Summary
目前的协议细节，用于测量功能性同源去泛素酶的活性的方法。专门探针共价修饰的酶，并允许进行检测。这种方法保存，以确定新的治疗靶点的潜力。
Abstract
泛素 - 蛋白酶体系统最近已经牵连在各种病症，包括神经变性疾病和癌症。鉴于此，技术研究本系统的调控机制是必不可少的阐明上述疾病的细胞和分子过程。使用本文中概述血凝素衍生的泛素探针作为本系统的研究的宝贵工具。本文详述的方法，使用户能够执行检测，让去泛素酶活性的直接可视化。去泛素化酶控制蛋白酶体降解，并在它们的活性位点，其允许用户进行调查多种酶的活性在一个测定共享功能同源性。裂解液是通过温和的化学细胞破碎，并获得与培养活性部位定向探头。功能酶标记探针，同时不活跃的酶保持绑定。通过运行宁该测定中，用户获得上的活性和多个去泛素酶在一个快速和容易的方式潜在表达信息。当前的方法是显著比使用单个抗体对于预测百在人类细胞去泛素酶更有效。
Introduction
泛素 - 蛋白酶体系统（UPS），作为在哺乳动物细胞的主要降解途径之一。基板在蛋白酶体结合的降解共价标记的泛素（泛素）1的聚合物。前的目标衬底进入蛋白酶体进行降解，聚遍在蛋白标记必须被去除。一类称为酶去泛素（泛素化酶）的酶负责泛素分子2的去除和回收。据预测，从人类基因组中，有近百名在泛素化酶小区3工作。有了这样一个大量的泛素化酶泛素控制介导的细胞过程，研究这些酶是一种挑战，因为基因技术不给上的活动和免疫印迹信息，仅给出了表达水平的信息。
使用流感血凝素（HA）的标记，泛素衍生的活性部位定向探头允许的共价国防部官能泛素化酶并且因此ification给出了这些酶的活性对Western印迹4直接可视化。探针具有用作活性位点半胱氨酸残基5一自杀底物的C-末端硫醇反应性基团。用这些探针，能够研究细胞的两个病理和生理状态下许多泛素化酶的活性和潜在的表达。
变化DUB活性已牵涉多种病理状况，如帕金森氏，阿尔茨海默氏症，贫血和多种癌症6-10。这种技术提供了一个强大的工具，疾病的研究。在本文中，我们将展示这项技术在HeLa和M17细胞已使用玻璃珠裂解的应用。此外，我们概述了如何使用此方法在小鼠脊髓组织样本。从这种技术获得的信息可以被用来作为一个起点，用于识别治疗目标以及用于不同疾病状况的研究建立的模型。这种技术的真正的实用在于它能够提供在多个泛素化酶信息在单个测定能力。
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Protocol
1.裂解液的制备
- 溶解蔗糖在去离子（DI）水，使2M的储备溶液。过滤蔗糖的使用真空从动0.22μm的聚偏二氟乙烯（PVDF）过滤2M的溶液。
- 溶解二硫苏糖醇（DTT）在去离子水，使厌氧条件下的500mM储备溶液并储存。溶解氯化镁（MgCl 2的）在去离子水，使100mM的储备液。溶解三磷酸腺苷（ATP）的二钠水合物的去离子水，使50mM的储备溶液。
- 弥补在pH7.4 Tris溶液由在去离子水中溶解的Trizma盐酸盐和调节使用氢氧化钠（NaOH）的pH值。
- 结合的储备溶液的部分在去离子水，使裂解缓冲液为250毫米，1毫米，使MgCl 2浓度为5mM，1mM的的ATP浓度和为50mM的Tris浓度的DTT浓度的蔗糖浓度。例如，混合535.3微升三，500微升的MgCl 2，1.25毫升蔗糖，20微升的DTT，200微升ATP和7.4947毫升去离子水，使加入10ml裂解缓冲液。这可以用来大约20实验。
对于实验2培养细胞
- 通过等分30毫升DMEM + 10％胎牛血清（FBS）的到50毫升锥形管中作介质。
- 从液氮储存冷冻转让或M17 HeLa细胞的小烧杯中，用温水。
- 转移细胞到50ml锥形管中。首先，一些媒体加入到细胞小瓶。随后的5秒内解冻转移悬浮细胞。
- 离心细胞悬浮液在450×g离心5分钟以获得细胞沉淀。加20毫升介质成T75烧瓶中。
- 从使用吸细胞取出介质。加入5毫升的新鲜培养基以将细胞沉淀重悬。
- 传送5毫升细胞悬浮液至20毫升介质在T75烧瓶中并在37℃。 CH安格媒体每3天。
3.细胞收获
- 通过吸取出介质，小心不要碰到细胞。
- 用5ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞。使用抽吸去除PBS。
- 添加3ml胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸（EDTA）的T75烧瓶，并在37℃下进行3分钟。
- 加入6毫升的新鲜培养基的烧瓶中，并悬浮细胞。
- 该悬浮液转移到15毫升锥形管中并离心，在290×g下5分钟。
- 去除上清，加入5毫升的PBS。轻轻拍打管的底部向上突破的沉淀。离心，在290×g离心5分钟。
- 重复步骤3.6三次。
- 除去PBS重悬细胞中加入1ml新鲜的PBS。转移到Eppendorf管中（1.5毫升）。旋转，在290×g离心5分钟。
4.细胞裂解
- 使用移液管的测量粒料的近似体积ð称出玻璃珠在一团：体积比为1：1。加入裂解缓冲液将沉淀的体积的两倍。
注：添加缓冲添加玻璃珠之前。 - 裂解的细胞在Eppendorf管中以最大搅拌30分钟，在4℃下通过涡旋在冷室中。
- 短暂离心，在200×g离心30秒，将沉淀珠子。回收上清。
- 作为前添加的玻璃珠相同体积的上清液。
- 涡流再次在最大搅拌30分钟，在4℃。
- 短暂离心，在200×g离心30秒以解决玻璃珠。回收上清。
- 离心机在5030×g离心5分钟以除去细胞核，膜和完整细胞。收集上清液，这是细胞裂解物。
5.组织均匀化
- 使质量：体积的1:9溶液小鼠脊髓组织裂解缓冲液中。
注意：本方法适用于各种不同耳鼻喉科组织样本。 - 均质化使用2级的一个设置在均化30秒的组织，以确保没有剩余的块。
- 降速在5,030×g离心3分钟以除去细胞核，膜和完整细胞。
- 收集上清液，这是溶胞产物。
6.样品衍生
- 在一个96孔板分析执行二喹啉甲酸（BCA）来确定使用所指定的皮尔斯BCA蛋白测定试剂盒协议比色96孔板读取器的组织裂解液的蛋白质浓度。
- 带来使用去离子（DI）水相当于20微克总蛋白的50微升等分试样。
- 加入2微升1.35微米的HA-UB-乙烯基砜（VS）到溶液中，并培育1小时，在37℃。这将导致20微克裂解物在最终的反应混合物50nM的探针。这是在大的摩尔过量，以确保功能泛素化酶标记。
- 一世ncubate在5分钟的Laemmli的样品缓冲液将样品在95℃。对于52微升反应体积使用26微升2×样品缓冲液，13微升的4倍样品缓冲液，或8.87微升6X样品缓冲液。
- 在装载前凝胶酷冰上。
7. Western印迹
- 加载一个12孔4-20％tris-甘氨酸凝胶用40微升制备的样品的
- 运行在95伏凝胶直到离子前沿到达底部。
- 进行凝胶的过夜转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
- 孵育在氨基黑染色的膜和扫描membane获得的图像表示蛋白在每个车道的量。
- 脱色，膜，并培育在5％牛奶的PBS中进行1小时到框。
- 孵育在初级抗HA抗体的膜在浓度为1：10,000，在5％牛奶的PBS中任过夜，在4℃或4小时，在室温下进行。
- 执行3次洗涤˚F或每5分钟在PBS与0.1％Tween-20的洗涤剂。
- 孵育在小鼠辣根过氧化物酶的膜在浓度为1：10,000的5％乳的PBS，至少2小时。
- 执行3次洗涤，每次5分钟，在PBS中与0.1％Tween-20的洗涤剂。
- 执行1洗5分钟，在PBS。
- 孵育在化学发光检测试剂的膜10分钟，检测使用化学发光检测器。使用自动曝光的检测器上的设置。
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Representative Results
使用获得的协议（3细胞收集）的详细方法和小鼠脊髓组织培养的M17和HeLa细胞收获。将细胞沉淀/脊髓组织置于与在试剂制备部分所述裂解缓冲液的管中。细胞沉淀物用玻璃珠（ 图1A）和小鼠脊髓组织样品使用均化器（ 图1B）进行匀浆裂解。裂解或均化后，将样品然后在5030×g离心离心除去玻璃珠和/或完整的膜和细胞器（ 图2）。这两种方法是裂解的机械装置以保持酶活性。然后使用BCA法测定细胞的蛋白质浓度。 20总蛋白的微克孵育2微升1.35微米探针1小时，在37℃（ 图3）。然后将样品在4倍的Laemmli的孵育在95℃下样品缓冲液以终止反应。将制备的样品装载在4-20％tris-甘氨酸凝胶，并在95 v运行，直到离子前沿到达底部。该蛋白质过夜转移至PVDF膜上。使用氨基黑染色（ 图4）的蛋白加载量检查。该控制步骤可确保在活动的差异是由于实际细胞过程而不是不等蛋白质上样。相等蛋白量的在第一个实验中（ 图4A）中。在第二个实验中，不相等的蛋白量的由于在不同的细胞系（ 图4B）的活性谱的预期差异加载。这样做是为了确保用于孵育与N- -ethylmaleimide（NEM），这是一种半胱氨酸抑制剂和应导致对免疫印迹减小的信号的M17细胞裂解物的活性图谱的检测。将膜孵育抗HA第一抗体，小鼠Horseradish过氧化物酶，然后使用化学发光成像（ 图5）检测到。成功标记使用探针导致在膜（ 图5A中的C）的每个车道的轮廓的泛素化酶的。该带中的不同分子量的强度对应于DUB酶的活性水平。当类似的蛋白质，如UCHL1在HeLa和M17细胞（ 图5）进行比较，在整个细胞系的各种泛素化酶活性水平的差异变得明显。凝胶的化学发光可视化是至关重要的，因为不像氨基黑染色，这表明加载蛋白质的量，这表明已与探针反应的活性的蛋白质的量。的分子量标准的光图像（ 图5B）作为用于识别各个泛素化酶的导向。需要的探针的质量的结果的分析来表征DUB期间被添加到该蛋白质的大小 s的正确的分子量。
图1：裂解方法细胞与组织的照片表示在（B）中的细胞用玻璃珠中的 （A）相对于的Polytron裂解裂解。
图2：细胞与组织细胞裂解物示于（A）中沉降的玻璃珠和不中断的细胞膜和细胞器在裂解和离心后的底部的离心产品 。组织裂解示出在均化和离心后的底部（B）中的不间断的细胞膜和细胞器。
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图3：机制泛素化酶的标签示意图，显示了活性位点半胱氨酸残基和HA-UB-VS的官能团之间的共价键请点击此处查看该图的放大版本。
图4：膜的酰胺黑渍膜表示氨基黑染色上裂解物温育用N- -ethylmaleimide（NEM）完成的，具有标记的HA-UB-乙烯基砜（VS）和运行在western印迹。样品是从左至右如下- （A）海拉- NEM，海拉+ NEM; （二）标准先生，M17 - NEM，M17 + NEM 请CLICķ此处查看该图的放大版本。
图5：Western印迹的结果的膜示出作为通过探测用于将抗HA确定的各种泛素化酶的活性水平。样品是从左至右如下- （A）海拉- NEM，海拉+ NEM; （B）先生的标准; （C）M17 - NEM，M17 + NEM 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
由于泛素化是一个基本的细胞活性，了解监管机制可能是关键发掘疾病和病理过程。使用医管局标记这里报告泛素衍生的活性部位定向探头提供了一种简单，但非常适用的方法成为研究泛素介导的蛋白质降解。这种方法更快，更便宜不是单独研究泛素化酶中的每一个。
在该方法中，细胞的裂解是通过机械装置来实现 - 利用玻璃珠。这种温和的裂解方法保留代谢细胞内的画面。然而，该裂解方法的一个主要缺点是约60-70％的低效率。这意味着需要大量的细胞，以确保裂解物浓缩足够用于实验。 T75烧瓶用80 - 90％汇合的细胞层应该用于产生浓缩的溶胞产物。此外，该实验的胰蛋白酶处理步骤是关键因为大部分附着的细胞必须在溶液中悬浮。检查在显微镜下将烧瓶以确保细胞在培养一显著部转移到50ml管中之前浮动。如果未能正确地trypsinize粘附细胞将导致更小的颗粒和通过扩展少在较低浓度的溶胞产物。裂解物即在不使用应储存在-80℃，转移到使用前-20℃24小时，使用的当天在冰上解冻。这允许裂解物解冻均匀，并降低损坏从快速解冻的酶。
在应用此方法到组织中任一个杜恩斯或Polytron匀浆可以代替玻璃珠11被使用。将所得到的溶胞产物可以立即标记探针或使用存储在-80℃。如果杜恩斯或Polytron匀浆用于获得裂解物，然后玻璃珠，不应使用。这导致在所述裂解物的总蛋白浓度的降低。一个lternatively，使用原代细胞培养物的方法，固体组织样品可以是第一培养，然后用玻璃珠裂解。
此方法的主要限制在于，即使它允许用户可视化的酶的活性，它不提供准确信息对个人泛素化酶的表达模式。这种方法在没有酶的结构同源性使用功能的同源性。因此，进一步的实验用的各个抗体将必须做解释活性降低是否是在活性位点或酶的实际损失缺陷的结果。此外，在该协议中使用的裂解方法不破开细胞的细胞核。在细胞核中泛素化酶可提供有关疾病过程进一步的关键信息。
不过，这种方法是在其提供一种不能从任何其他来源获得的信息的能力是唯一的。这两种RNA实现方法具的ds以及使用各个抗体不提供有关的酶的功能的信息。在未来，潜在存在该方法的免疫组化（IHC）染色中的应用。 IHC染色不仅给有关的酶的活性的信息，但它也将提供深入的位置在组织中有不同的泛素化酶被激活。此外，这种方法可以加上一个亚细胞分离技术如一个通过科拉等人详细描述。在2012年，研究在膜结合的细胞器12的泛素化酶的活性。虽然这是在分子生物学一个相对较新的技术中，存在着巨大的潜力，以推广应用。利用活性位点定向分子探针可能把握关键，以阐明许多疾病的病因。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们要感谢明尼苏达大学的李实验室提供了所用的小鼠脊髓组织样本。这项工作是由国防部卵巢癌研究计划（OCRP）OC093424以MB部的支持下，由兰迪剃须刀癌症研究和社区基金，以MB和明尼苏达卵巢癌联盟（MoCA），以MB。该资助者在研究设计，数据收集和分析，决定发表或准备手稿没有作用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerGen 125 (homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters 0.22 µm | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106 µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-092 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75 cm2 w/ filter cup 250 ml 120/cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
References
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