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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

की एक zebrafish लारवल मॉडल में सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के गैर इनवेसिव इमेजिंग Published: April 21, 2015 doi: 10.3791/52788
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Microbiology Doctoral Training Program, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin-Madison

Abstract

जलीय रोगज़नक़, स्ट्रैपटोकोकस iniae, मत्स्य उद्योग के लिए वार्षिक घाटे में 100 मिलियन डॉलर से अधिक के लिए जिम्मेदार है और मछली और मनुष्य दोनों में प्रणालीगत रोग पैदा करने में सक्षम है। एस का एक बेहतर समझ iniae रोग रोगजनन एक उपयुक्त मॉडल प्रणाली की आवश्यकता है। fluorescently प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ टैग आनुवंशिक Tractability और zebrafish के प्रारंभिक विकास के चरणों के ऑप्टिकल पारदर्शिता ट्रांसजेनिक लाइनों की पीढ़ी और गैर इनवेसिव इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं। कई हफ्तों के निषेचन पोस्ट तक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली को पूरी तरह से कार्य नहीं है, लेकिन zebrafish लार्वा न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज दोनों के साथ एक संरक्षित कशेरुकी सहज प्रतिरक्षा प्रणाली है। इस प्रकार, एक लार्वा संक्रमण मॉडल की पीढ़ी एस को नियंत्रित करने में सहज उन्मुक्ति के विशिष्ट योगदान के अध्ययन के लिए अनुमति देता है iniae संक्रमण।

microinjection की साइट एक संक्रमण है तय करेंगे कि क्याप्रणालीगत या शुरू में स्थानीयकृत किया गया। यहाँ, हम कान पुटिका zebrafish आयु वर्ग के 2-3 दिन बाद निषेचन के इंजेक्शन के रूप में अच्छी तरह से संक्रमण के फ्लोरोसेंट confocal इमेजिंग के लिए हमारी तकनीक के लिए हमारे प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एक स्थानीय संक्रमण साइट प्रारंभिक सूक्ष्म जीव आक्रमण का अवलोकन, मेजबान कोशिकाओं की भर्ती और संक्रमण के प्रसार की अनुमति देता है। एस के लिए zebrafish लार्वा मॉडल का उपयोग कर हमारा निष्कर्ष iniae संक्रमण zebrafish स्थानीयकृत जीवाणु संक्रमण में मेजबान न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज के भिन्न योगदान की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि संकेत मिलता है। इसके अलावा, हम प्रतिरक्षा कोशिकाओं के photolabeling संक्रमण के दौरान अलग-अलग मेजबान सेल भाग्य पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे का वर्णन।

Introduction

स्ट्रेप्टोकोकस iniae मछली और मनुष्यों 1 दोनों में प्रणालीगत रोग पैदा करने में सक्षम है कि एक प्रमुख जलीय रोगजनक है। एस जबकि iniae जलीय कृषि उद्योग में बड़े नुकसान के लिए जिम्मेदार है, यह भी अन्य स्ट्रेपटोकोकल मानव रोगज़नक़ों की वजह से उन लोगों के लिए इसी तरह की नैदानिक ​​विकृतियों के साथ प्रतिरक्षा अक्षमता मानव मेजबानों में रोग पैदा करने में सक्षम एक संभावित जूनोटिक रोगजनक है। मानव रोगज़नक़ों के साथ इसकी समानता को देखते हुए यह एस अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है एक प्राकृतिक मेजबान के संदर्भ में iniae रोग रोगजनन। एस के एक वयस्क zebrafish मॉडल iniae संक्रमण संक्रमण के स्थानीयकृत स्थल के रूप में अच्छी तरह से मौत की मेजबानी के लिए एक तेजी से समय के लिए मेजबान leukocytes के मजबूत घुसपैठ का पता चला, बहुत कम समय अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली 7 को शामिल करने के लिए। हासिल करने के लिए आदेश में एक में गहराई से एस के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर गौर vivo में संक्रमण iniae, यह n के लिए उत्तरदायी है कि एक मॉडल का उपयोग करने के लिए आवश्यक हैपर आक्रामक रहते इमेजिंग।

लार्वा zebrafish यह मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन के लिए एक तेजी से आकर्षक हड्डीवाला मॉडल बनाने कि लाभ का एक नंबर है। Zebrafish का उपयोग करें और स्तनधारी मॉडल की तुलना में बनाए रखने के लिए अपेक्षाकृत सस्ती और आसान कर रहे हैं। अनुकूली उन्मुक्ति 4-6 सप्ताह के बाद निषेचन तक कार्यात्मक रूप से परिपक्व नहीं है, लेकिन लार्वा phagocytosis और सांस फट 2-6 सहित रोगाणुरोधी क्षमताओं के साथ पूरक, टोल की तरह रिसेप्टर्स, साइटोकिन्स, और neutrophils और मैक्रोफेज के साथ एक उच्च संरक्षित कशेरुकी सहज प्रतिरक्षा प्रणाली है, 8-11। इसके अलावा, आनुवंशिक Tractability और विकास का भ्रूण और लार्वा चरणों के ऑप्टिकल पारदर्शिता के साथ fluorescently लेबल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए यह संभव विवो में वास्तविक समय में मेजबान रोगज़नक़ बातचीत की जांच के लिए बना स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों की पीढ़ी के लिए अनुमति देते हैं। ऐसे अड्डे के रूप में एक photoconvertible प्रोटीन का उपयोग कर इन ट्रांसजेनिक लाइनों की पीढ़ीdra2 संक्रमण 12 के पाठ्यक्रम पर व्यक्तिगत मेजबान सेल मूल और भाग्य की ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है।

एक zebrafish लार्वा संक्रमण मॉडल विकसित करते हैं, microinjection की चुना साइट एक संक्रमण शुरू में स्थानीय या प्रणालीगत है कि क्या यह निर्धारित होगा। दुम नस या कुवियर की वाहिनी में प्रणालीगत खून में संक्रमण आमतौर पर सबसे अधिक zebrafish में माइक्रोबियल रोगज़नक़ों अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया और रोगज़नक़ उपभेदों के बीच डाह में मेजबान और माइक्रोबियल कोशिकाओं, साइटोकाइन प्रतिक्रियाओं, और मतभेदों के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं। धीमी बढ़ रही सूक्ष्मजीवों के लिए, 16-1,000 सेल मंच पर एक भ्रूण की जर्दी थैली में जल्दी इंजेक्शन के बीच हो पाया एक धीमी गति से बढ़ रही है सूक्ष्मजीव के microinjection के लिए इष्टतम विकास मंच के साथ, एक प्रणालीगत संक्रमण 13,14 उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 16-128 सेल चरण 15। हालांकि, मेजबान विकास के बाद के चरणों में कई रोगाणुओं की थैली इंजेक्शन जर्दी टी के लिए घातक हो जाते हैंवह ल्यूकोसाइट्स 16-18 घुसपैठ की सूक्ष्म जीव और कमी के लिए पोषक तत्वों से भरपूर वातावरण के कारण मेजबान।

एक स्थानीय संक्रमण आमतौर पर आसानी से गैर इनवेसिव इमेजिंग के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है कि संक्रमण के स्थल की ओर leukocytes के निर्देशित प्रवास में यह परिणाम है। संक्रमण के इस प्रकार के ल्युकोसैट प्रवास के साथ ही विभिन्न ल्युकोसैट आबादी के विभिन्न प्रवासी और phagocytic क्षमताओं की जांच मध्यस्थता कि तंत्र का विच्छेदन के लिए अनुमति दे सकते हैं। जीवाणु उपभेदों के बीच डाह में मतभेद की जांच करने के साथ ही शारीरिक मेजबान बाधाओं प्रणालीगत बनने के लिए एक स्थानीय संक्रमण के लिए पार किया जाना चाहिए के बाद से सूक्ष्म जीव आक्रमण तंत्र के अध्ययन जब स्थानीयकृत संक्रमण भी उपयोगी होते हैं। Zebrafish आम तौर पर 25-31 डिग्री सेल्सियस 19 के तापमान पर उठाए गए हैं, लेकिन वे भी सख्त तापमान आवश्यकताओं के साथ कुछ मानव रोगज़नक़ों के invasiveness की पढ़ाई के लिए 34-35 डिग्री सेल्सियस के रूप में उच्च तापमान पर रखा जा सकता हैडाह 20, 21 के लिए।

कई अलग अलग साइटों hindbrain निलय 22 पृष्ठीय पूंछ पेशी 18, पेरिकार्डियल गुहा 23, और कान का पुटिका (कान) 5, 16, 24 सहित एक शुरू में स्थानीयकृत जीवाणु संक्रमण उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, यह ल्युकोसैट प्रतिक्रिया 13 की जांच परिणाम जब तिरछा कर सकते हैं, जो बैक्टीरिया के ऊतकों को नुकसान और सूजन स्वतंत्र पैदा कर सकता है पूंछ मांसपेशी में बैक्टीरिया की है कि इंजेक्शन पाया गया है। कम नुकसान hindbrain में इंजेक्शन के साथ जुड़ा हुआ है और यह युवा भ्रूण में leukocytes के शुरू में रहित है, हालांकि microglia ले निवास के रूप में, hindbrain निलय में तेजी से समय के साथ अधिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं लाभ है, यद्यपि। hindbrain निलय भी छवि के लिए एक और अधिक कठिन स्थान है। कान पुटिका vasculature के 25, 26 के लिए कोई सीधी पहुँच के साथ एक बंद खोखले गुहा है। यह लियू की सामान्य रूप से रहित हैkocytes, लेकिन ल्यूकोसाइट्स ऐसे संक्रमण के रूप में भड़काऊ उत्तेजनाओं के जवाब में कान का पुटिका के लिए भर्ती किया जा सकता है। यह इसलिए भी क्योंकि इमेजिंग की आसानी और इंजेक्शन के दृश्य के लिए zebrafish आयु वर्ग के 2-3 दिन बाद निषेचन (DPF) में जीवाणुओं की microinjection की एक पसंदीदा स्थल है। इसलिए, हम स्थानीयकृत जीवाणु संक्रमण के बारे में हमारी साइट के रूप में कान का पुटिका चुना है।

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Protocol

वयस्क और भ्रूण zebrafish विस्कॉन्सिन-मैडिसन रिसर्च पशु संसाधन केंद्र के विश्वविद्यालय के अनुसार बनाए रखा गया।

1. Microinjection सुइयों की तैयारी

  1. पुल 5, हवा समय के शुरू में, वेग 80, समय 70, हवा समय, हवा के दबाव 200, गर्मी 502 90 खींचने: निम्न सेटिंग्स के साथ एक micropipette खींचने डिवाइस का उपयोग पतली दीवार गिलास केशिका इंजेक्शन सुई (1.0 ओवर ड्राफ्ट / 0.75 आईडी) तैयार पुल 5 के अंत में।
  2. टिप खोलने लगभग 10 माइक्रोन की एक व्यास है कि इतना खींचा सुई की नोक से दूर तोड़ने, ठीक चिमटी का उपयोग करना।

2. की तैयारी लारवल इंजेक्शन व्यंजन

  1. बाँझ पानी में लगभग 4-5 मिमी के लेन चौड़ाई के साथ एक जेल कंघी कुल्ला और सूखी अनुमति देते हैं।
  2. समाधान स्पष्ट है जब तक E3 के माध्यम से 19 और माइक्रोवेव में एक 1.5-2% उच्च पिघल agarose समाधान तैयार करें। ठंडा होने के बाद, एक पेट्री डिश (100 x 15 मिमी) और चक्कर आने में agarose के कुछ डाल देना,अभी पर्याप्त agarose जोड़ने पूरी तरह से पकवान के नीचे कवर करने के लिए।
  3. Agarose परत जम जाने के बाद गैर-कंघी अंत सिर्फ पेट्री डिश के शीर्ष पर आराम कर रहा है और कंघी अंत agarose छू रहा है, इसलिए है कि शीर्ष पर rinsed और सूखे जेल कंघी जगह है। नीचे agarose परत के लिए सम्मान के साथ एक 30 डिग्री के कोण बनाने, कंघी के रूप में संभव के रूप में क्षैतिज है कि सुनिश्चित करें।
  4. ताजा agarose परत कंघी के कुओं को शामिल किया गया है, ताकि कंघी और नीचे agarose परत के बीच इंटरफेस में agarose की एक अतिरिक्त छोटी राशि डालो। कंघी को हटाने से पहले पूरी तरह से शांत करने के लिए अनुमति दें। एक pipet टिप का उपयोग करना, कुओं से agarose में से किसी के ऊपर टुकड़े को हटा दें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर इंजेक्शन मोल्ड और दुकान के शीर्ष पर E3 के माध्यम डालो।
  6. प्रत्येक का उपयोग करने से पहले, इंजेक्शन से पहले कम से कम एक घंटे के लिए 28.5 डिग्री सेल्सियस पर ताजा मध्यम और गर्म इंजेक्शन रैंप के साथ बदलें।
  7. तुरंत पहले इंजेक्शन के लिए, साथ इंजेक्शन रैंप पर E3 के की जगह200 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / एथिल 3-aminobenzoate (tricaine) युक्त E3 के माध्यम।

3. एस की तैयारी iniae inoculum

  1. 0.2% खमीर निकालने और 2% proteose peptone (तेरा + पी) के साथ पूरक टोड हेविट शोरबा मध्यम तैयार और आटोक्लेव: 30 जी / एल टोड हेविट, 2 जी / एल खमीर निकालने, 20 ग्राम / एल proteose peptone। अगर प्लेटों के लिए, 14 ग्राम / एल अगर जोड़ें।
  2. एक मोहरबंद 15 मिलीलीटर ट्यूब में तेरा + पी शोरबा के 10 एमएल में जमी बैक्टीरियल शेयर के 100 μl विभाज्य pipetting द्वारा संक्रमण से पहले बैक्टीरियल संस्कृतियों रात तैयार करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन के बिना रातोंरात सेते हैं। विकास के 14-16 घंटा के बाद, फ्रीजर शेयरों बनाने के लिए या इंजेक्शन में इस्तेमाल के लिए तैयार करने के लिए या तो रातोंरात संस्कृति का उपयोग करें।
  3. एक 1.7 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 80% ग्लिसरॉल के 500 μl में रातोंरात संस्कृति के 1 मिलीलीटर रखकर फ्रीजर शेयरों बनाओ। , फ्रीज पिघलना चक्र से बचने -80 डिग्री सेल्सियस पर इस मिश्रण और दुकान से 100 μl एक-उपयोग aliquots बनाने के लिए।
  4. एस के लिए iniae infecti में इस्तेमाल कियातुम्हारा + पी शोरबा के 9.9 मिलीलीटर के लिए रातोंरात संस्कृति के 0.1 मिलीलीटर जोड़कर 10 मिलीलीटर संस्कृति की कुल मात्रा के लिए 100: ऑन, रातोंरात संस्कृति एक पतला। लगभग 4-5 घंटे के लिए आंदोलन के बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें। एक Nanodrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर 600 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) की निगरानी और OD600 एनएम .250-.500 पहुंचता है जब मध्य लघुगणक चरण में बैक्टीरिया फसल। 0.250 के एक OD600 एनएम लगभग 10 8 कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) / मिलीलीटर से मेल खाती है।
  5. 5 मिनट के लिए 1500 XG पर एक 1.7 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में जीवाणु संस्कृति के 1 मिलीलीटर गोली। ताजा पीबीएस और दोहराने के 1 मिलीलीटर में resuspend। पीबीएस में बैक्टीरिया की OD600 एनएम उपाय, पीबीएस में गोली, और resuspend वांछित एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए।
  6. , Microinjection के दृश्य में सहायता 0.1% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए इंजेक्शन के लिए पहले बैक्टीरियल निलंबन के लिए लाल फिनोल जोड़ने के लिए।
  7. गर्मी मारे गए बैक्टीरिया के इंजेक्शन से जुड़े प्रयोगों के लिए, 30 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में बैक्टीरिया की गर्मी।गर्मी की हत्या प्रक्रिया ठोस तुम्हारा + पी अगर प्लेटों पर एक इंजेक्शन की मात्रा (लगभग 1 NL) चढ़ाना और 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात incubating द्वारा undetectable स्तर तक व्यवहार्य बैक्टीरिया की संख्या कम की पुष्टि करें।

4. लेबल एस एक CellTracker लाल फ्लोरोसेंट डाई के साथ Inia ई

  1. बैक्टीरिया जीवित कोशिकाओं को लेबल करने के लिए, एक CellTracker फ्लोरोसेंट रंजक या समकक्ष के एक शेयर के समाधान तैयार है। इस्तेमाल किया डाई पाउडर के 20 X 50 माइक्रोग्राम प्रति aliquots में आता है और DMSO में resuspended किए जाने की आवश्यकता के रूप में, एक 10 मिमी शेयर एकाग्रता प्राप्त करने के लिए ट्यूब के लिए μl DMSO के 7.3 जोड़ें।
  2. कोशिकाओं दाग है कि सबसे कम इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए बैक्टीरिया पर डाई सांद्रता (जैसे, 0.5-25 माइक्रोन) की एक सीमा का परीक्षण करें। तेजी से विभाजित कोशिकाओं और अब प्रयोगों डाई के एक उच्च एकाग्रता की आवश्यकता हो सकती है।
    1. (धारा 3) ऊपर वर्णित के रूप में centrifugation द्वारा एक 1.7 मिलीलीटर ट्यूब में जीवाणु संस्कृति के 1.0 मिलीलीटर गोली। एक में गोली Resuspendताजा पीबीएस एमएल और बैक्टीरियल संस्कृति के लिए डाई का उचित मात्रा में जोड़ें।
    2. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन के बिना सेते हैं। पूर्व गर्म तुम्हारा + पी शोरबा की एक मिलीलीटर में बैक्टीरिया और resuspend नीचे स्पिन और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए आंदोलन के बिना सेते हैं।
    3. बैक्टीरिया नीचे स्पिन और OD600 एनएम मापने और (धारा 3) ऊपर विस्तृत रूप microinjection के लिए बैक्टीरिया गिराए से पहले पीबीएस में दो बार धो लो। आम तौर पर हम ल्युकोसैट भर्ती और phagocytosis की हमारे अध्ययन के लिए एक nl इंजेक्शन की मात्रा में लगभग 100 CFU इंजेक्षन।

संक्रमण के लिए zebrafish लार्वा की 5. तैयारी

  1. रात से पहले प्रजनन जोड़े की स्थापना की और संक्रमित करने के लिए तैयार है जब तक 28.5 डिग्री सेल्सियस पर E3 के मध्यम में रोजेन एट अल। 27 सेते भ्रूण द्वारा वर्णित के रूप में भ्रूण लीजिए।
  2. Imaged किया जाएगा कि zebrafish के लिए, एन Phenylthiourea (पी टी यू) जोड़कर वर्णक (melanization) के विकास को रोकने0.2 एनएम के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 24 घंटे के बाद निषेचन (HPF) में E3 के माध्यम।
  3. भ्रूण से जुड़े संक्रमण के लिए मैन्युअल ठीक चिमटी की एक जोड़ी के साथ, dechorionate भ्रूण दो DPF आयु वर्ग के। वैकल्पिक रूप से, E3 के हटाने और के बारे में 5 मिनट के लिए या कोमल pipetting तक pronase (2 मिलीग्राम / एमएल) के साथ जगह से dechorionate भ्रूण जरायु से बाहर भ्रूण टूट जाता है। अधिकांश लार्वा 3 DPF द्वारा स्वाभाविक रूप से रची जाना चाहिए था।
  4. 200 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / tricaine युक्त E3 के माध्यम में dechorionated लार्वा रखकर पूर्व संक्रमण के लिए zebrafish कई मिनट anesthetize।

एस 6. कान पुटिका इंजेक्शन तीन दिन पुरानी लार्वा में iniae

  1. Microinjector पर मुड़ें और "मिलीसेकंड" करने के लिए समय सीमा निर्धारित किया है। लाइन में गैस जाने के लिए कार्बन डाइऑक्साइड टैंक पर वाल्व खुला। microinjector का दबाव लगभग 20 साई पढ़ना चाहिए। Incr के लिए काला Knurled घुंडी का दक्षिणावर्त मोड़ से microinjector इकाई में दबाव को समायोजितकमी आई दबाव के लिए मोड़ वामावर्त दबाव या ढील।
  2. तैयार एस भंवर फिनोल लाल और पीबीएस और एक microloader टिप उपयोग में iniae संस्कृति एक खींच केशिका इंजेक्शन सुई में संस्कृति के 2-3 μl लोड करने के लिए।
  3. सुई माइक्रोस्कोप के आधार करने के लिए सम्मान के साथ एक 45-65 डिग्री के कोण पर लगभग इतना है कि एक stereomicroscope के तहत एक चुंबकीय स्टैंड और स्थिति इससे जुड़े एक micromanipulator पर लोड सुई माउंट।
  4. Microinjector के पैर पेडल पर प्रेस सुई की नोक पर inoculum की एक बूंद बांटना। माइक्रोस्कोप के नेत्र लेंस में बड़े पैमाने पट्टी का उपयोग बूंद के व्यास उपाय।
    1. वैकल्पिक रूप से, एक पैमाने पर पट्टी के साथ एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर खनिज तेल की एक बूंद में एक मात्रा इंजेक्शन द्वारा ड्रॉप के व्यास का अनुमान है। बूंद का व्यास एक एक nl मात्रा के बारे में है जो लगभग 0.10 मिमी, होना चाहिए।
    2. पर स्थापित करने की अवधि का समायोजन करके बूंद आकार को समायोजित करेंmicroinjector या ठीक चिमटी के साथ सुई की नोक के अधिक से कतरन से। बहुत ज्यादा ऊतकों को नुकसान के कारण से बचने के लिए 35 मिसे - इंजेक्शन समय 20 के बीच होना चाहिए ध्यान दें।
  5. एक प्लास्टिक हस्तांतरण pipet का प्रयोग, स्थानांतरण 12 इंजेक्शन मोल्ड के प्रत्येक कुएं में लार्वा anesthetized।
  6. अच्छी तरह के बाईं ओर के खिलाफ हैं सिर माइक्रोस्कोप और जर्दी थैलियों के पीछे की ओर इशारा कर रहे हैं कि इतने धीरे लार्वा की स्थिति के लिए एक गिलास छड़ी, बाल पाश, या प्लास्टिक की टिप का उपयोग करें। छत की ओर लार्वा ऊपर के बाएं कान प्वाइंट।
  7. Stereomicroscope के नेत्र लेंस के माध्यम से देख रहे हैं, दोनों को देखने के लिए एक ही क्षेत्र में हैं तो यह है कि कान का पुटिका के साथ भरी हुई सुई अप लाइन के लिए micromanipulator पर knobs के उपयोग करें। पियर्स सुई टिप के साथ कान पुटिका के बाहरी उपकला परत इतनी है कि सुई टिप बस पुटिका के अंदर है।
  8. पैर पेडल पर प्रेस एस के वांछित खुराक की एक nl इंजेक्षन iniae। एक का उपयोग सुनिश्चित करेंकाफी कम दबाव गुहा टूटना करने के लिए नहीं जा सके। इंजेक्शन सफल होता है, कान का पुटिका, लेकिन नहीं आसपास के ऊतक, फिनोल लाल inoculum (चित्रा 1 ऐ) से भरना चाहिए। तुरंत इंजेक्शन थाली से किसी भी गलत इंजेक्शन मछली को हटा दें।
  9. ध्यान से लार्वा से बाहर सुई वापस लेना और अगले लार्वा ध्यान में रखते हुए इतना है कि हाथ से इंजेक्शन थाली चाल है। 5X बढ़ाई के तहत यह मत करो।
    नोट: सुई का त्याग अस्तित्व और ल्युकोसैट भर्ती परिणाम तिरछा हो सकता है, जो कान पुटिका के बाहर कुछ बैक्टीरिया के बयान में हो सकता है। इससे बचने के लिए, यह फ्लोरोसेंट रंजक लेबल बैक्टीरिया इंजेक्षन और नेत्रहीन इस हुआ है, जहां किसी भी लार्वा को हटाने के लिए एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे इंजेक्शन लार्वा को स्कैन करने की सिफारिश की है। एक सही ढंग से इंजेक्शन के लार्वा (चित्रा 1 बीआई) में दिखाया गया है।
  10. इंजेक्शन की मात्रा / inoculum के प्रयोग के पाठ्यक्रम पर ही रहता है यह सुनिश्चित करने के लिए, जीवाणु की एक बूंद इंजेक्षनहर 48 वें भ्रूण के बाद बाँझ पीबीएस के 100 μl युक्त एक 1.7 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में uspension। इंजेक्शन की मात्रा में CFU निर्धारित करने के लिए रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस में तेरे + पी अगर प्लेटों पर 100 μl थाली।
  11. इंजेक्शन रैंप पर 12 लार्वा के पूरे समूह इंजेक्ट किया गया है, ध्यान से कुओं से लार्वा को हटाने और एक नया पेट्री डिश (35 x 10 मिमी 2) में उन्हें जगह करने के लिए एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग करें। Tricaine समाधान निकालें और लार्वा ठीक करने के लिए अनुमति देने के लिए लगभग 2 मिलीलीटर ताजा E3 के माध्यम से के साथ बदलें।
  12. Pipet एक 96 अच्छी तरह से थाली के एकल कुओं में लार्वा इंजेक्शन और 28.5 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। इन प्लेटों में अस्तित्व के लिए समय के साथ लार्वा मॉनिटर या इमेजिंग या CFU गिनती के लिए बाद में हटा दें।

न्यूट्रोफिल 7. सूडान काले धुंधला

नोट: निम्न चरणों का ओ.टी. जब तक एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर एक छोटा सा पेट्री डिश (35 x 10 मिमी 2) में कमरे के तापमान पर किया जा सकता हैherwise कहा गया है। प्रत्येक चरण के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मक की राशि पूरी तरह से लार्वा को कवर करने के लिए अभी पर्याप्त तरल पदार्थ का उपयोग पकवान प्रति 2 मिलीलीटर, लगभग है।

  1. संक्रमित लार्वा के निर्धारण के लिए, E3 के मध्यम हटाने और पीबीएस समाधान में एक ठंडा 4% paraformaldehyde के साथ बदलने के लिए एक गिलास पाश्चर विंदुक का उपयोग करें। इसके तत्काल बाद euthanize के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मछली जगह है। 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात ठीक करें।
  2. 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस में तीन बार धोएं।
  3. 5 घंटा 30 मिनट के लिए: सूडान ब्लैक के साथ दाग (70% इथेनॉल, 0.1% फिनोल में 5 0.18% शेयर एक पतला)। न्युट्रोफिल कणिकाओं दाग ले लिया है अगर जाँच करने के लिए एक stereomicroscope का प्रयोग करें।
  4. पीबीएस में एक अंतिम धोने के द्वारा पीछा 70% इथेनॉल और पीबीएस के 1 के अनुपात, एक 1: की एक भी धोने के द्वारा पीछा 70% इथेनॉल में एक भी धोने की शुरुआत के साथ 5 मिनट washes की एक श्रृंखला प्रदर्शन।
  5. पीबीएस प्लस 0.1% बीच (पीबीटी) में rehydrate।
  6. लार्वा से वर्णक को खाली करने के बारे में 6-10 मिनट के लिए 1% पोटेशियम हाइड्रोक्साइड / 1% हाइड्रोजन पेरोक्साइड में धो लें। नमूना मिलकर मॉनिटरY और के बारे में 5 मिनट के बाद, मंजूरी दे दी है कितना वर्णक के देखने के लिए एक stereomicroscope के तहत लार्वा की जाँच करें। समाधान भी लंबे समय पर छोड़ दिया जाता है, तो जर्दी थैलियों फूल और फट जाएगा।
  7. पीबीएस में 5 मिनट के लिए तीन बार प्रत्येक धो लें।
  8. छवि के लिए तैयार है जब तक अप करने के लिए एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस या पीबीटी दोनों में नमूनों की दुकान और गिनती।
  9. छवि सूडान काले दाग लार्वा करने के लिए, पीबीटी में मछली हस्तांतरण और फिर 80% ग्लिसरॉल में और एक एकल गुहा अवसाद स्लाइड पर जगह है। स्थिति एक विंदुक टिप का उपयोग कर एक stereomicroscope के तहत लार्वा तय की। एक stereomicroscope पर (चित्रा 1 AII-IV) एक रंग डिजिटल कैमरे का उपयोग कर छवि।

संक्रमित लार्वा से व्यवहार्य जीवाणुओं की 8. गणन

  1. वांछित टाइम्स E3 के मध्यम में tricaine की एक ठंडा 200-300 मिलीग्राम / एल समाधान में संक्रमण पद पर लार्वा euthanize।
  2. Pipet 1.7 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में लार्वा euthanized। Tricaine समाधान निकालें और 0.2% की 100 μl के साथ की जगहपीबीएस में ट्राइटन X-100 (PBSTx)।
  3. एक 27 जी सुई के माध्यम से ऊपर और नीचे में 10 बार से गुजर रहा लार्वा homogenize।
  4. बाँझ पीबीएस में homogenates के धारावाहिक dilutions तैयार करें। उदाहरण के लिए, संक्रामक खुराक 100 CFU, pipet का 900 μl बाँझ पीबीएस में homogenate के 100 μl है। एक नए pipet टिप का उपयोग करना, 900 μl बाँझ पीबीएस में पतला homogenate के 100 μl हस्तांतरण।
  5. प्लेट 100 ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया के चुनिंदा अलगाव के लिए कोलंबिया सीएनए अगर पर dilutions की μl, और 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। यह मध्यम दोनों ग्राम नकारात्मक और ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया की वृद्धि का समर्थन करेंगे जो तुम्हारा + पी अगर प्लेटें, की तुलना में अधिक से अधिक चयन प्रदान करेगा।
  6. कम से कम 500 व्यक्ति कालोनियों के साथ प्लेटों पर, कालोनियों की संख्या गिनने और CFU की संख्या निर्धारित करने के लिए कमजोर पड़ने कारक से गुणा कर दें।

इमेजिंग के लिए लार्वा की 9. फिक्सेशन

  1. डे के रूप में पीबीएस समाधान में एक ठंडा 4% paraformaldehyde में लार्वा फिक्सधारा 7 में मानते।
  2. कमरे के तापमान पर, इमेजिंग से पहले पीबीएस में 5 मिनट के लिए तीन बार प्रत्येक धो लें।

लाइव इमेजिंग के लिए लार्वा के 10 तैयारी

  1. समाधान स्पष्ट है जब तक माइक्रोवेव में हीटिंग द्वारा E3 में 1.5% कम पिघलने बिंदु agarose समाधान तैयार है।
  2. यह अच्छा है, लेकिन कठोर नहीं जाने के लिए एक 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में agarose समाधान रखें।
  3. 0.016% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए agarose के लिए tricaine जोड़ें।
  4. एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग करना, एक stereomicroscope के मंच पर एक गिलास नीचे पकवान में 4-5 anesthetized लार्वा जगह है।
  5. 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान से tricaine और agarose समाधान निकालें और 1-2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शांत इसे जाने। Agarose ठंडा किया जाता है, के रूप में संभव संवेदनाहृत लार्वा से ज्यादा के रूप में तरल हटा दें।
  6. सतह के बारे में आधे से कवर किया जाता है जब तक डिश में agarose ठंडा डालो। Agarose प्रसार करने के लिए पकवान भंवर। ध्यान दें कि agarose अगरबहुत गर्म है, यह लार्वा को मार देंगे। बहुत ज्यादा agarose पकवान में जोड़ा जाता है अगर agarose के माध्यम से ध्यान केंद्रित इसके अलावा, जब माइक्रोस्कोप के उद्देश्य लेंस पकवान के नीचे हिट हो सकती है।
  7. एक हस्तांतरण पिपेट का प्रयोग, पकवान के पक्षों के लिए मंगाई है कि लार्वा उठाओ और वापस केंद्र में उन्हें pipet।
  8. एक बाल पाश, एक लंबे विंदुक टिप या एक गिलास छड़ी के साथ के रूप में वांछित stereomicroscope के तहत, धीरे लार्वा की स्थिति। छोड़ कान पुटिका डिश के तल के खिलाफ फ्लैट इतना है कि कान का पुटिका की इमेजिंग के लिए, लार्वा की स्थिति।
  9. पकवान जाने से पहले के बारे में 10 मिनट के लिए agarose शांत करते हैं। agarose ठोस नहीं है अगर लार्वा पदों पर बदलाव कर सकते हैं। धीरे नम रखने के लिए यह agarose परत के ऊपर से कुछ tricaine और E3 समाधान pipet।

संक्रमण के 11 confocal इमेजिंग

  1. एक फंड वैल्यू-1000 लेजर स्कैनिंग confoca के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर लार्वा के साथ गिलास नीचे पकवान प्लेसएल प्रणाली।
  2. 200-300 माइक्रोन के लिए पिनहोल सेट और एक संख्यात्मक एपर्चर 3-6 माइक्रोन स्लाइस के साथ जेड ढेर सेट 0.75 / 20X उद्देश्य लेंस का उपयोग करते हुए।
  3. प्रत्येक चैनल के लिए लेजर शक्ति और डिटेक्टर लाभ को समायोजित करने के लिए सतत लाइन स्कैनिंग का प्रयोग करें।
  4. प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल के लिए अनुक्रमिक लाइन स्कैनिंग का प्रयोग (जैसे, 488 और 543 एनएम) और अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी), न्यूट्रोफिल द्वारा प्रारंभिक भर्ती और phagocytosis निरीक्षण करने के लिए 2-6 घंटे के लिए छोड़ दिया कान पुटिका की एक समय व्यतीत फिल्म हर 3 मिनट का संचालन और मैक्रोफेज। लंबे समय के पाठ्यक्रमों के लिए, agarose के बाहर वाष्पीकरण और सुखाने को रोकने के लिए पेट्री डिश पर एक ढक्कन जगह है।
  5. 20X या 40X बढ़ाई (चित्रा 2) लार्वा अभी भी तय (चित्रा 1 बी) प्राप्त चित्रों या रहते हैं।

कान पुटिका में Dendra2 लेबल leukocytes की 12. photoconversion

नोट: Dendra2 लाल प्रतिदीप्ति को हरे रंग से photoconverted किया जा सकता हैएक मिनट के लिए ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र पर एक 405 एनएम लेजर (50-70% लेजर शक्ति के लिए पर्याप्त होना चाहिए) ध्यान केंद्रित करके। नीचे FV-1000 लेजर स्कैनिंग confocal प्रणाली के लिए इस्तेमाल कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल है:

  1. 488 एनएम और 543 एनएम लेज़रों के साथ एक z ढेर स्कैन का उपयोग नमूना कल्पना। लेजर शक्ति और डिटेक्टर लाभ को समायोजित करने के लिए सतत लाइन स्कैनिंग का प्रयोग करें। कोई गलती photoconverted लाल प्रतिदीप्ति सुनिश्चित करें कि वहाँ की जाँच करें।
  2. "छवि अधिग्रहण नियंत्रण" खिड़की पर, "प्रोत्साहन सेटिंग" के तहत "का प्रयोग करें स्कैनर" उपकरण का चयन करें और "मुख्य" का चयन करें। 405 एनएम लेजर का चयन करें और 70% बिजली में यह निर्धारित किया है। वृत्त विकल्प का उपयोग करना, कान का पुटिका में आरओआई परिभाषित करते हैं।
  3. "उत्तेजना को प्रारंभ करें स्थापना" के तहत एक फ्रेम के एक preactivation और 60,000 मिसे के एक सक्रियण समय के साथ "श्रृंखला में सक्रियण" का चयन करें। "शीर्षक से समय स्कैन" के तहत "अधिग्रहण सेटिंग" खिड़की पर, में दो का चयन00:01:00 (पूर्व के लिए एक और एक के बाद photoconversion के लिए) की tervals।
    नोट: समय व्यतीत श्रृंखला स्कैन पूरा हो गया है के बाद, Dendra2 अपनी लाल फ्लोरोसेंट राज्य के लिए photoconverted किया जाना चाहिए था।
  4. Photoconverted लाल प्रतिदीप्ति के साथ ही किसी भी शेष हरी प्रतिदीप्ति (चित्रा 3) कल्पना करने के लिए 488 एनएम और 543 एनएम लेसरों का उपयोग एक z ढेर से नमूना स्कैन करें।

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Representative Results

एस के microinjection शुरू में एक स्थानीयकृत मेजबान जवाब में कान का पुटिका में iniae (चित्रा 1 और चित्रा 2) का परिणाम है। सही ढंग से जब इंजेक्शन, बैक्टीरिया केवल कान पुटिका में नहीं है और आसपास के ऊतकों या रक्त में देखा जाना चाहिए। इस फिनोल लाल रंग (चित्रा 1 ए) का उपयोग microinjection के दौरान देखे जा सकते हैं। लेबल वाले बैक्टीरिया इंजेक्ट कर रहे हैं अगर वैकल्पिक रूप से, संक्रमित लार्वा की एक त्वरित स्कैन तुरंत बैक्टीरिया केवल कान पुटिका में नहीं है और आसपास के ऊतकों (चित्रा 1 बी) कर रहे हैं इस बात की पुष्टि कर सकते हैं इंजेक्शन के बाद। हालांकि 10 CFU के जंगली प्रकार एस के रूप में कम एक खुराक iniae 24-48 घंटा के बाद संक्रमण (HPI), एक avirulent तनाव, cpsA की 1000 CFU के इंजेक्शन के भीतर एक घातक संक्रमण स्थापित करने में सक्षम है, घातक संक्रमण में परिणाम और उस तनाव मेजबान 24 में पैदा करने में असमर्थ लगता नहीं है। इस प्रकार, इस स्थानीयकृत संक्रमण मॉडल differentiat करने में सक्षम हैबदल डाह के जीवाणु उपभेदों के बीच ई।

शुरू में स्थानीयकृत संक्रमण के microinjection साइटों ल्युकोसैट कीमोटैक्सिस के अध्ययन के लिए उपयोगी होते हैं। ल्युकोसैट भर्ती न्युट्रोफिल कणिकाओं के सूडान काले धुंधला (चित्रा 1 ए) या ​​फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक लाइनों (चित्रा 1 बी) के formaldehyde के निर्धारण या तो द्वारा मात्रा से कर सकते हैं। भर्ती और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के phagocytic क्षमताओं कल्पना करने के लिए, हम विशेष रूप से मैक्रोफेज में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन Dendra2 व्यक्त ट्रांसजेनिक लाइनों का इस्तेमाल किया टीजी (MPEG1: dendra2) 24 या न्यूट्रोफिल टीजी (MPX: dendra2) 12। जब एस iniae 3 DPF लार्वा के कान पुटिका में इंजेक्ट किया जाता है, दोनों न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज तेजी से पहले दो HPI (चित्रा 1) के भीतर भर्ती हैं। सही ढंग से प्रदर्शन हालांकि, जब कान पुटिका में पीबीएस के microinjection (मेजबान leukocytes के एक ही मजबूत भर्ती में परिणाम नहीं करता एस iniae न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज (चित्रा 2) दोनों के अंदर पाया जा सकता है। न्यूट्रोफिल या मैक्रोफेज लेबल करने के लिए photoconvertible प्रोटीन Dendra2 का प्रयोग संक्रमण के पाठ्यक्रम पर अलग-अलग सेल भाग्य पर नज़र रखने के लिए गैर इनवेसिव photolabeling के लिए अनुमति देता है। 5 HPI पर कान पुटिका के लिए भर्ती किया गया है कि मैक्रोफेज photoconverted और उसके बाद निम्न 24 घंटा से अधिक ट्रैक किए गए थे। कुछ photoconverted कोशिकाओं कान पुटिका या सिर क्षेत्र में रहते हैं, कुछ भी लार्वा के पूरे शरीर में फैलाया (चित्रा 3) पाया जा सकता है।

चित्र 1
एस के साथ कान पुटिका संक्रमण के ल्युकोसैट भर्ती iniae। (ए) एस के लिए न्युट्रोफिल भर्ती iniae संक्रमण। (I) के कान पुटिका में एक फिनोल लाल लेबल inoculum के सफल इंजेक्शन। (द्वितीय - चतुर्थ) 2 HPI पर न्युट्रोफिल भर्ती की जांच के लिए लार्वा की सूडान काले धुंधला। या तो जंगली प्रकार एस के साथ संक्रमण जबकि कान का पुटिका (द्वितीय) के लिए neutrophils के पीबीएस नकली संक्रमित लार्वा शो थोड़ा भर्ती iniae या मजबूत न्युट्रोफिल भर्ती में cpsA उत्परिवर्ती परिणाम (तृतीय, चतुर्थ)। स्केल बार, 300 माइक्रोन। (बी) एस के लिए बृहतभक्षककोशिका भर्ती iniae संक्रमण। (मैं) लाल लेबल वाले एस के सफल microinjection कान का पुटिका में iniae (मैजंटा में दिखाया गया)। (द्वितीय - चतुर्थ) microinjected ट्रांसजेनिक सांसद के फ्लोरोसेंट confocal छवियोंeg1: dendra2 लार्वा दो HPI पर तय की। CellTracker रेड लेबल (मैजंटा में चित्रित) जंगली प्रकार एस से संक्रमित पीबीएस नकली संक्रमित लार्वा शो थोड़ा बृहतभक्षककोशिका भर्ती (द्वितीय), लेकिन लार्वा iniae या दो HPI पर कान पुटिका को cpsA उत्परिवर्ती शो मजबूत बृहतभक्षककोशिका भर्ती (तृतीय, चतुर्थ)। स्केल बार, 30 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: एस के phagocytosis कान पुटिका में phagocytes द्वारा iniae ट्रांसजेनिक MPX:। dendra2 (ए) या ​​MPEG1: dendra2 (बी) के लार्वा लाल लेबल वाले एस से संक्रमित iniae (मैजंटा में दिखाया गया है) और एक लेजर scann का उपयोग कर 60 मिनट के बाद संक्रमण पर imagedconfocal खुर्दबीन आईएनजी। स्केल बार, 30 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: एस के साथ कान पुटिका 5 HPI पर मैक्रोफेज की photoconversion iniae। सर्किल (ए) द्वारा नामित कान पुटिका में (हरे रंग में दिखाया गया) मैक्रोफेज, एक confocal खुर्दबीन पर एक 405 एनएम लेजर का उपयोग (बी) photoconverted और समय के साथ ट्रैक किए गए थे। 24 HPI करके, (मैजंटा में चित्रित) के रूप में अब तक ट्रंक / दुम hematopoietic ऊतक (सी) के रूप में चले गए मैक्रोफेज photoconverted; पैमाने बार, 50 माइक्रोन। सी में बॉक्सिंग क्षेत्रों के उच्च magnifications (i) और (द्वितीय), पैमाने बार 30 माइक्रोन में दिखाए जाते हैं; तीर photocon को इंगितverted मैक्रोफेज। Photoconverted कोशिकाओं क्योंकि 488 एनएम हरी प्रतिदीप्ति शेष मर्ज किए गए 543 एनएम लाल प्रतिदीप्ति और किसी का सफेद दिखाई देते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां इस्तेमाल किया संक्रमण विधि 2-3 DPF भ्रूण और लार्वा में एक शुरू में स्थानीयकृत संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए उपयोगी है। ऐसे कान पुटिका के रूप में एक बंद गुहा में इस तरह के संक्रमण के रूप में एक भड़काऊ प्रोत्साहन, का ध्यान केंद्रित न्युट्रोफिल और बृहतभक्षककोशिका कीमोटैक्सिस और phagocytosis के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। कान का पुटिका में बैक्टीरिया इंजेक्शन लगाने की एक चेतावनी neutrophils की क्षमता कुशलता से तरल पदार्थ से भरे cavities में phagocytose बैक्टीरिया विशेष सूक्ष्म जीव पर निर्भर हो सकता है के लिए है। Escherichia कोलाई और बेसिलस subtilis आसानी से कान का पुटिका 28 में न्यूट्रोफिल द्वारा phagocytosed नहीं कर रहे हैं, हम न्यूट्रोफिल Pseudomonas aeruginosa और एस दोनों phagocytose करने में सक्षम हो पाया है इस स्थान को 16, 24 में iniae। विभिन्न रोगजनकों के invasiveness का अध्ययन करते स्थानीयकृत संक्रमण भी उपयोगी है। एक प्रणालीगत संक्रमण के बाद मैं पैदा करने के लिए आदेश मेंएक बंद गुहा में njection ऐसे कान पुटिका के रूप में, सूक्ष्म जीव भौतिक मेजबान बाधाओं को पार करने के लिए सक्षम होना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, विभिन्न रोगजनकों संक्रमण के प्रारंभिक साइट से परिवहन और प्रसार के लिए मेजबान कोशिकाओं पर भरोसा कर सकते हैं। यह बदल डाह के तनाव की तुलना के लिए उपयोगी स्थानीय इंजेक्शन बनाता है।

Microinjection के दौरान, व्यवस्थित और प्रत्येक शर्त के बाद या के बारे में 50 लार्वा के बाद या तो सुई, परिवर्तन सुइयों clogging बैक्टीरिया से बचने के लिए। यह सुई में निलंबन और अधिक समान है सुनिश्चित करने में मदद करेगा। सुई में बैक्टीरिया के निपटाने के लिए एक समरूप निलंबन रखने में मदद कर सकता है एक समस्या है, पीबीएस का मिश्रण, 2% PVP40, और 10% ग्लिसरॉल होने लगता है। प्रत्येक लार्वा बैक्टीरिया का लगभग एक ही नंबर के साथ इंजेक्शन जा रहा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए तुरंत एक लार्वा homogenizing इंजेक्शन के बाद और सीएनए अगर पर homogenate चढ़ाना द्वारा CFU मायने रखता है की जाँच करें। सीएनए अगर न केवल कृषि ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया के विकास के लिए चुन लिए जाएँगेएस iniae, लेकिन यह इंजेक्शन खुराक प्रत्येक व्यक्ति के लार्वा के बीच कर रहे हैं कि कैसे संगत की एक विचार प्रदान करेगा। लार्वा प्रति 100 CFU का लक्ष्य inoculum के साथ, एक CNA प्लेट पर आम तौर पर 75-150 के बीच कालोनियों कर रहे हैं। गैर एस की संख्या सबसे पीबीएस इंजेक्ट मछली आमतौर पर 0-20 कालोनियों के बीच में परिणाम के बाद से एक CNA थाली पर बढ़ iniae ग्राम पॉजिटिव कालोनियों, शायद बहुत कम है। एक ही संक्रामक खुराक से संक्रमित लार्वा के बीच कॉलोनी की गिनती में आधे से एक प्रवेश करने के लिए ऊपर की भिन्नता होने के लिए संक्रमण के दौरान बाद में समय बिंदुओं पर, यह असामान्य नहीं है। इस संक्रमण को नियंत्रित करने की क्षमता में व्यक्तिगत लार्वा के बीच मामूली मतभेद का प्रतिनिधित्व कर सकता है या लार्वा या E3 माध्यम में कृषि ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया की मात्रा में अंतर को प्रतिबिंबित कर सके।

कान पुटिका में इंजेक्शन लगाने हैं, परंतु इस गुहा टूटना करने के लिए कारण हो सकता है के रूप में भी बड़े एक मात्रा या भी एक उच्च दबाव के साथ इंजेक्षन करने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है। इंजेक्शन संस्करणों थानेदारलगभग 1 nl के लिए रखा जाना uld। सुई बहुत बड़ा है, तो microinjection के संक्रमण की साइट के लिए मेजबान leukocytes की भर्ती को प्रभावित कर सकता है या बैक्टीरिया कान पुटिका के बाहर रिसाव की अनुमति दे सकता है, जो आसपास के ऊतकों को नुकसान हो सकता है। यह सही अंतरिक्ष में इंजेक्शन पुष्टि करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। सुई भी गहरी डाला जाता है, तो यह कान पुटिका के माध्यम से प्रहार कर सकते हैं या इसे कान पुटिका के आसपास बह रही रक्त वाहिकाओं हिट हो सकती है। यह मेजबान प्रतिक्रियाओं को बदल सकता है, जो रक्त प्रवाह में या पुटिका बाहर बैक्टीरिया का बयान, हो सकता है।

यह सुई निकाला जाता है जब Colucci-Guyon एट अल। 28 से दिखाया गया है, कुछ बैक्टीरिया गलती से कान का पुटिका के बाहर जमा किया जा सकता है कि यह भी संभव है, लेकिन हम केवल इंजेक्शन के 5% से कम में मामला होने के लिए इस पाते हैं। कान पुटिका के केंद्र में इंजेक्षन करने के लिए कोशिश कर रहा है कि इस स्थिति से बचने में मदद कर सकते हैं। एक सफल संक्रमण में, कान का पुटिका डब्ल्यू भरने चाहिएफिनोल लाल रंग के ith, लेकिन डाई आसपास के ऊतकों में बाहर लीक नहीं होना चाहिए। किसी भी गलत इंजेक्शन के लार्वा को तुरंत खारिज किया जाना चाहिए। लेबल वाले बैक्टीरिया इंजेक्शन लगाने के एक सफल इंजेक्शन (चित्रा 1 बी) की पुष्टि के लिए एक उपयोगी तरीका है। एक CellTracker डाई का उपयोग करने का नुकसान में से एक बैक्टीरिया अंततः प्रतिदीप्ति के तहत कल्पना किया जा रहा से बैक्टीरिया को रोकने, विभाजित के रूप में इस डाई पतला हो जाएगा कि है। हम हरी लेबल न्युट्रोफिल और हमारे अध्ययन के बहुमत के लिए बृहतभक्षककोशिका ट्रांसजेनिक लाइनों का इस्तेमाल किया है क्योंकि हम एक लाल रंग चुना है।

Dendra2 octocoral Dendronephthya सपा से ली गई एक photoconvertible प्रोटीन होता है। जो एक 405 एनएम लेजर 29 के साथ एक लाल फ्लोरोसेंट राज्य के लिए एक हरे रंग से photoconverted जा सकता है। यह photoconversion कोशिकाओं के निशान और संक्रमण के पाठ्यक्रम पर अपने भाग्य को ट्रैक करने के लिए एक noninvasive तरीका है। संक्रमण की साइट के लिए भर्ती leukocytes photoconverted और अपने फैसले पर नजर रखने के लिए समय के साथ पीछा किया जा सकतामेजबान ऊतकों भर issemination (चित्रा 3)। वैकल्पिक रूप से, ल्यूकोसाइट्स पूर्व संक्रमण को photoconverted और फिर संक्रमण की साइट के लिए भर्ती की कोशिकाओं के मूल निर्धारित करने के बाद microinjection पर नजर रखी जा सकती है। लेबल बैक्टीरिया और प्रतिरक्षा कोशिकाओं भर्ती और phagocytosis (चित्रा 1 बी और चित्रा 2) सहित vivo में ल्युकोसैट रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। लाल लेबल एस भेद एक photoconverted ल्युकोसैट के लाल प्रतिदीप्ति से iniae मुश्किल है, इसलिए एक अलग फ्लोरोसेंट CellTracker डाई का इस्तेमाल किया जा सकता है। यह एस होते कान पुटिका छोड़ photoconverted प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए निर्धारित है जो विशेष रूप से उपयोगी होगा iniae।

कान पुटिका संक्रमण विधि का भविष्य अनुप्रयोगों न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज विभिन्न संक्रमण के जवाब में ले जाते हैं जिसके द्वारा गति और दिशात्मकता मापने शामिल हो सकते हैं। संक्रमण कश्मीरinetics भी प्रकार की कोशिकाओं के सबसे मजबूती के साथ कोशिकाओं को उत्पन्न जहां या वे 30 का प्रसार करने के लिए जहां अलावा भर्ती कर रहे हैं एक संक्रमण की साइट और जो करने के लिए आने से पहले जो कर रहे हैं प्रकार की कोशिकाओं को देखने के लिए अध्ययन किया जा सकता है। शुरू में एक स्थानीयकृत संक्रमण के लिए भर्ती का अध्ययन करने के अलावा, इस संक्रमण मॉडल आरंभिक संक्रमण के दौरान मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली घटकों के समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। विशिष्ट RNAs कि लक्ष्य antisense morpholino oligonucleotides के टोल की तरह रिसेप्टर्स, साइटोकाइन रिसेप्टर्स और ल्यूकोसाइट्स, और सहित मेजबान प्रतिरक्षा घटकों की अभिव्यक्ति नीचे दस्तक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता CRISPR कैस या talen प्रौद्योगिकी आनुवंशिक म्यूटेंट बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जीन अभिव्यक्ति RNAseq का उपयोग कर या qPCR भी संक्रमण के जवाब में कुछ मेजबान जीनों की अभिव्यक्ति को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Acknowledgments

लेखकों zebrafish देखभाल और रखरखाव के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, ईए Harvie करने के लिए राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा पुरस्कार A155397 और अन्ना Huttenlocher एनआईएच R01GM074827 द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 ml Eppendorfs MidSci AVSS1700
14 ml Falcon tube BD Falcon 352059
27 G x ½ in. needle BD Biosciences 305109
96-well Plate Corning Incorporated 3596
Agar BD Biosciences 214030
CellTracker Red Molecular Probes, Invitrogen C34552
CNA agar Dot Scientific, Inc 7126A
Disposable transfer pipets Fisher Scientific 13-711-7m
Dissecting scope Nikon SMZ745
DMSO Sigma Aldrich D2650
Ethanol 200 proof MDS 2292
Fine tweezers Fine Science Tools 11251-20
Gel comb VWR 27372-482 4.2 mm width, 1.5 mm thick
Glass bottom dishes Custom made by drilling a 16 - 18 mm hole in the center of a 35 mm tissue culture dish bottom and placing a 22 mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light.
Glycerol Fisher Scientific G33-4
High melt agarose Denville Scientific, Inc. CA3510-6
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H325
Laser scanning confocal microscope Olympus with FV-1000 system
Low melt agarose Fisher BP165-25
Magnetic stand Tritech (Narishige) GJ-1
Microinjection system Parker Picospritzer III
Microloader pipet tips Eppendorf 930001007
Micromanipulator Tritech (Narishige) M-152
Micropipette puller Sutter Instrument Company Flaming/Brown P-97
Nanodrop spectrophotmeter Thermo Scientific ND-1000
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma Aldrich P7629
Paraformaldheyde Electron Microscopy Sciences 15710
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 100 x 15 mm
Phenol Sigma Aldrich P-4557
Phenol Red Ricca Chemoical Company 572516
Phosphate buffered saline Fisher Scientific BP665-1
Potassium hydroxide Sigma Aldrich P-6310
Pronase Roche 165921
Protease peptone Fluka Biochemika 29185
Small cell culture dish Corning Incorporated 430165 35 x 10 mm
Sudan Black Sigma Aldrich S2380
Thin wall glass capillary injection needles World Precision Instruments, Inc. TW100-3
Todd Hewitt Sigma Aldrich/Fluka Analytical T1438
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) Argent Chemical Laboratory/Finquel C-FINQ-UE-100G
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Yeast extract Fluka Biochemika 92144

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इम्यूनोलॉजी अंक 98 इम्यूनोलॉजी संक्रमण सहज प्रतिरक्षा zebrafish लार्वा, न्यूट्रोफिल मैक्रोफेज, Microinjection confocal इमेजिंग photoconversion
की एक zebrafish लारवल मॉडल में सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के गैर इनवेसिव इमेजिंग<em&gt; स्ट्रेप्टोकोकस iniae</em&gt; संक्रमण
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Harvie, E. A., Huttenlocher, A.… More

Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection. J. Vis. Exp. (98), e52788, doi:10.3791/52788 (2015).

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