Abstract
O patógeno aquático, Streptococcus iniae, é responsável por mais de 100 milhões de dólares em perdas anuais para a indústria da aquicultura e é capaz de causar doença sistêmica em ambos os peixes e seres humanos. Uma melhor compreensão da S. iniae patogênese da doença requer um sistema modelo adequado. A docilidade genética e a transparência óptica dos primeiros estágios de desenvolvimento de peixe-zebra para permitir a geração de imagem e não-invasivo de linhas transgénicas com fluorescente etiquetado células imunitárias. O sistema imunológico adaptativo não é totalmente funcional até várias semanas após a fertilização, mas larvas do peixe têm um sistema imunológico inato vertebrado conservada com ambos os neutrófilos e macrófagos. Assim, a geração de um modelo de infecção de larvas permite o estudo da contribuição específica da imunidade inata no controle de S. infecção iniae.
O local de microinjecção determinará se é uma infecçãosistémica ou localizada inicialmente. Aqui, apresentamos nossos protocolos para injecção vesícula ótica de peixe-zebra idade 2-3 dias após a fertilização, bem como as nossas técnicas de imagiologia confocal fluorescente de infecção. Um site infecção localizada permite a observação de invasão microbiana inicial, o recrutamento de células hospedeiras e disseminação da infecção. Nossos resultados, utilizando o modelo de larvas de peixe-zebra de S. infecção iniae indicam que peixe-zebra pode ser usado para examinar as diferentes contribuições de neutrófilos e macrófagos do hospedeiro em infecções bacterianas localizadas. Além disso, descreve-se como photolabeling de células imunes pode ser usado para rastrear o destino da célula hospedeira indivíduo durante o curso da infecção.
Introduction
Streptococcus iniae é um importante agente patogénico aquático que é capaz de causar doença sistémica, tanto nos animais e seres humanos uma. Enquanto S. iniae é responsável por grandes perdas na indústria da aquicultura, é também um potencial patógeno zoonótico capaz de causar doença em hospedeiros humanos imunocomprometidos com patologias clínicas semelhantes às causadas por outros patógenos humanos estreptococos. Dadas as suas semelhanças com patógenos humanos, é importante estudar S. iniae patogênese da doença no contexto de um hospedeiro natural. Um modelo adulto zebrafish de S. infecção iniae revelaram infiltração de leucócitos robusto hospedeiras para o local da infecção localizada, bem como um tempo rápido para acolher a morte, um tempo muito curto para envolver o sistema imunitário adaptativo 7. A fim de obter um profundo olhar para a resposta imune inata de S. iniae infecção in vivo, é necessário utilizar um modelo que se torna mais fácil para nem invasivo imagens ao vivo.
O peixe-zebra larval tem uma série de vantagens que o tornam um modelo vertebrado cada vez mais atraente para o estudo de interações patógeno-hospedeiro. Peixe-zebra são relativamente baratos e fáceis de usar e manter em relação aos modelos de mamíferos. A imunidade adaptativa não é funcionalmente maduros até 4-6 semanas após a fertilização, mas larvas têm um sistema imunológico inato vertebrado altamente conservada com complemento, Toll-like receptors, citocinas e neutrófilos e macrófagos com capacidades de antimicrobianos, incluindo a fagocitose e explosão respiratória 2-6, 8-11. Além disso, a tratabilidade genética e transparência óptica dos estádios de desenvolvimento embrionário e larval de desenvolvimento permitir a geração de linhas transgénicas estáveis com células imunes marcadas por fluorescência que permitam examinar interacções hospedeiro-agente patogénico em tempo real in vivo. A geração destas linhas transgénicas usando uma proteína photoconvertible como Dendra2 permite o seguimento da célula hospedeira origem e destino indivíduo ao longo do curso da infecção 12.
Ao desenvolver um modelo de infecção de larvas de peixe-zebra, o local escolhido de microinjeção vai determinar se uma infecção é inicialmente localizada ou sistêmica. Infecções arterial sistêmica na veia caudal ou duto de Cuvier são mais comumente usados para estudar patógenos microbianos em peixes-zebra e são úteis para o estudo de interações entre hospedeiro e células microbianas, respostas de citocinas, e as diferenças na virulência entre isolados do patógeno. Para os microrganismos que crescem mais lento, no início de injecção dentro do saco vitelino de um embrião em fase de 16-1,000 célula pode ser usado para gerar uma infecção sistémica 13,14, com o estágio de desenvolvimento ideal para microinjecção de um microrganismo com crescimento lento, verificou-se que entre a fase 16-128 célula 15. No entanto, gema de injeções sac de muitos micróbios em fases posteriores do desenvolvimento de acolhimento tendem a ser letal para tele hospedar devido ao ambiente rico em nutrientes para o micróbio e falta de leucócitos de infiltração 16-18.
Uma infecção localizada geralmente resulta na migração dirigida de leucócitos para o sítio da infecção que pode ser facilmente quantificado com imagem não invasiva. Este tipo de infecção pode permitir a dissecção dos mecanismos que medeiam a migração de leucócitos, bem como de investigação diferentes capacidades fagocíticas e migratórias de várias populações de leucócitos. Infecções localizadas também são úteis quando se examina as diferenças de virulência entre cepas bacterianas, bem como o estudo dos mecanismos de invasão de micróbios desde barreiras host físicos devem ser cruzados para uma infecção localizada para se tornar sistêmica. Peixe-zebra são normalmente levantada, a temperaturas de 25-31 ° C, 19, mas que também pode ser mantida a temperaturas tão elevadas como 34-35 ° C para os estudos da capacidade de invasão de agentes patogénicos humanos com determinados requisitos rigorosos de temperaturapara a virulência 20, 21.
Muitos locais diferentes foram usados para gerar uma infecção bacteriana localizada inicialmente incluindo o ventrículo rombencéfalo 22, músculo dorsal da cauda 18, 23 cavidade pericárdica e vesícula ótica (do ouvido), 5, 16, 24. No entanto, verificou-se que a injecção de bactérias no músculo da cauda pode causar danos nos tecidos e inflamação independente das bactérias, o que pode distorcer os resultados quando se investiga a resposta dos leucócitos 13. Embora menos danos está associada a injeção na parte posterior do cérebro e, embora seja inicialmente desprovido de leucócitos em embriões jovens, o ventrículo hindbrain constantemente ganha mais células imunes ao longo do tempo como microglia fixar residência. O ventrículo hindbrain também é um local mais difícil de imagem. A vesícula ótica é uma cavidade oca fechado, sem acesso directo à vasculatura 25, 26. É normalmente desprovido de Leukocytes leucócitos, mas podem ser recrutadas para a vesícula ótica, em resposta a estímulos inflamatórios, tais como a infecção. É também um local preferido para a microinjecção de bactérias na idade de 2-3 dias após a fertilização do peixe-zebra (dpf) por causa da facilidade de imagem e a visualização da injecção. Por isso, escolhemos a vesícula ótica como o nosso local de infecção bacteriana localizada.
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Protocol
Adultas e embrionárias peixe-zebra foram mantidos de acordo com a Universidade de Wisconsin-Madison Research Recursos Animais Center.
1. Preparando Microinjection Needles
- Prepare paredes finas agulhas de injeção capilar de vidro (1,0 OD / 0,75 ID) usando um dispositivo micropipeta extrator com as seguintes configurações: pressão de ar de 200, 502 calor, puxar 90, velocidade de 80, o tempo de 70 anos, tempo no ar no início de puxar 5, tempo no ar no final de puxar 5.
- Usando pinças finas, parta a ponta da agulha puxada de modo que a abertura da ponta tem um diâmetro de aproximadamente 10 um.
2. Preparar larval Injeção Pratos
- Lavar um pente gel com largura de faixa de cerca de 4-5 mm em água estéril e deixe secar.
- Prepara-se uma solução de agarose de fusão elevado de 1,5-2% em meio E3 19 e microondas até que a solução se torne clara. Uma vez arrefecido, despeje um pouco do agarose em uma placa de Petri (100 x 15 mm) e redemoinho,adicionando apenas agarose suficiente para cobrir completamente o fundo do prato.
- Uma vez que a camada de agarose foi solidificada, colocar o pente de gel enxaguado e seco em cima de modo a que a extremidade não penteadas é apenas descansando sobre o topo da placa de Petri e a extremidade penteada está tocando a agarose. Certifique-se de que o pente é tão horizontal quanto possível, criando um ângulo de 30 ° em relação à camada inferior de agarose.
- Verter uma pequena quantidade adicional de agarose na interface entre a camada de agarose pente e inferior de modo que a camada de agarose fresco abrange os poços do pente. Deixe esfriar completamente antes de remover o pente. Usando a ponta da pipeta, retire todos os pedaços salientes de agarose dos poços.
- Despeje meio E3 em cima do molde de injeção e armazenar a 4 ° C.
- Antes de cada uso, substitua-o por meio fresco e injeção quente rampas de 28,5 ° C, durante pelo menos uma hora antes da injeção.
- Imediatamente antes das injecções, substituir o E3 na rampa de injecção comE3 meio contendo 200 ug / ml de acetato de 3-aminobenzoato de metilo (tricaina).
3. Preparar S. iniae inóculo
- Preparar e autoclave meio de caldo Todd Hewitt suplementado com 0,2% de extracto de levedura e 2% de peptona proteose (THY + P): 30 g / L de Todd Hewitt, 2 g / L de extracto de levedura, 20 g / L de peptona proteose. Para placas de agar, adicionar 14 g / L de ágar.
- Preparar as culturas bacterianas a noite antes de infecções por pipetagem de uma alíquota de 100 ul de estoque de bactérias congeladas em 10 ml de caldo de THY + P num tubo selado de 15 ml. Incubar durante a noite sem agitação a 37 ° C. Após 14-16 horas de crescimento, use a cultura durante a noite, seja para fazer stocks congelador ou se preparar para o uso em injeções.
- Adicione existências congelador, colocando 1 ml da cultura durante a noite em 500 ul de glicerol a 80% num tubo de centrífuga de 1,7 ml. Para evitar ciclos de congelamento e descongelamento, fazer 100 l de uso único alíquotas a partir desta mistura e armazenar a -80 ° C.
- Para S. iniae utilizado em infections, dilui-se a cultura durante a noite a 1: 100 para um volume total de 10 ml de cultura por adição de 0,1 ml da cultura durante a noite a 9,9 ml de caldo de THY + P. Crescer a 37 ° C sem agitação durante cerca de 4-5 horas. Monitorar a densidade óptica (DO) a 600 nm utilizando um espectrofotómetro Nanodrop e colher as bactérias em fase mid-logarítmica quando a DO600 nm atinge ,250-,500. Uma OD600 de 0,250 nm corresponde a aproximadamente 10 8 unidades formadoras de colónias (CFU) / ml.
- Sedimentar 1 ml da cultura bacteriana num tubo de centrífuga de 1,7 ml a 1.500 xg durante 5 min. Ressuspender em 1 ml de PBS fresco e repita. Medir a DO600 nm das bactérias em PBS, pelete, e ressuspender em PBS para atingir a concentração desejada.
- Para auxiliar na visualização de microinjecção, adicionar fenol vermelho para as suspensões bacterianas antes da injecção para uma concentração final de 0,1%.
- Para experiências que envolvem a injecção de bactérias mortas por calor, aquecer as bactérias em PBS a 95 ° C durante 30 min.Confirmar que o processo de matar calor reduziu o número de bactérias viáveis para níveis não detectáveis por plaqueamento um volume de injecção (aproximadamente 1 nl) em THY placas de agar sólido + P e incubando durante a noite a 37 ° C.
4. Labeling S. INIA e com um CellTracker Red corante fluorescente
- Para marcar as células bacterianas vivas, preparar uma solução de estoque de um corante fluorescente CellTracker ou equivalente. Como o corante utilizado vem em 20 x 50 ug de aliquotas de pó e tem de ser novamente suspensas em DMSO, adicionar 7,3 mL de DMSO ao tubo para se obter uma concentração de estoque de 10 mM.
- Teste de uma gama de concentrações de corantes (por exemplo, 0,5-25 uM) sobre as bactérias para determinar a concentração óptima menor que mancha as células. As células que se dividem rapidamente e os experimentos mais longos podem requerer uma maior concentração de corante.
- Agregar 1,0 ml de cultura bacteriana num tubo de 1,7 ml por centrifugação como descrito acima (secção 3). Ressuspender o sedimento em 1ml de PBS fresco e adicionar o volume apropriado de corante para a cultura bacteriana.
- Incubar sem agitação a 37 ° C durante 30 min. Girar as bactérias e ressuspender em 1 ml de caldo de pré-aquecida THY + P e incubar sem agitação durante 30 minutos adicionais a 37 ° C.
- Girar as bactérias e lavar duas vezes em PBS antes da medição da DO 600 nm e diluindo as bactérias para microinjecção como detalhado acima (secção 3). Nós normalmente injetar aproximadamente 100 CFU em um volume de injeção nl para os nossos estudos de recrutamento de leucócitos e fagocitose.
5. Preparação de Zebrafish larvas para infecções
- Configure casais reprodutores na noite anterior e coletar embriões como descrito por Rosen et al. 27 embriões se desenvolvem em meio E3 a 28,5 ° C até que esteja pronto para infectar.
- Por peixe-zebra que vai ser trabalhada, impedir o desenvolvimento de pigmento (melanização) pela adição de N-feniltioureia (PTU) para oMeio E3 em 24 horas pós fertilização (hpf) para uma concentração final de 0,2 nM.
- Para infecções que envolvam embriões com idade entre 2 dpf, embriões dechorionate manualmente com um par de pinças finas. Alternativamente, embriões dechorionate por remoção e substituição de E3 com pronase (2 mg / ml) durante cerca de 5 minutos ou até pipetagem suave quebra embriões fora do cório. A maioria das larvas deveriam ter chocado naturalmente por 3 dpf.
- Anestesiar zebrafish vários minutos antes da infecção, colocando larvas dechorionated em meio E3 contendo 200 ug / ml tricaina.
6. Otic Vesicle injeção de S. iniae em Three Day Old Larvas
- Ligue o microinjector e definir o intervalo de tempo para "milissegundo". Abrir a válvula do tanque de dióxido de carbono para permitir que o gás na linha. A pressão do microinjector deve ler aproximadamente 20 PSI. Ajustar a pressão na unidade de microinjector por viragem no sentido horário do botão recartilhado preto para incraliviaram a pressão ou anti-horário de viragem para a diminuição da pressão.
- Vortex o S. preparado cultura iniae em vermelho fenol e PBS e usar uma dica microloader para carregar 2-3 ul da cultura em uma agulha de injeção capilar puxado.
- Montar a agulha carregada num micromanipulador ligado a um suporte magnético e posicioná-lo sob um estereomicroscópio, de modo que a agulha está num ângulo de aproximadamente 45-65 ° em relação à base do microscópio.
- Pressionar o pedal do microinjector para dispensar uma gota de inoculo para a ponta da agulha. Medir o diâmetro da gota através da barra de escala na lente ocular do microscópio.
- Alternativamente, estimar o diâmetro da gota através da injecção de um volume em uma gota de óleo mineral sobre uma lâmina de microscópio de vidro com uma barra de escala. O diâmetro da gota deve ser de aproximadamente 0,10 milímetros, o que é cerca de um volume de 1 nl.
- Ajuste o tamanho da queda, ajustando a configuração de duraçãoo microinjector ou cerceando mais da ponta da agulha com uma pinça fina. Note-se que o tempo de injecção deve ser entre 20 - 35 mseg para evitar causar danos no tecido muito.
- Usando uma pipeta de transferência de plástico, transferência anestesiados 12 larvas em cada cavidade do molde de injecção.
- Utilize uma vareta de vidro, malha de cabelo, ou a ponta de plástico para posicionar cuidadosamente a larvas de modo que as cabeças estão apontados para a parte traseira do microscópio e os sacos de gema são contra o lado esquerdo do poço. Aponte a orelha esquerda da larva em direção ao teto.
- Olhando através da lente ocular do microscópio estereoscópico, use os botões no micromanipulator para alinhar a agulha carregada com a vesícula ótica de modo que ambos estão no mesmo campo de visão. Pierce a camada epitelial externa da vesícula ótica com a ponta da agulha para que a ponta da agulha está no interior da vesícula.
- Pressionar o pedal para injectar um de nl a dose desejada de S. iniae. Certifique-se de usar umpressão suficientemente baixa para não romper a cavidade. Se a injecção for bem sucedida, a vesícula ótica, mas não no tecido circundante, deve encher-se com o fenol vermelho inoculo (Figura 1 Ai). Remover imediatamente qualquer peixe-mis injetado a partir da placa de injeção.
- Retrair cuidadosamente a agulha da larva e mover a placa de injeção com a mão para que o próximo larva está em vista. Faça isso com uma ampliação de 5X.
Nota: A retracção da agulha pode resultar na deposição de algumas bactérias fora da vesícula ótica, o que pode distorcer sobrevivência e recrutamento de leucócitos resultados. Para evitar isso, recomenda-se a injectar bactérias marcadas com corante fluorescente e visualmente digitalizar larvas injectado sob um microscópio fluorescente para remover qualquer larva quando este tenha ocorrido. Uma larva correctamente injectada é mostrado na (Figura 1 Bi). - Para garantir o volume de injecção / inóculo permanece o mesmo ao longo do curso do experimento, injectar uma queda dos s bacterianasUSPENSÃO para um tubo de 1.7 ml de centrífuga contendo 100 ul de PBS estéril, após cada 48 th embrião. A chapa 100 ul em placas de THY agar + P a 37 ° C durante a noite para determinar a CFU no volume de injecção.
- Quando todo o grupo de 12 larvas na rampa de injecção ter sido injectado, usar cuidadosamente uma pipeta transferidora de plástico para remover as larvas dos poços e colocá-los numa nova placa de Petri (35 x 10 mm 2). Remover a solução tricaina e substituir com aproximadamente 2 ml de meio fresco E3 para permitir que as larvas se recuperar.
- Pipetar injectado em larvas de poços individuais de uma placa de 96 poços e incuba-se a 28,5 ° C. Monitorar larvas ao longo do tempo para a sobrevivência nestas placas ou remover mais tarde para a contagem de imagem ou UFC.
7. Sudan Black Coloração de neutrófilos
Nota: Os seguintes passos podem ser realizados à temperatura ambiente numa pequena placa de Petri (35 x 10 mm 2) num agitador orbital, a menos otherwise afirmou. Para cada etapa, a quantidade de reagente utilizado é de aproximadamente 2 ml por placa, utilizando líquido apenas o suficiente para cobrir completamente as larvas.
- Para a fixação de larvas infectadas, use uma pipeta Pasteur de vidro para remover o meio E3 e substituir por um paraformaldeído 4% gelada em solução PBS. Imediatamente coloque o peixe a 4 ° C a eutanásia. Fixar durante a noite a 4 ° C.
- Lavar 3 vezes em PBS durante 5 min cada.
- Mancha com preto do Sudão (0,18% estoque diluída 1: 5 em 70% de etanol, 0,1% de fenol) durante 30 min a 5 h. Use uma lupa para verificar se os grânulos de neutrófilos assumiram a mancha.
- Executar uma série de lavagens de 5 min começando com uma única lavagem de etanol a 70% seguido por uma única lavagem de uma proporção de 1: 1 de etanol a 70% e PBS, seguido por uma lavagem final em PBS.
- Rehidratar em PBS mais 0,1% de Tween (PBT).
- Para limpar pigmento das larvas, lavar em 1% de hidróxido de potássio / 1% de peróxido de hidrogénio durante cerca de 6-10 min. Monitorar o Closel amostray e depois de cerca de 5 minutos, verifique as larvas sob microscópio estereoscópico para ver quanto do pigmento foi eliminada. Se a solução é deixada em muito tempo, os sacos de gema vai inchar e explosão.
- Lavar 3 vezes durante 5 minutos cada em PBS.
- Armazenar as amostras em PBS ou PBT a 4 ° C durante até 1 semana até estar pronto para a imagem e contar.
- Para imagem Sudão cor preta larvas, transferir o peixe em PBT e depois para 80% de glicerol e coloque em um único slide depressão cavidade. Posição fixa larvas sob microscópio estereoscópico usando uma ponteira. Imagem usando uma câmera digital da cor em um microscópio estereoscópico (Figura 1 Aii-iv).
8. A enumeração de bactérias viáveis de Infected Larvas
- Eutanásia larvas nos momentos desejados após a infecção numa solução / L 200-300 mg gelada de tricaina em meio E3.
- Pipet sacrificados larvas em 1,7 ml tubos de centrífuga. Remover a solução tricaina e substituir com 100 ul de 0,2%Triton X-100 em PBS (PBSTx).
- Homogeneizar larvas passando cima e para baixo 10 vezes através de uma agulha 27 G.
- Preparar diluições em série do homogeneizado em PBS estéril. Por exemplo, se a dose infecciosa é 100 CFU, pipeta de 100 uL do homogeneizado em 900 ul de PBS estéril. Utilizando uma nova ponta de pipeta, transferir 100 ul de homogeneizado diluído em 900 ul de PBS estéril.
- Placa 100 uL das diluições sobre ágar Columbia CNA para isolamento selectivo de bactérias gram-positivas, e incubar a 37 ° C durante 48 h. Este meio de selecção irá proporcionar maior do que as placas de agar THY + P, que suportam o crescimento de bactérias gram-negativas e gram-positivas.
- Em placas com menos de 500 colónias individuais, contar o número de colónias e multiplicar pelo factor de diluição para determinar o número de UFC.
9. A fixação de larvas for Imaging
- Corrigir larvas em um paraformaldeído 4% gelada em solução PBS como dedescrito no item 7.
- À temperatura ambiente, lavar 3 vezes durante 5 minutos cada em PBS antes de imagem.
10. Preparação de Larvas de Imagens ao vivo
- Prepara-se uma solução de agarose de baixo ponto de fusão a 1,5% em E3 por aquecimento em forno de microondas até a solução ficar clara.
- Coloque solução de agarose em um banho de água a 55 ° C para que esfrie, mas não endurecer.
- Adicionar tricaina para a agarose até uma concentração final de 0,016%.
- Usando uma pipeta de transferência de plástico, coloque 4-5 larvas anestesiados em um prato de vidro de fundo no palco de um estereomicroscópio.
- Remover o tricaina e solução de agarose a partir do banho de água a 55 ° C e deixar arrefecer à temperatura ambiente, durante 1-2 min. Enquanto a agarose é arrefecimento, remover o máximo de líquido a partir das larvas anestesiado quanto possível.
- Verter a agarose arrefecida para a cápsula até cerca de metade da superfície está coberta. Agitar o prato para espalhar a agarose. Note-se que se a agaroseé muito quente, ele vai matar as larvas. Além disso, se demasiado agarose é adicionado ao prato, a lente da objectiva do microscópio pode bater no fundo do prato quando a focagem através da agarose.
- Usando uma pipeta de transferência, pegar as larvas que ter flutuado para os lados do prato e pipeta-los de volta para o centro.
- Sob o microscópio estereoscópico, posicione delicadamente as larvas como desejado com um laço de cabelo, uma ponteira longa ou uma vareta de vidro. No caso da imagiologia da vesícula ótica, posicionar as larvas de modo que a vesícula ótica esquerda é plana contra o fundo do prato.
- Deixe-o esfriar agarose por cerca de 10 min antes de mover o prato. As larvas podem mudar de posição se a agarose não é sólido. Suavemente pipetar alguns tricaina e solução E3 para o topo da camada de agarose para mantê-lo húmido.
11. Imagem Confocal de Infecção
- Coloque o prato com fundo de vidro com larvas para o palco de um microscópio invertido com um confoca varredura a laser FV-1000sistema l.
- Defina o pinhole para 200-300 mm e usando uma abertura numérica 0,75 / 20X lente objetiva, definir z-stacks com 3-6 mm fatias.
- Use varredura linha contínua para ajustar o ganho de potência do laser e detector para cada canal.
- Usando digitalização linha sequencial para cada canal de fluorescência (por exemplo, 488 e 543 nm) e contraste de interferência diferencial (DIC), realizar um filme de lapso de tempo da vesícula ótica deixou a cada 3 min para 2-6 horas a observar o recrutamento inicial e fagocitose por neutrófilos e macrófagos. Para os cursos de tempo mais longos, colocar uma tampa sobre a caixa de Petri para evitar a evaporação e secagem para fora da agarose.
- Adquirir imagens fixas de telefonia fixa (Figura 1B) ou ao vivo (Figura 2) larvas em 20X ou 40X.
12. Fotoconversão de Dendra2 marcado leucócitos no Otic Vesicle
Nota: Dendra2 pode ser photoconverted de verde para fluorescência vermelhacentrando-se um laser de 405 nm (50-70% de potência do laser deve ser suficiente) na região de interesse (ROI) por 1 min. Abaixo encontra-se o protocolo passo-a-passo adoptado para o sistema de varrimento a laser confocal FV-1000:
- Visualize a amostra usando uma varredura z-stack com a 488 nm e 543 nm lasers. Use varredura linha contínua para ajustar o ganho de potência do laser e detector. Verifique se não há nenhuma fluorescência vermelha acidentalmente photoconverted.
- Na janela "Controle de Imagem Aquisição", em "Stimulus Setting" selecione a ferramenta "Use Scanner" e escolha "main". Selecione o laser de 405 nm e ajustá-la em 70% de energia. Usando a opção de círculo, definir o ROI na vesícula ótica.
- Em "Stimulus Iniciar Configuração", selecione "Activation em série", com um pré-ativação de um quadro e um tempo de ativação de 60.000 ms. Na janela "Aquisição Setting" no âmbito do "Scan Time título", escolha 2 emtervalos de 00:01:00 (um para pré e uma para fotoconversão pós-).
Nota: Após o tempo série lapso verificação for concluída, o Dendra2 deveria ter sido photoconverted ao seu estado fluorescente vermelha. - Digitalizar a amostra por uma pilha z usando a 488 nm e 543 nm lasers para visualizar a fluorescência vermelha photoconverted bem como qualquer fluorescência verde remanescente (Figura 3).
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Representative Results
Microinjeção de S. iniae na vesícula ótica (Figura 1 e Figura 2) resulta em uma resposta do hospedeiro inicialmente localizadas. Quando injectado correctamente, as bactérias devem ser vistas apenas na vesícula ótica e não no tecido circundante ou sangue. Isto pode ser visualizado durante a microinjecção usando corante vermelho de fenol (Figura 1A). Alternativamente, se bactérias marcadas são injetados, uma varredura rápida de larvas infectadas imediatamente após a injeção pode confirmar as bactérias são apenas na vesícula ótica e não o tecido circundante (Figura 1B). Apesar de uma dose tão pequena como 10 UFC de tipo selvagem S. iniae é capaz de estabelecer uma infecção letal dentro de 24-48 horas após a infecção (IPH), a injeção de 1.000 UFC de uma cepa não virulenta, CPSA, não resulta em infecção letal e que a tensão parece incapaz de proliferar no hospedeiro 24. Assim, este modelo de infecção localizada é capaz de Diferenciade entre estirpes bacterianas de virulência alterada.
Locais de microinjecção de infecção localizada inicialmente são úteis para estudar a quimiotaxia dos leucócitos. O recrutamento de leucócitos pode por quantificado por coloração com preto do Sudão ou dos grânulos de neutrófilos (Figura 1A) ou a fixação de formaldeído de linhas transgénicas fluorescentes (Figura 1B). Para visualizar o recrutamento e capacidades fagocíticas de células imunitárias, utilizou-se linhas transgénicas que expressam a proteína fluorescente verde Dendra2 especificamente em macrófagos Tg (MPEG1: dendra2) 24 ou neutrófilos Tg (mpx: dendra2) 12. Quando S. iniae é injectado para dentro da vesícula ótica, de 3 larvas dpf, ambos os neutrófilos e macrófagos são rapidamente recrutados no primeiro hpi 2 (Figura 1). No entanto, quando realizado correctamente, a microinjecção de PBS para dentro da vesícula ótica não resulta na mesma robusto recrutamento de leucócitos hospedeiras (
Figura 2: Fagocitose de S. iniae por fagócitos na vesícula ótica MPX Transgénicos:. dendra2 (A) ou MPEG1: dendra2 (B) larva infectada com vermelho marcada com S. iniae (representado na magenta) e fotografada na infecção pós 60 min usando uma espia a lasering microscópio confocal. Barra de escala, de 30 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fotoconversão de macrófagos na vesícula ótica 5 hpi com S. iniae. Os macrófagos (representadas em verde) na vesícula ótica, designados pelo círculo (A), foram photoconverted (B), usando um laser de 405 nm num microscópio confocal e acompanhada ao longo do tempo. Até 24 de HPI, os macrófagos photoconverted (representado na magenta) migraram até o tronco / tecido hematopoiético caudal (C); barra de escala, 50 mm. Ampliações maiores das regiões enquadradas em C são apresentados na (i) e (ii), barra de escala de 30 um; setas apontam para photoconmacrófagos convertidos. Células Photoconverted aparecem em branco por causa da mesclado 543 fluorescência vermelha nm e 488 nm qualquer restante fluorescência verde. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método usado aqui infecção é útil para o estudo da resposta imune do hospedeiro a uma infecção inicialmente localizada em 2-3 embriões dpf e larvas. O foco de um estímulo inflamatório, tal como a infecção, numa cavidade fechada, tal como a vesícula ótica permite o estudo de neutrófilos e macrófagos quimiotaxia e da fagocitose. Uma ressalva de injecção de bactérias para dentro da vesícula ótica é que a capacidade dos neutrófilos de forma eficiente em bactérias fagocitam cavidades cheias de líquido, pode ser dependente do micróbio particular. Apesar de Escherichia coli e Bacillus subtilis não são facilmente fagocitadas por neutrófilos na vesícula ótica 28, verificou-se que os neutrófilos são capazes de fagocitar tanto Pseudomonas aeruginosa e S. iniae neste local 16, 24. Infecção localizada também é útil quando se estuda a invasão de vários patógenos. A fim de causar uma infecção sistémica seguinte injection dentro de uma cavidade fechada, tal como a vesícula ótica, o micróbio deve ser capaz de atravessar barreiras físicas hospedeiras. Alternativamente, diferentes patógenos podem confiar em células hospedeiras para transporte e divulgação do local inicial da infecção. Isso faz com que as injeções localizadas útil para comparar cepas de virulência alterada.
Durante a microinjeção, para evitar bactérias sedimentação e entupimento da agulha, agulhas de mudança ou depois de cada condição ou depois de cerca de 50 larvas. Isso ajudará a garantir a suspensão na agulha é mais uniforme. Se a resolução de bactérias no interior da agulha parece ser um problema, uma mistura de PBS, 2% PVP40, e 10% de glicerol pode ajudar a manter uma suspensão homogénea. Para assegurar que cada larva está a ser injectado com aproximadamente o mesmo número de bactérias, verificar a contagem de CFU por homogeneização de uma larva imediatamente a seguir à injecção e plaqueamento em ágar do homogeneizado CNA. CNA agar irá seleccionar para o crescimento de bactérias gram-positivas cultiváveis, não apenasS. iniae, mas vai dar uma ideia de como consistente as doses de injeção estão entre cada larva individual. Com um inoculo de alvo de 100 CFU por larva, existem tipicamente entre 75-150 colónias numa placa CNA. O número de não-S. colónias gram-positivas iniae crescem em uma placa CNA é provavelmente muito baixo, já que a maioria PBS peixes injetados geralmente resultam em entre 0-20 colônias. No posteriores momentos durante a infecção, não é raro que haja variação de até metade de um log da contagem de colónias entre larvas infectadas com a mesma dose infecciosa. Isto podia representar pequenas diferenças entre larva indivíduo em sua capacidade de controlar a infecção ou podem reflectir as diferenças na quantidade de bactérias gram-positivas cultiváveis em que as larvas ou meio E3.
Enquanto injetar na vesícula ótica, é importante não para injetar um volume demasiado importante ou com uma pressão muito alta, pois isso pode fazer com que a cavidade à ruptura. Os volumes de injecção should ser mantida a cerca de 1 nl. Se a agulha é muito grande, a microinjecção pode causar danos no tecido circundante, o que pode afectar o recrutamento de leucócitos do hospedeiro para o local da infecção ou pode permitir que as bactérias para vazar para fora da vesícula ótica. Também é importante para confirmar injecção no espaço correcto. Se a agulha é inserida muito profunda, pode picar através da vesícula ótica ou pode bater vasos sanguíneos que fluem em torno da vesícula ótica. Isto pode conduzir à deposição de bactérias na corrente sanguínea ou no exterior da vesícula, que podem alterar as respostas do hospedeiro.
É também possível que quando a agulha é extraída, algumas bactérias podem ser acidentalmente depositado fora da vesícula ótica, como mostrado por Colucci-Guyon et al. 28, mas descobrimos que isso só é o caso em menos de 5% das injecções. Tentando injectar no centro da vesícula ótica pode ajudar a evitar esta situação. Em uma infecção bem sucedida, a vesícula ótica deve encher-se wom o corante vermelho de fenol, mas o corante não deve vazar para os tecidos circundantes. Qualquer larvas injetadas-mis deve ser imediatamente descartado. Injectando bactérias marcadas é uma forma útil para confirmar uma injecção bem sucedida (Figura 1B). Uma das desvantagens do uso de um corante CellTracker é que o corante será diluído como as bactérias dividir, eventualmente, impedindo as bactérias de serem visualizados sob fluorescência. Nós escolhemos um corante vermelho porque usamos neutrófilos verde-rotulados e linhagens transgênicas de macrófagos para a maioria dos nossos estudos.
Dendra2 é uma proteína derivada de photoconvertible octocoral Dendronephthya sp. que pode ser photoconverted de um verde a um estado fluorescente vermelha com um laser de 405 nm 29. Este fotoconversão é uma forma não-invasiva para marcar células e seguir o seu destino sobre o curso da infecção. Leucócitos recrutadas para o local da infecção podem ser photoconverted e seguido ao longo do tempo para monitorizar a sua dIVULGAÇÃO pelos tecidos do hospedeiro (Figura 3). Alternativamente, os leucócitos podem ser photoconverted antes da infecção e, em seguida, monitorizada pós-microinjecção para determinar a origem das células recrutadas para o local da infecção. Bactérias rotulagem e células do sistema imunológico permite o estudo das interações leucócito-patógeno in vivo, incluindo o recrutamento e fagocitose (Figura 1B e Figura 2). Distinguir o S. vermelho marcado iniae da fluorescência vermelha de um leucócito photoconverted é difícil, portanto, um corante fluorescente CellTracker diferente poderia ser utilizado. Isto seria particularmente útil para determinar quais das células imunitárias photoconverted que deixam a vesícula ótica conter S. iniae.
As aplicações futuras do método de infecção vesícula ótica pode incluir a medição da velocidade e direccionalidade por neutrófilos e macrófagos, que se movem em resposta a várias infecções. A infecção kinetics pode também ser estudado para ver quais os tipos de células são os primeiros a chegar a um local de infecção e que os tipos de células são mais robustamente recrutados para além de onde as células onde se originam ou que divulgam 30. Além de estudar o recrutamento de uma infecção localizada, inicialmente, este modelo de infecção pode ser utilizado para estudar a função dos componentes do sistema imune do hospedeiro durante a infecção inicial. Os oligonucleótidos anti-sentido de morfolino que alvejam RNAs específicos podem ser usados para derrubar a expressão de componentes do sistema imunológico do hospedeiro, incluindo os receptores do tipo Toll, receptores de citoquina e os leucócitos e as CRISPR-Cas ou TALEN tecnologia pode ser utilizada para criar mutantes genéticos. A expressão de genes usando RNAseq qPCR ou também pode ser utilizado para caracterizar a expressão de certos genes do hospedeiro em resposta à infecção.
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Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer aos membros do laboratório para os cuidados de peixe-zebra e manutenção. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health, National Research Service Award A155397 a EA Harvie e NIH R01GM074827 para Anna Huttenlocher.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml Eppendorfs | MidSci | AVSS1700 | |
| 14 ml Falcon tube | BD Falcon | 352059 | |
| 27 G x ½ in. needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 96-well Plate | Corning Incorporated | 3596 | |
| Agar | BD Biosciences | 214030 | |
| CellTracker Red | Molecular Probes, Invitrogen | C34552 | |
| CNA agar | Dot Scientific, Inc | 7126A | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-7m | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ethanol 200 proof | MDS | 2292 | |
| Fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gel comb | VWR | 27372-482 | 4.2 mm width, 1.5 mm thick |
| Glass bottom dishes | Custom made by drilling a 16 - 18 mm hole in the center of a 35 mm tissue culture dish bottom and placing a 22 mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light. | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| High melt agarose | Denville Scientific, Inc. | CA3510-6 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | with FV-1000 system | |
| Low melt agarose | Fisher | BP165-25 | |
| Magnetic stand | Tritech (Narishige) | GJ-1 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipet tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | Tritech (Narishige) | M-152 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Nanodrop spectrophotmeter | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 100 x 15 mm |
| Phenol | Sigma Aldrich | P-4557 | |
| Phenol Red | Ricca Chemoical Company | 572516 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Potassium hydroxide | Sigma Aldrich | P-6310 | |
| Pronase | Roche | 165921 | |
| Protease peptone | Fluka Biochemika | 29185 | |
| Small cell culture dish | Corning Incorporated | 430165 | 35 x 10 mm |
| Sudan Black | Sigma Aldrich | S2380 | |
| Thin wall glass capillary injection needles | World Precision Instruments, Inc. | TW100-3 | |
| Todd Hewitt | Sigma Aldrich/Fluka Analytical | T1438 | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | Argent Chemical Laboratory/Finquel | C-FINQ-UE-100G | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast extract | Fluka Biochemika | 92144 |
References
- Agnew, W., Barnes, A. C. Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination. Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).
- Danilova, N., Steiner, L. A. B cells develop in the zebrafish pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish. Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).
- Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).
- Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis. Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).
- Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio. Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).
- Meijer, A. H., et al. Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish. Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).
- Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio). Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).
- Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS ONE. 6 (2), e16779 (2011).
- Veneman, W. J., Marín-Juez, R., et al. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury. Cell. Microbiol. , (2012).
- Sar, A. M., et al. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. New York, NY. (2002).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).
- Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae. Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).
- Haddon, C., Lewis, J. Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
- Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -Y., Phillips, B. Development of the zebrafish inner ear. Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
- Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
- Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).
