 21 G x ¾ "(0,8 x 19 mm) sommerfugl nål for venepunksjon ved å fylle med heparinisert sterilt saltvann og deretter innføre nålen inn i side palmar digital blodåre. Når venen er oppgitt blod vil delvis fylle forlengelsesslangen. På Luer lock-kontakt feste en Luer lock gummikappe til tilrettelegging påfølgende injeksjon av merkede celler.
- Fortynn de MSC i 19 ml PBS ved å samle cellene i en 20 ml sprøyte forhåndslastet med PBS. Påfør cellene via gummikoppen ved hjelp av en 18 G (1,2 x 40 mm) kanyle på en langsom, men jevn hastighet (30 - 40 sek). Skyll kateteret med 1 ml PBS forhåndslagret i en Syringe.
- Fjern nålen og umiddelbart press på huden over nålen hullet med et lag av fem 4 x 4 bomullstrådnettene. Deretter plasserer en lett bandasje med elastisk lim over proksimale sesamoid området og la den tourniquet på plass i 30 minutter etter injeksjon.
- Slipp tourniquet etter 30 min. Hesten er nå klar for gamma scintigrafi.
Merk: Etter å injisere cellene, erverve et tall på den tomme sprøyten og kanylen for å vurdere mulig direkte tap av celler som kan forbli i sprøyten.
5. Gamma Scintigrafi
- Scintigrafi bilder
- Erverve planar scintigrafi bilder med et gammakamera (satt til 140 keV fotoelektrisk peak ved hjelp av en 20% symmetrisk vindu) utstyrt med en lav energi, parallelle hull kollimatoren.
- Få alle bildene etter tid 0 på stående hester sedert som i trinn 2.2. Etter tiden 0 scintigram, erstatte lyset bandasje over implantasjon site med en polstret bandasje. Fjern denne bandasje før hver scintigrafi eksamen.
- Erverve statiske bilder i 60 sek hver (256 av 256 matrix) med bearbeiding programvare med "buy" - "studie selection" - "bein statiske" alternativer. Det er viktig at hesten ikke beveger seg under bildet anskaffelsesperioden fordi statisk modus alternativet ikke har en modul for korreksjon av bevegelse.
- For intralesjonal injeksjon, innhente laterale bilder fra lesjonen området fra carpus til den fjerne ekstremitet, tilsvarende område i den kontralaterale lem, venstre lunge-feltet og den venstre skjoldbruskkjertelen. Under oppkjøpet av forbein bilder, plassere en blyskjerm mellom beina for å unngå avbildning av greinen contralateral. Erverve bildene ved 5 min etter injeksjon (tid 0) og deretter på 1, 3, 6, 12, 24, 36 og 48 timer.
- For regional perfusjon, skaffe laterale og rygggamma bilder som for 5.1.1.3. Få bilder 5 min after tourniquet utgivelse. Dette vil være tid 0. Det kan være nyttig å avbilde lem umiddelbart etter injisering cellene til å vurdere teller før tilstrammende utgivelse. Innhente gamma bilder ved 1, 3, 6, 12, 24, 36 og 48 timer etter administrering av cellene.
- Etter at bildene er kjøpt, behandle bildene manuelt ved hjelp av "behandling" alternativet av programvaren med alternativer som er valgt for "Sokoloff" farge og "Invert" farge. Neste velg "region of interest" (ROI) og "ellipse" da dette gjør omforming av utvalget maske og bevegelse over lesjonen området. Skaff teller over ROI ved å velge "legg til statistikk" alternativet. Sikre at identisk størrelse regioner av interesse (ROI) registreres for hvert dyr på forskjellige tidspunkter.
- Deretter korrigere teller for den forutsagte nedbrytning av technetium ved hvert tidspunkt. Bruk følgende ligning for å korrigere for forfall:A = A e o - (0.693t / T 1/2), hvor A o er den opprinnelige aktivitet av isotopen, er A nedbrytning korrigert radioaktivitet ved tid null, t er medgått tid og T 1/2 er halverings -livet av isotopen. Deretter uttrykker de korrigerte tellinger ved hvert tidspunkt som en prosentandel av den ROI ved tid 0 for å regne ut prosentandelen av celler som gjenstår, ved hjelp av følgende formel:
- Erverve planar scintigrafi bilder med et gammakamera (satt til 140 keV fotoelektrisk peak ved hjelp av en 20% symmetrisk vindu) utstyrt med en lav energi, parallelle hull kollimatoren.
% gjenværende celler (t) = 100 - {[(forutsagt decay (t) - decay (t)) / predikert decay (t)]} x 100
råte (t) = ROI (t) / ROI (0) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tc-99m-HMPAO innlemmelse i BMMSs ikke påvirker deres evne til å forholde seg til vev kultur plast og mens de viser spredning evne til å danne monolagene (figur 1) har vi ikke helt bestemt om spredningstakt eller andre cellulære fenotyper er berørt. Deres morfologi er lik umerkede celler med en typisk spindel form. Den cellulære merking effektivitet (det vil si., Opptak av etiketten) varierer typisk fra ca. 1,5% til 25%. Hovedårsaken til den lave merking effektiviteten var relatert til forsinkelse i levering av 99m Tc til klinikken fra stedet der Mo-99 / Tc-99m generator har blitt eluert. Forsinkelser på mer enn 2 timer resultere i en betydelig reduksjon i merking av cellene. Imidlertid er tilstrekkelig isotop inkorporert inn i cellene for å utføre gamma-scintigrafi i opp til 36 timer (figur 2). Faktorer som kan forbedre merking effektivitet er beskrevet i diskusjonen.
en (direkte inn i lesjonen), eller ved regional perfusjon via en digital en vene eller arterie 12. Intralesjonal implantasjon er mulig når skaden er i kjernen av den sene og omgitt av intakt sene vev som fungerer som en beholder for cellene. Regional perfusjon er en enklere rute å administrere cellene som de injiseres i en blodåre, men metoden er avhengig av en forventning om at de MSC er i stand til å "hjemme-in" til sene lesjon. Det er begrenset dokumentasjon på at MSC kan spesielt hjemme i områder av sene lesjoner men denne metoden gir en nyttig eksperimentell tilnærming for å utvikle applikasjoner som kan øke homing kapasitet på MSC.
Med intralesional levering rute, vil cellene bli sett på som et satsingsområde signal som fortsatt er forholdsvis lokaliseres med tiden ie., Er det begrenset spread eller migrering av cellene i det omkringliggende vev sene. I motsetning til dette, vil det være en gradvis reduksjon av signal med tiden på injeksjonsstedet når cellene blir administrert ved regional perfusjon via den digitale palmar vene (figur 2). Det er vanlig med intralesional injeksjon for lunge feltene for å være negativ, men i noen tilfeller på et veldig tidlig tidspunkt i lungene kan vise isotopen signal som kan være navet og deretter blir mer generalisert (figur 3). Skjoldbruskkjertelen er fortsatt negativt med denne administrasjonen ruten. Regional perfusjon på lignende måte kan vise fokale signal i lungene som deretter blir mer diffust, men signalet er betydelig mer intens enn den som ble observert med intralesjonal rute. Skjoldbrusk kan ofte også vise fokus signal.
Den opprinnelige totale radioisotop telling av celler (tid 0, pre-injeksjon) og teller fra den innledende gamma scintigram på regionen av interesse (tid 0, post-injection) er kjent og benyttet til å beregne den prosentvise nedgang i tellinger ved hvert tidspunkt. Dette brukes til å sammenligne den forutsagte nedbrytning av Tc-99m fra den første teller (figur 4). Den beregnede kurven vil følge den forutsagte kurve. Imidlertid, etter å ha tatt den forutsagte forråtnelse i betraktning, er utholdenhet av celler som er tilbake i injeksjonsstedet etter intralesjonal administrasjon omtrent 32% (ved 12 timer) og 24% (ved 24 timer) (figur 4).
Figur 1. Cell Merking, Injection og Gamma Scintigrafi (A) Overføring av BMMSC inn en mikro før merking med Tc-99m-HMPAO bak bly-lined skjerming (skjerm og holder sprøyte) og strålingsmonitor og mikro.; (B) En porsjon av Tc-99m-HMPAO merkede celler sådd ut i en vevskulturskål viser god morphology, levedyktighet og spredning; (C) Injeksjon av Tc-99m-HMPAO merkede cellene under ultralyd veiledning til skade området av retten forbena SDFT; (D) y-scintigrafi av forbena. Den gamma-kameraet er plassert direkte ved hjelp av et hydraulisk manøvrerbare arm og eventuelle merkede celler i det kontralaterale lem elimineres ved en blyskjerm holdt mellom bena. Gammakamera er tilsvarende plassert på brystet for å overvåke lunge-feltet eller i nakken for å overvåke thyroid feltet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Ultralyd og Gamma Scintigrams av SDFT. Typiske ultrasonographs av forbena på mid-metacarpale regionen i (A (B) tverrsnitt. Lesjonen i SDFT er klart sett som en hypoechoic område (mot toppen av skanningen) sammenlignet med den uskadde (normal) vev integriteten av den dype digitale flexor sene (DDFT) tilstøtende til og under SDFT. Arealet av lesjonen, og de relative posisjoner av en sene er vist i skjematisk nedenfor. Gamma scintigraphs utført ved 3, 6 og 12 timer etter injeksjon av radioaktivt merkede celler er vist for de celler injisert (C) inn i lesjonen eller (D) ved intravenøs regional perfusjon via den digitale palmar venen. I det tilfelle som er vist, var opptaket av radioaktivt merkede celler i lesjon området i SDFT (heltrukne piler). Persistens av opptak ved palmar digital venen er merket med stiplede pilen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Gamma Scintigrams av lungen og Thyroid. Typiske skanninger fra tidlige tidspunkter er vist for både intralesional injeksjon og regional perfusjon av merkede celler. Legg merke til det sentrale og diffuse signal i lunge og skjoldbrusk felt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Decay av radioaktivitet Registrert fra de regioner av interesse etter Intralesjonal Injection. I denne hesten, ble teller målt fra gamma scintigrams av SDFT enn 36 timer etter injeksjon inn i lesjonen. Venstre panel: radioaktivitet på hvert tidspunkt ble beregnet mot tiden 0-verdi. Daatural nedbrytning i radioaktivitet av 99mTc er vist for sammenligning. Høyre panel: estimert andel av celler som gjenstår. Dette beregnes fra det radioaktivitetsnivå fra regionene av interesse. I dette tilfellet den gjenværende prosentandel av celler ved 24 timer var omtrent 24%. Vi har utført denne protokollen (merking av MSC og implantasjon) på 21 hester. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I tillegg til benmargen, stamceller isolert fra kilder som fettvev er egnet for merking med denne protokollen. Videre kan celler fra en frossen tilstand bli gjenopplivet og utvidet i kulturen til de ønskede tallene for merking studier 12.
En kritisk faktor som bestemmer effektiviteten av merking av BMMSC er tiden mellom eluering av Tc-99m fra molybden generatoren ved radiofarmasi, fremstilling av Tc-99m-HMPAO og bruken av radio-farmasøytiske forbindelse i klinikken. Det er et inverst forhold mellom merkingseffektivitet og tid etter Tc-99m-eluering fra generatoren, slik at forsinkelse utover denne perioden i betydelig grad kan svekke effektiviteten av cellen merking. Derfor er tett koordinering kreves mellom levering av cellene fra laboratoriet og levering av Tc-99m til klinikken på dagen at cellene blir radiomerket og implantert. Transporttiden til clinic er derfor en viktig faktor. Leverandørens dokument angir at nedbrytning av Tc-99m reduserer renheten av det radiokjemiske etter 2 timer etter eluering, som kan interferere med bindingen av HMPAO til Tc-99m, og deretter ble mengden av Tc-99m-HMPAO tatt opp av cellene. Vi har også merket seg at merking av dyrkede celler i et laboratoriemiljø ga mer effektiv merking enn i klinikken. Dette har også rapportert av en annen studie hos hester 5, hvor cellene ble merket i et laboratoriemiljø. I tillegg, i vår erfaring, er etiketten tatt opp mer effektivt av celler som er merket umiddelbart etter forberedelse fra blod- eller vevsprøver sammenlignet med celler fremstilt fra kultur. Men selv med lav effektivitet med merking det er tilstrekkelig markøren bundet til cellene for å utføre scintigrafi enn 36 timer.
Merking av virkningsgrader på 40% - 80% kan oppnås for leukocytter hvis Tc-99m blir brukt fra enfrisk generator-eluat i løpet av 30 minutter, og reaksjonen utføres i et lite volum (1 - 0,5 ml) 18. Merking av virkningsgrader på 47% - 71% er blitt oppnådd for equine MSC 19 som viser at det er mulig å øke effektiviteten av merking MSCer under ideelle forhold.
Vi rutinemessig implantere 20 millioner celler for behandling av SDFT kjerne lesjoner selv om opp til 40 millioner celler er blitt implantert for de største lesjoner. Et tilsvarende antall celler kan bli implantert via regional perfusjon, selv om denne fremgangsmåte ikke er vanlig brukt på grunn av det mer komplisert prosedyre. Imidlertid kan det være nyttig for lesjoner som strekker seg til periferien av den sene overflaten med en forventning om at tilstrekkelig antall celler hjem inn i lesjonen. Sporing av cellene ved gamma-scintigrafi kan gi nyttig informasjon om bevegelsen av celler som administreres ved forskjellige ruter. I denne protokollen, cellene implantert ved intralesional ruten er mostly beholdt på injeksjonsstedet ved intralesional ruten. Radioisotop signal kan observeres i lungen feltene i noen tilfeller, men det viser seg generelt at det er liten migrering av celler fra lesjon området. Levering av BMMSC av regional perfusjon antyder at det kan være retensjon av celler ved skadestedet, men når levert ved intravenøs injeksjon 4 vi har observert homing av cellene. Tc-99m-HMPAO label påvirker ikke cellene migrasjon evne 20, og som Tc-99m-HMPAO er internalisert av celler og beholdt i cytoplasma, er det usannsynlig å forstyrre vedheft egenskaper.
Ved beregning av signal fra regioner av interesse kan være en undervurdering som det er mulig at denne kan det være et betydelig dissosiering av etiketten fra cellene (frigitt fra døde celler eller andre mekanismer for frigjøring av levende celler). Skjoldbrusk fanger fri isotop (Tc-99m) løslatt fra døde eller døende celler, og Tc-99m-HMPAO kan elimineres via nyrene og tarmen. Disse vev kan bli overvåket av gamma scintigrafi for å vurdere potensielle tap av etiketten.
Cellen merkningsmetode kan tilpasses for testing av celleopptak og retensjon på forskjellige steder (organer og skade) ved hjelp av forskjellige leveringsruter. Det sentrale natur av signalet i lungene kan være en indikasjon på celleaggregater som antagelig bryter opp over tid, eller angir cellelyse. Skjoldbruskkjertelen, som fanger fri isotop, viser antagelig en økning i opptaket følgende regional perfusjon fordi de injiserte celler og resulterer rusk fra døde celler har en mer tilgjengelig rute til skjoldbrusk via sirkulasjonen. Selv om bare ca. 24% av cellene igjen etter 24 timer, den intralesjonal ruten i senen er den mest effektive leveringsruten som de fleste tilfeller viste ingen fri Tc-99m i skjoldbruskkjertelen. Informasjonen han fikk fra å benytte slike protokoller kan informere fremtidig design og utvikling av stamcelle søknader om more effektive kliniske behandlingsformer.
Cellen merking protokoll ble tilpasset for bruk i hesten fra Tc-99m-merking HMPAO av leukocytter i humane medisinske anvendelser. Bruken i denne protokollen demonstrerer anvendelse i et stort dyr hvori sene sykdom oppstår spontant for undersøkelser av celle-baserte terapier. Rekrutteringen av kliniske tilfeller kan bidra til å oppveie de økte kostnader forbundet med å arbeide med en større dyr. Merkingen prosedyre for bruk som en avbildnings modalitet er blitt beskrevet i små dyremodeller 21 og vi tror at protokollen kan likeledes benyttes i større dyr som sauer for undersøkelser av andre sene sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Technetium99m | Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements. The isotope must be used within 2 hr of elution from the molybdenum-99 generator | ||
| Ceretec - Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) | GE HealthCare | Please enquire directly with GE HealthCare | |
| Microfuge, Minispin/Minispin Plus | Ependorf | 22620100 | |
| 18 G and 19 G Needles | Terumo Medical | NN-1838R (18 G); NN1938R (19 G) | |
| Syringes 1 ml and 2 ml | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SYR6200 (1 ml); SYR6003 (2 ml) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 ml | Greiner Bio-One Ltd | 616201 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | LifeTechnologies | 14190 | |
| Sterile Gauze Swabs | Shermond Ltd | UNG602 | |
| CoflexVet self adhering bandage | Andover Healthcare, Inc. | 3540RB-018 | |
| Ultrasound imaging software | Scion Image, Scion Corporation, USA | ||
| MicasXplus Scintigram processing software | Bartec Technologies Ltd | http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html | |
| Field isotope counter for monitoring isotope | John Caunt U.K. | GMS1800a | http://www.johncaunt.com/ |
| Well counter for isotope measurements, dose calibrator | Capintec Southern Scientific | CRC-25R |
References
- Becerra, P., et al. Distribution of injected technetium(99m)-labeled mesenchymal stem cells in horses with naturally occurring tendinopathy. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1096-1102 (2013).
- Nixon, A. J., Dahlgren, L. A., Haupt, J. L., Yeager, A. E., Ward, D. L. Effect of adipose-derived nucleated cell fractions on tendon repair in horses with collagenase-induced tendinitis. American Journal of Veterinary Research. 69, 928-937 (2008).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1392-1398 (2009).
- Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PloS one. 8, e75697 (2013).
- Sole, A., et al. Distribution and persistence of technetium-99 hexamethyl propylene amine oxime-labelled bone marrow-derived mesenchymal stem cells in experimentally induced tendon lesions after intratendinous injection and regional perfusion of the equine distal limb. Equine Veterinary Journal. 45, 726-731 (2013).
- Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 44, 25-32 (2012).
- Crevier-Denoix, N., et al. Mechanical properties of pathological equine superficial digital flexor tendons. Equine Veterinary Journal. 29, Suppl S23. 23-26 (1997).
- O'Meara, B., Bladon, B., Parkin, T. D., Fraser, B., Lischer, C. J. An investigation of the relationship between race performance and superficial digital flexor tendonitis in the Thoroughbred racehorse. Equine Veterinary Journal. 42, 322-326 (2010).
- Alexander, R. M. Energy-saving mechanisms in walking and running. The Journal of Experimental Biology. 160, 55-69 (1991).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Monitoring the fate of autologous and allogeneic mesenchymal progenitor cells injected into the superficial digital flexor tendon of horses: preliminary study. Equine Veterinary Journal. 40, 178-181 (2008).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Equine embryonic stem-like cells and mesenchymal stromal cells have different survival rates and migration patterns following their injection into damaged superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 42, 636-642 (2010).
- Sole, A., et al. Scintigraphic evaluation of intra-arterial and intravenous regional limb perfusion of allogeneic bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the normal equine distal limb using (99m) Tc-HMPAO. Equine Veterinary Journal. 44, 594-599 (2012).
- Carvalho, A. M., et al. Evaluation of mesenchymal stem cell migration after equine tendonitis therapy. Equine Veterinary Journal. 46, 635-638 (2014).
- Welling, M. M., Duijvestein, M., Signore, A., van der Weerd, L. In vivo biodistribution of stem cells using molecular nuclear medicine imaging. Journal of Cellular Physiology. 226, 1444-1452 (2011).
- Dowling, B. A., Dart, A. J., Hodgson, D. R., Smith, R. K. Superficial digital flexor tendonitis in the horse. Equine Veterinary Journal. 32, 369-378 (2000).
- Kasashima, Y., Ueno, T., Tomita, A., Goodship, A. E., Smith, R. K. Optimisation of bone marrow aspiration from the equine sternum for the safe recovery of mesenchymal stem cells. Equine Veterinary Journal. 43, 288-294 (2011).
- Avella, C. S., et al. Ultrasonographic assessment of the superficial digital flexor tendons of National Hunt racehorses in training over two racing seasons. Equine Veterinary Journal. 41, 449-454 (2009).
- de Vries, E. F., Roca, M., Jamar, F., Israel, O., Signore, A. Guidelines for the labelling of leucocytes with (99m)Tc-HMPAO. Inflammation/Infection Taskgroup of the European Association of Nuclear Medicine. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 37, 842-848 (2010).
- Trela, J. M., et al. Scintigraphic comparison of intra-arterial injection and distal intravenous regional limb perfusion for administration of mesenchymal stem cells to the equine foot. Equine Veterinary Journal. 46, 479-483 (2014).
- Barbash, I. M., et al. Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution. Circulation. 108, 863-868 (2003).
- Heckl, S. Future contrast agents for molecular imaging in stroke. Current Medicinal Chemistry. 14, 1713-1728 (2007).
