Abstract
El patógeno acuático, Streptococcus iniae, es responsable de más de 100 millones de dólares en pérdidas anuales para la industria de la acuicultura y es capaz de causar enfermedad sistémica en ambos peces y los seres humanos. Una mejor comprensión de S. iniae patogénesis de la enfermedad requiere un sistema modelo apropiado. La maleabilidad genética y la transparencia óptica de las etapas tempranas del desarrollo de pez cebra permiten la generación y proyección de imagen no invasiva de las líneas transgénicas con marcados fluorescentemente células inmunes. El sistema inmune adaptativo no es completamente funcional hasta varias semanas después de la fecundación, pero las larvas de pez cebra tienen un sistema inmune innato vertebrados conservadas con neutrófilos y macrófagos. Por lo tanto, la generación de un modelo de infección de larvas permite el estudio de la contribución específica de la inmunidad innata en el control de S. infección iniae.
El sitio de microinyección determinará si hay una infecciónsistémica o localizada inicialmente. A continuación, presentamos nuestros protocolos para inyección vesícula ótica de pez cebra edad de 2-3 días después de la fecundación, así como las técnicas de imagen confocal de fluorescencia de la infección. Un sitio de infección localizada permite la observación de la invasión inicial microbio, el reclutamiento de células huésped y la difusión de la infección. Nuestros resultados utilizando el modelo de larvas de pez cebra de S. infección iniae indican que el pez cebra puede ser usado para examinar las diferentes contribuciones de los neutrófilos y los macrófagos de acogida en las infecciones bacterianas localizadas. Además, se describe cómo photolabeling de las células inmunes puede ser usado para rastrear el destino de la célula huésped individual durante el curso de la infección.
Introduction
Streptococcus iniae es un importante patógeno acuático que es capaz de causar enfermedad sistémica en peces y seres humanos 1. Aunque S. iniae es responsable de grandes pérdidas en el sector de la acuicultura, también es un potencial patógeno zoonótico, capaces de causar enfermedad en huéspedes humanos inmunocomprometidos con patologías clínicas similares a las causadas por otros patógenos humanos estreptocócicas. Habida cuenta de sus similitudes con patógenos humanos, es importante para estudiar S. iniae patogénesis de la enfermedad en el contexto de un huésped natural. Un modelo de pez cebra adultos de S. infección iniae reveló la infiltración de leucocitos robusta host al sitio localizado de infección, así como un rápido tiempo de acoger la muerte, un tiempo demasiado corto para involucrar al sistema inmune adaptativo 7. Con el fin de obtener una mirada en profundidad sobre la respuesta inmune innata a S. iniae infección in vivo, es necesario utilizar un modelo que es más susceptible de nen invasiva de imágenes en directo.
El larvas de pez cebra tiene una serie de ventajas que lo hacen un modelo vertebrado cada vez más atractivo para el estudio de las interacciones huésped-patógeno. El pez cebra son relativamente barato y fácil de usar y de mantener en comparación con los modelos de mamíferos. La inmunidad adaptativa no es funcionalmente maduro hasta 4-6 semanas después de la fecundación, pero las larvas tienen un sistema inmune innato de vertebrados muy conservada con complemento, receptores tipo Toll, citocinas y los neutrófilos y macrófagos con capacidades antimicrobianas incluyendo la fagocitosis y el estallido respiratorio 2-6, 8-11. Además, la tratabilidad genética y la transparencia óptica de las etapas embrionarias y larvarias de desarrollo permiten la generación de líneas transgénicas estables con las células inmunes marcados con fluorescencia por lo que es posible examinar la interacción huésped-patógeno en tiempo real en vivo. La generación de estas líneas transgénicas utilizando una proteína fotoconvertible tales como DenDRA2 permite el seguimiento de origen célula huésped individual y el destino en el transcurso de la infección 12.
Cuando se desarrolla un modelo de infección de larvas de pez cebra, el sitio elegido de microinyección determinará si una infección es inicialmente localizado o sistémico. Infecciones de la sangre sistémica en la vena caudal o conducto de Cuvier son los más utilizados para estudiar los patógenos microbianos en el pez cebra y son útiles para el estudio de las interacciones entre el huésped y las células microbianas, las respuestas de citoquinas, y las diferencias en la virulencia entre cepas de patógenos. Para los microorganismos de crecimiento más lento, inyección temprana en el saco vitelino de un embrión en la etapa de 16-1,000 célula puede ser usado para generar una infección sistémica 13,14, con la etapa de desarrollo óptimo para la microinyección de un microorganismo de crecimiento lento encontrado que entre la etapa de 16-128 células 15. Sin embargo, la yema inyecciones saco de muchos microbios en las etapas posteriores del desarrollo de acogida tienden a ser letal en tél huésped debido al medio ambiente rico en nutrientes para el microbio y la falta de infiltración de leucocitos 16-18.
Una infección localizada generalmente resulta en la migración dirigida de los leucocitos hacia el sitio de la infección que puede ser fácilmente cuantificó con imagen no invasiva. Este tipo de infección puede permitir para la disección de los mecanismos que median la migración de leucocitos así como la investigación de diferentes capacidades migratorias y fagocíticas de diversas poblaciones de leucocitos. Las infecciones localizadas también son útiles al examinar las diferencias de virulencia entre las cepas bacterianas, así como el estudio de los mecanismos de invasión de microbios ya que las barreras host físicos deben ser cruzados por una infección localizada para convertirse en sistémica. El pez cebra se eleva típicamente a temperaturas de 25-31 ° C 19, sino que también puede mantenerse a temperaturas tan altas como 34-35 ° C para los estudios de la invasividad de ciertos patógenos humanos con requisitos estrictos de temperaturapara la virulencia 20, 21.
Muchos sitios diferentes se han utilizado para generar una infección bacteriana localizada inicialmente como el ventrículo cerebro posterior 22, músculo dorsal de la cola 18, cavidad pericárdica 23, y vesícula ótica (oreja) 5, 16, 24. Sin embargo, se ha encontrado que la inyección de bacterias en el músculo de la cola puede causar daños en los tejidos y la inflamación independiente de las bacterias, que pueden sesgar los resultados en la investigación de la respuesta de leucocitos 13. Aunque menos daño está asociado con la inyección en el cerebro posterior y aunque es inicialmente desprovista de leucocitos en los embriones jóvenes, el ventrículo rombencéfalo gana constantemente más células inmunes con el tiempo como microglia toman la residencia. El ventrículo posterior del cerebro es también un lugar más difícil de imagen. La vesícula ótica es una cavidad hueca cerrada, sin acceso directo a la vasculatura 25, 26. Es normalmente desprovista de leukocytes, pero los leucocitos pueden ser reclutados a la vesícula ótica en respuesta a estímulos inflamatorios, como la infección. También es un sitio preferido de la microinyección de bacterias en 2-3 días de edad después de la fertilización de pez cebra (dpf) debido a la facilidad de formación de imágenes y la visualización de la inyección. Por lo tanto, se optó por la vesícula ótica como nuestro lugar de la infección bacteriana localizada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Adultas y embrionarias pez cebra se mantuvieron de acuerdo con la Universidad de Wisconsin-Madison Centro de Investigación de Recursos Animales.
1. Preparación de microinyección Needles
- Preparar agujas de inyección capilar de vidrio de pared delgada (1,0 OD / 0.75 ID) utilizando un dispositivo extractor de micropipeta con los siguientes valores: presión de aire 200, de calor 502, tirar 90, velocidad 80, hora 70, tiempo en el aire en el arranque de la tracción 5, tiempo en el aire al final de la tracción 5.
- Utilizando pinzas finas, rompa la punta de la aguja retirado de manera que la abertura de la punta tiene un diámetro de aproximadamente 10 micras.
2. la preparación de platos de inyección de larvas
- Enjuague un peine de gel con ancho de carril de aproximadamente 4.5 mm de agua estéril y dejar secar.
- Preparar una solución de agarosa de fusión alto 1,5-2% en medio E3 19 y microondas hasta que la solución es clara. Una vez enfriado, se vierte algunos de la agarosa en una placa de Petri (100 x 15 mm) y remolino,añadiendo suficiente de agarosa para cubrir completamente el fondo del plato.
- Una vez que la capa de agarosa se ha solidificado, colocar el peine gel se enjuaga y se seca en la parte superior de manera que el extremo no peinado se acaba descansando en la parte superior de la placa de Petri y el extremo peinado está en contacto con la agarosa. Asegúrese de que el peine es lo más horizontal posible, creando un ángulo de 30 ° con respecto a la capa de agarosa al fondo.
- Verter una pequeña cantidad adicional de agarosa en la interfaz entre el peine y la capa de agarosa parte inferior de modo que la capa de agarosa fresca cubre los pocillos de la peine. Deje que se enfríe por completo antes de retirar el peine. Usando una punta de pipeta, retire los trozos colgantes de agarosa de los pozos.
- Verter medio E3 en la parte superior del molde de inyección y se almacena a 4 ° C.
- Antes de cada uso, cambie con medianas y de inyección caliente rampas frescas a 28,5 ° C durante al menos una hora antes de la inyección.
- Inmediatamente antes de las inyecciones, reemplazar el E3 en la rampa de inyección conE3 medio que contiene 200 mg / ml de acetato de 3-aminobenzoato (tricaína).
3. Preparación S. iniae inóculo
- Preparar y esterilizar en autoclave medio de caldo Todd Hewitt suplementado con 0,2% de extracto de levadura y 2% de peptona proteosa (THY + P): 30 g / L Todd Hewitt, 2 g / L de extracto de levadura, 20 g / L de peptona proteosa. Para placas de agar, añadir 14 g / L de agar.
- Preparar cultivos bacterianos la noche antes de las infecciones por pipetear una parte alícuota de 100 l de stock bacteriana congelado en 10 ml de THY + P caldo en un tubo sellado 15 ml. Incubar toda la noche sin agitación a 37 ° C. Después de 14 a 16 h de crecimiento, utilice el cultivo durante la noche, ya sea para hacer las reservas del congelador o preparar para su uso en inyecciones.
- Hacer las existencias del congelador mediante la colocación de 1 ml del cultivo durante la noche en 500 l de 80% de glicerol en un tubo de 1,7 ml de centrífuga. Para evitar los ciclos de congelación-descongelación, hacer 100 l de un solo uso alícuotas de esta mezcla y se almacena a -80 ° C.
- Para S. iniae utiliza en infections, diluir el cultivo durante la noche 1: 100 para un volumen total de cultivo de 10 ml mediante la adición de 0,1 ml de cultivo durante la noche a 9,9 ml de THY + P caldo. Crece a 37 ° C sin agitación durante aproximadamente 4-5 horas. Monitorear la densidad óptica (DO) a 600 nm utilizando un espectrofotómetro Nanodrop y cosechar las bacterias en fase logarítmica media cuando la DO600 nm alcanza 0,250 a 0,500. Una DO600 nm de 0,250 corresponde a aproximadamente 10 8 unidades formadoras de colonias (UFC) / ml.
- Pellet 1 ml del cultivo bacteriano en un tubo de 1,7 ml se centrifuga a 1500 xg durante 5 min. Resuspender en 1 ml de PBS fresco y de repetición. Medir la DO600 nm de las bacterias en PBS, pellet, y resuspender en PBS para alcanzar la concentración deseada.
- Para ayudar en la visualización de la microinyección, añadir rojo de fenol a las suspensiones bacterianas antes de la inyección para una concentración final de 0,1%.
- Para los experimentos que implican la inyección de bacterias muertas por calor, calentar las bacterias en PBS a 95 ° C durante 30 min.Confirmar que el proceso para matar calor redujo el número de bacterias viables hasta niveles indetectables mediante siembra de un volumen de inyección (aproximadamente 1 nl) en THY sólido + P placas de agar e incubar durante la noche a 37 ° C.
4. Etiquetado S. INIA e con un CellTracker rojo fluorescente del tinte
- Para etiquetar las células bacterianas de estar, preparar una solución stock de un colorante fluorescente CellTracker o equivalente. Como el colorante usado viene en 20 x 50 g alícuotas de polvo y necesita ser resuspendieron en DMSO, añadir 7,3 l DMSO al tubo para obtener una concentración stock de 10 mM.
- Prueba de una gama de concentraciones de colorante (por ejemplo, 0,5-25 mM) sobre las bacterias para determinar la concentración óptima más bajo que tiñe las células. Las células se dividen rápidamente y experimentos más largos pueden requerir una mayor concentración de colorante.
- Pellet 1,0 ml de cultivo bacteriano en un tubo de 1,7 ml por centrifugación como se describió anteriormente (sección 3). Resuspender el precipitado en 1ml de PBS fresco y añadir el volumen apropiado de medio de contraste para el cultivo bacteriano.
- Incubar sin agitación a 37 ° C durante 30 min. Centrifugar las bacterias y resuspender en 1 ml de pre-calentado caldo THY + P y se incuba sin agitación durante 30 minutos adicionales a 37 ° C.
- Centrifugar las bacterias y lavar dos veces en PBS antes de medir la DO600 nm y diluyendo las bacterias para la microinyección como se detalló anteriormente (sección 3). Normalmente nos inyectamos aproximadamente 100 UFC en 1 volumen de inyección nl para nuestros estudios de reclutamiento de leucocitos y la fagocitosis.
5. Preparación de pez cebra larvas de Infecciones
- Configure parejas reproductoras de la noche anterior y recoger los embriones según lo descrito por Rosen et al. 27 embriones se incuban en medio E3 a 28,5 ° C hasta que esté listo para infectar.
- Para pez cebra que se fotografiada, prevenir el desarrollo de pigmento (melanization) mediante la adición de N-feniltiourea (PTU) a laMedio E3 a 24 h después de la fecundación (HPF) para una concentración final de 0,2 nM.
- Para las infecciones con embriones de edad 2 dpf, embriones dechorionate manualmente con un par de pinzas finas. Alternativamente, los embriones dechorionate mediante la eliminación de E3 y la sustitución con pronasa (2 mg / ml) durante aproximadamente 5 minutos o hasta que pipeteo suave rompe embriones fuera del corion. La mayoría de las larvas deberían haber tramado naturalmente por 3 dpf.
- Anestesie pez cebra varios minutos antes de la infección mediante la colocación de larvas dechorionated en el medio de E3 que contiene 200 mg / ml tricaína.
6. Otic Vesícula La inyección de S. iniae en Tres Días Viejo larvas
- Encienda el microinyector y establecer el rango de tiempo para "milisegundos". Abrir la válvula en el tanque de dióxido de carbono para permitir que el gas en la línea. La presión de la microinyector debe leer aproximadamente 20 PSI. Ajuste la presión en la unidad microinyector por las agujas del reloj de inflexión de la perilla estriada negro para incraliviado la presión o en sentido contrario de giro para disminución de la presión.
- Vortex el S. preparado cultura iniae en rojo fenol y PBS y utilizar una punta microloader para cargar 2.3 l de la cultura en una aguja de inyección capilar tirado.
- Montar la aguja cargada en un micromanipulador conectado a un soporte magnético y la posición debajo de un microscopio estereoscópico de manera que la aguja esté en un ángulo aproximado de 45-65 ° con respecto a la base del microscopio.
- Pulse en el pedal del microinyector para dispensar una gota de inóculo en la punta de la aguja. Medir el diámetro de la gota usando la barra de escala en la lente ocular del microscopio.
- Alternativamente, estimar el diámetro de la gota mediante la inyección de un volumen en una gota de aceite mineral sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio con una barra de escala. El diámetro de la gota debe ser de aproximadamente 0,10 mm, que es aproximadamente un volumen de 1 nl.
- Ajuste el tamaño de la gota ajustando la configuración de la duraciónla microinyector o por el recorte de más de la punta de la aguja con unas pinzas finas. Tenga en cuenta que el tiempo de inyección debe ser de entre 20 - 35 mseg para evitar causar demasiado daño tisular.
- Usando una pipeta de transferencia de plástico, la transferencia de 12 anestesiaron las larvas en cada pocillo del molde de inyección.
- Usar una varilla de vidrio, bucle de cabello, o punta de plástico para colocar suavemente las larvas para que las cabezas apuntan hacia la parte posterior del microscopio y los sacos de yema de huevo se contra el lado izquierdo del pozo. El punto de la oreja izquierda de la larva hacia el techo.
- Mirando a través de la lente ocular del microscopio estereoscópico, utilice los mandos en el micromanipulador para alinear la aguja cargada con la vesícula ótica para que ambos están en el mismo campo de visión. Pierce la capa epitelial externa de la vesícula ótica con la punta de la aguja de modo que la punta de la aguja es justo dentro de la vesícula.
- Pulse en el pedal de pie para inyectar 1 nl de la dosis deseada de S. iniae. Asegúrese de utilizar unbaja presión suficiente para no romper la cavidad. Si la inyección es exitosa, la vesícula ótica, pero no el tejido circundante, deben llenar con el fenol rojo inóculo (Figura 1 Ai). Quitarse de inmediato toda pescado mal inyectado desde la placa de inyección.
- Retraer con cuidado la aguja de la larva y mover la placa de inyección con la mano para que la próxima larva está a la vista. Haga esto con una lupa 5X.
Nota: La retracción de la aguja puede dar lugar a la deposición de algunas bacterias fuera de la vesícula ótica, que pueden sesgar la supervivencia y el reclutamiento de leucocitos resultados. Para evitar esto, se recomienda para inyectar bacterias marcados con colorante fluorescentes y visualmente escanear larvas se inyecta bajo un microscopio de fluorescencia para eliminar cualquier larvas donde esto ha ocurrido. Una larva inyecta correctamente se muestra en la (Figura 1 Bi). - Para asegurar el volumen de inyección / inóculo sigue siendo la misma en el transcurso del experimento, inyectar una gota de las s bacterianasUSPENSIÓN en un tubo de 1,7 ml de centrífuga que contiene 100 l de PBS estéril después de cada 48ª embrión. Placa de los 100 l en placas de agar THY + P a 37 ° C durante la noche para determinar la CFU en el volumen de inyección.
- Cuando se ha inyectado todo el grupo de 12 larvas en la rampa de inyección, utilizar cuidadosamente una pipeta de transferencia de plástico para eliminar las larvas de los pocillos y colocarlos en una nueva placa de Petri (35 x 10 mm 2). Retire la solución tricaína y reemplazar con aproximadamente 2 ml de medio E3 fresco para permitir que las larvas se recupere.
- Pipetear inyecta larvas en los pocillos individuales de una placa de 96 pocillos y se incuba a 28,5 ° C. Monitorear las larvas en el tiempo de supervivencia en estas placas o eliminar más adelante para el recuento de imágenes o UFC.
7. Negro Sudán tinción de neutrófilos
Nota: Los siguientes pasos se pueden realizar a temperatura ambiente en una pequeña placa de Petri (35 x 10 mm 2) en un agitador orbital a menos otherwise declaró. Para cada paso, la cantidad de reactivo utilizado es de aproximadamente 2 ml por placa, utilizando sólo lo suficiente de líquido para cubrir completamente las larvas.
- Para la fijación de larvas infectadas, utilice una pipeta Pasteur de vidrio para eliminar medio E3 y reemplazarlo con un 4% de paraformaldehído helada en solución de PBS. Colocar inmediatamente el pescado a 4 ° C para la eutanasia. Fijar la noche a 4 ° C.
- Lavar 3 veces en PBS durante 5 min cada uno.
- Mancha con Negro Sudán (0,18% stock diluido 1: 5 en 70% de etanol, 0,1% de fenol) durante 30 min a 5 h. Utilice un microscopio estereoscópico para comprobar si gránulos de los neutrófilos han asumido la mancha.
- Realizar una serie de 5 min lavados a partir de un único lavado en etanol al 70% seguido de un único lavado de una relación de 1: 1 de etanol al 70% y PBS, seguido de un lavado final en PBS.
- Rehidratar en PBS más 0,1% de Tween (PBT).
- Para borrar el pigmento de las larvas, lavar en hidróxido de potasio / 1% de peróxido de hidrógeno al 1% durante aproximadamente 6-10 min. Supervisar el Closel muestray, y después de unos 5 minutos, comprobar las larvas bajo un microscopio estereoscópico para ver cuánto del pigmento se ha compensado. Si la solución se deja demasiado tiempo, las bolsas de la yema se hinchan y se rompen.
- Lavar 3 veces durante 5 minutos cada uno en PBS.
- Almacenar las muestras en PBS o PBT a 4 ° C durante un máximo de 1 semana hasta que esté listo para la imagen y contar.
- Para imagen manchada-Negro Sudán larvas, transferir el pescado en PBT y luego en el 80% de glicerol y colocar en una sola diapositiva depresión cavidad. Posición fija larvas bajo un microscopio estereoscópico con una punta de pipeta. Image usando una cámara digital de color en un estereomicroscopio (Figura 1 Aii-iv).
8. La enumeración de bacterias viables de larvas infectadas
- La eutanasia a las larvas en los momentos deseados después de la infección en una solución de 200-300 mg / L enfriada con hielo de tricaína en un medio de E3.
- Pipet eutanasia larvas en 1,7 ml tubos de centrífuga. Retire la solución tricaína y reemplazar con 100 l de 0,2%Triton X-100 en PBS (PBSTx).
- Homogeneizar larvas pasando arriba y hacia abajo 10 veces a través de una aguja de 27 G.
- Preparar diluciones seriadas de homogeneizados en PBS estéril. Por ejemplo, si la dosis infecciosa es 100 CFU, pipeta 100 l de homogeneizado en 900 l de PBS estéril. Usando una nueva punta de pipeta, transferir 100 l de homogeneizado diluido en 900 l de PBS estéril.
- Placa 100 l de las diluciones en agar Columbia CNA para el aislamiento selectivo de bacterias gram-positivas, y se incuba a 37 ° C durante 48 horas. Este medio proporcionará una mayor selección de las placas de agar THY + P, que apoyarán el crecimiento de las bacterias gram-negativas y gram-positivas.
- En las placas con menos de 500 colonias individuales, contar el número de colonias y se multiplica por el factor de dilución para determinar el número de CFU.
9. La fijación de las larvas de la Imagen
- Fijar las larvas en un 4% de paraformaldehído helada en solución PBS como dedescrito en la sección 7.
- A temperatura ambiente, se lava 3 veces durante 5 min cada uno en PBS antes de formación de imágenes.
Preparación 10. de larvas de imágenes en vivo
- Preparar una solución de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5% en E3 calentando en el microondas hasta que la solución es clara.
- Coloque solución de agarosa en un 55 ° C baño de agua para que se enfríe, pero no se endurezca.
- Añadir tricaína a la agarosa a una concentración final de 0,016%.
- Con una pipeta de transferencia de plástico, coloque 4-5 larvas anestesiado en un plato con fondo de cristal en el escenario de un microscopio estereoscópico.
- Retire la tricaína y solución de agarosa del baño de agua a 55 ° C y dejar enfriar a temperatura ambiente durante 1-2 minutos. Mientras que la agarosa se está enfriando, eliminar la mayor cantidad de líquido de las larvas anestesiado posible.
- Verter la agarosa enfriada en el plato hasta aproximadamente la mitad de la superficie está cubierta. Agitar el plato para difundir la agarosa. Tenga en cuenta que si la agarosaes demasiado caliente, se matan las larvas. Además, si demasiado agarosa se añade al plato, la lente del objetivo del microscopio puede golpear la parte inferior del plato cuando se enfoca a través de la agarosa.
- Con una pipeta de transferencia, recoger las larvas que han flotado a los lados del plato y pipeta de nuevo en el centro.
- Bajo el microscopio estereoscópico, coloque suavemente las larvas como se desee con un lazo de pelo, una punta de pipeta largo o una varilla de vidrio. Para obtención de imágenes de la vesícula ótica, posicionar las larvas de manera que la vesícula ótica izquierda es plana contra la parte inferior del plato.
- Deje enfriar la agarosa durante unos 10 minutos antes de mover el plato. Las larvas pueden cambiar de posición si la agarosa no es sólida. Pipetear suavemente algunos tricaína y la solución de E3 a la parte superior de la capa de agarosa para mantenerlo húmedo.
11. Confocal Imaging de la infección
- Coloque el plato de fondo de vidrio con larvas en el escenario de un microscopio invertido con un escaneo láser confoca-FV 1000l sistema.
- Ajuste el agujero de alfiler a 200-300 micras y usando una apertura numérica 0.75 / 20X lente del objetivo, fijado z-pilas con 3-6 micras rodajas.
- Utilice la exploración línea continua para ajustar la ganancia de potencia láser y el detector para cada canal.
- Usando análisis de la línea secuencial para cada canal de fluorescencia (por ejemplo, 488 y 543 nm) y de contraste de interferencia diferencial (DIC), llevar a cabo una película de lapso de tiempo de la vesícula ótica izquierdo cada 3 min para 2-6 hr para observar el reclutamiento inicial y la fagocitosis por los neutrófilos y macrófagos. Para los cursos de tiempo más largos, coloque una tapa en la placa de Petri para evitar la evaporación y secado de la agarosa.
- Adquirir imágenes fijas de fijo (Figura 1B) o en vivo (Figura 2) larvas en 20X o 40X.
12. Fotoconversión de marcado con Dendra2 leucocitos en la vesícula ótica
Nota: Dendra2 puede photoconverted de verde a fluorescencia rojapor enfocar un láser 405 nm (50-70% de la potencia de láser debe ser suficiente) en la región de interés (ROI) durante 1 min. A continuación se muestra el protocolo paso a paso utilizado para el sistema FV-1000 confocal de barrido láser:
- Visualice la muestra usando una exploración z-stack con los 488 nm y 543 nm láseres. Utilice la exploración línea continua para ajustar la ganancia de potencia del láser y el detector. Asegúrese de que no hay fluorescencia roja photoconverted accidentalmente.
- En la ventana "Control de imagen de adquisición", bajo "Estímulo Setting" seleccione la herramienta "Uso del escáner" y seleccione "principal". Seleccione el láser de 405 nm y la puso en el poder el 70%. Utilizando la opción de círculo, definir el retorno de la inversión en la vesícula ótica.
- En "Estímulo Inicio Configuración", seleccione "Activación en serie" con una activación previa de 1 marco y un tiempo de activación de 60 000 ms. En la ventana de "Adquisición Setting" bajo el "tiempo de escán de la partida", elija 2 enintervalos de 00:01:00 (uno para pre y uno para fotoconversión post-).
Nota: Después de la exploración serie lapso de tiempo se ha completado, el Dendra2 debería haberse photoconverted a su estado fluorescente de color rojo. - Analiza la muestra por un z-pila usando el 488 nm y 543 nm láser para visualizar la fluorescencia roja photoconverted así como cualquier fluorescencia verde restante (Figura 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La microinyección de S. iniae en la vesícula ótica (Figura 1 y Figura 2) resulta en una respuesta del huésped localizado inicialmente. Cuando se inyecta correctamente, las bacterias sólo deben verse en la vesícula ótica y no en el tejido circundante o de la sangre. Esto puede ser visualizado durante la microinyección usando fenol colorante rojo (Figura 1A). Alternativamente, si se inyectan bacterias marcadas, un análisis rápido de las larvas infectadas publicar inmediatamente la inyección puede confirman las bacterias son sólo en la vesícula ótica y no el tejido circundante (Figura 1B). Aunque una dosis tan poco como 10 UFC tipo salvaje S. iniae es capaz de establecer una infección letal dentro de 24-48 horas después de la infección (hpi), la inyección de 1.000 UFC de una cepa no virulenta, cpsA, no da lugar a la infección letal y que la cepa parece incapaz de proliferar en el huésped 24. Así, este modelo de infección localizada es capaz de differentiate entre las cepas bacterianas de la virulencia alterada.
Sitios microinyección de infección localizada inicialmente son útiles para el estudio de la quimiotaxis de leucocitos. El reclutamiento de leucocitos puede ser cuantificado por cualquiera de tinción Negro Sudán de gránulos de los neutrófilos (Figura 1A) o formaldehído fijación de líneas transgénicas fluorescentes (Figura 1B). Para visualizar el reclutamiento y capacidades fagocíticas de las células inmunes, se utilizaron líneas transgénicas que expresan la proteína verde fluorescente Dendra2 específicamente en los macrófagos Tg (MPEG1: Dendra2) 24 o neutrófilos Tg (mpx: Dendra2) 12. Cuando S. iniae se inyecta en la vesícula ótica de 3 larvas dpf, neutrófilos y macrófagos son reclutados rápidamente dentro de la primera 2 hpi (Figura 1). Sin embargo, cuando se realiza correctamente, la microinyección de PBS en la vesícula ótica no da lugar a la misma el reclutamiento de leucocitos robusta de acogida (
Figura 2: La fagocitosis de S. iniae por los fagocitos en la vesícula ótica mpx transgénicos:. Dendra2 (A) o MPEG1: Dendra2 (B) larva infectada con S.-rojo rotulado iniae (representado en magenta) y fotografiado después de la infección de 60 minutos utilizando un láser scanning microscopio confocal. Barra de escala, 30 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Fotoconversión de los macrófagos en la vesícula ótica 5 hpi con S. iniae. Los macrófagos (representado en verde) en la vesícula ótica, designados por el círculo (A), se photoconverted (B) utilizando un láser de 405 nm en un microscopio confocal y seguimiento en el tiempo. Por 24 hpi, macrófagos photoconverted (representado en magenta) han migrado hasta el tronco / tejido hematopoyético caudal (C); barra de escala, 50 micras. Aumentos más altos de las regiones encuadradas en C se muestran en (i) y (ii), barra de escala de 30 micras; flechas apuntan a photoconmacrófagos convertida. Células Photoconverted aparecen blancos debido a la resultante de la fusión 543 nm fluorescencia roja y cualquier remanente de 488 nm fluorescencia verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El método de infección utilizado aquí es útil para el estudio de la respuesta inmune del huésped a una infección localizada inicialmente en 2-3 embriones y larvas dpf. El enfoque de un estímulo inflamatorio, como una infección, en una cavidad cerrada, como la vesícula ótica permite el estudio de neutrófilos y macrófagos quimiotaxis y la fagocitosis. Una advertencia de la inyección de bacterias en la vesícula ótica es que la capacidad de los neutrófilos para fagocitar eficazmente las bacterias en cavidades llenas de líquido puede ser dependiente en el microbio particular. Aunque Escherichia coli y Bacillus subtilis no son fácilmente fagocitadas por los neutrófilos en la vesícula ótica 28, hemos encontrado que los neutrófilos son capaces de fagocitar tanto Pseudomonas aeruginosa y S. iniae en esta ubicación 16, 24. La infección localizada también es útil en el estudio de la invasividad de diversos patógenos. Con el fin de causar una infección después de i sistémicanjection en una cavidad cerrada, como la vesícula ótica, el microbio que debe ser capaz de atravesar las barreras host físicos. Alternativamente, diferentes patógenos pueden basarse en las células huésped para el transporte y la difusión desde el sitio inicial de la infección. Esto hace que las inyecciones localizadas útiles para comparar las cepas de virulencia alterada.
Durante la microinyección, para evitar las bacterias sedimentación y la obstrucción de las agujas, agujas de cambio, ya sea después de cada condición o después de aproximadamente 50 larvas. Esto ayudará a asegurar la suspensión de la aguja es más uniforme. Si la solución de bacterias en la aguja parece ser un problema, una mezcla de PBS, 2% PVP40, y 10% de glicerol puede ayudar a mantener una suspensión homogénea. Para asegurar que cada larva se inyecta con aproximadamente el mismo número de bacterias, revisar los recuentos de CFU por homogeneización de una larva inmediatamente después de la inyección y enchapado el homogeneizado en agar CNA. Agar CNA seleccionará para el crecimiento de bacterias gram-positivas cultivables, no sóloS. iniae, pero va a dar una idea de cómo es constante la dosis de inyección son entre cada larva individual. Con un inóculo objetivo de 100 CFU por larva, hay típicamente entre 75-150 colonias en una placa CNA. El número de no-S. colonias grampositivos iniae que crecen en una placa de la CNA es probablemente muy bajo, ya que la mayoría de PBS inyectado peces suele dar lugar a entre 0-20 colonias. En posteriores puntos de tiempo durante la infección, no es raro para que haya variación de hasta la mitad de un log en los recuentos de colonias entre las larvas infectadas con la misma dosis infecciosa. Esto podría representar ligeras diferencias entre larva individual en su capacidad para controlar la infección o podría reflejar diferencias en la cantidad de bacterias gram-positivas cultivables en las larvas o medio E3.
Mientras que la inyección en la vesícula ótica, es importante no inyectar un volumen demasiado importante o con una presión demasiado elevada ya que esto puede causar la cavidad a la ruptura. Los volúmenes de inyección shoULD mantenerse a aproximadamente 1 nl. Si la aguja es demasiado grande, la microinyección puede causar daños en el tejido circundante, lo que puede afectar el reclutamiento de leucocitos de acogida para el sitio de infección o puede permitir que las bacterias se filtran de la vesícula ótica. También es importante confirmar inyección en el espacio correcto. Si se inserta la aguja demasiado profunda, puede empujar a través de la vesícula ótica o puede golpear a los vasos sanguíneos que fluyen alrededor de la vesícula ótica. Esto puede conducir a la deposición de bacterias en el torrente sanguíneo o fuera de la vesícula, que puede alterar las respuestas del huésped.
También es posible que cuando se extrae la aguja, algunas bacterias pueden depositarse accidentalmente fuera de la vesícula ótica, como se muestra por Colucci-Guyon et al. 28, pero encontramos que esto sólo será el caso en menos de 5% de las inyecciones. Tratando de inyectar en el centro de la vesícula ótica puede ayudar a evitar esta situación. En una infección exitosa, la vesícula ótica debe llenarse wITH el colorante rojo de fenol, pero el colorante no debería filtrarse hacia los tejidos circundantes. Cualquier larvas mis-inyectado debe desecharse inmediatamente. La inyección de bacterias marcadas es una forma útil para confirmar una inyección de éxito (Figura 1B). Una de las desventajas de usar un tinte CellTracker es que este colorante se convertirá diluido como las bacterias se dividen, eventualmente evitando que las bacterias se visualizaron bajo fluorescencia. Elegimos un tinte rojo porque utilizamos neutrófilos con la etiqueta verde y líneas transgénicas macrófagos para la mayoría de nuestros estudios.
Dendra2 es una proteína derivada de fotoconvertible octocoral Dendronephthya sp. que puede ser photoconverted de un verde a un estado fluorescente de color rojo con un láser de 405 nm 29. Este fotoconversión es una forma no invasiva para marcar células y rastrear su destino en el transcurso de la infección. Los leucocitos reclutados al sitio de la infección pueden photoconverted y siguieron a lo largo del tiempo para controlar su dIFUSIÓN largo de los tejidos del huésped (Figura 3). Alternativamente, los leucocitos pueden estar photoconverted antes de la infección y luego monitoreados post-microinyección para determinar el origen de las células reclutadas en el sitio de la infección. Bacterias etiquetado y las células inmunes permite el estudio de las interacciones leucocito-patógeno en vivo, incluyendo la contratación y la fagocitosis (Figura 1B y la Figura 2). Distinguir el S. rojo etiqueta iniae de la fluorescencia roja de un leucocito photoconverted es difícil, por lo que un colorante fluorescente diferente CellTracker podría ser utilizado. Esto sería particularmente útil para determinar cuáles de las células inmunes photoconverted que salen de la vesícula ótica contiene S. iniae.
Las futuras aplicaciones del método de infección vesícula ótica podrían incluir la medición de la velocidad y la direccionalidad por el cual los neutrófilos y los macrófagos se mueven en respuesta a diversas infecciones. La infección kinetics también se puede estudiar para ver qué tipos de células son los primeros en llegar a un lugar de la infección y que tipos de células son más robustamente reclutados, además de que las células se originan o donde se difunden 30. Además de estudiar el reclutamiento a una infección localizada inicialmente, este modelo de infección se puede utilizar para estudiar la función de los componentes del sistema inmune huésped durante la infección inicial. Oligonucleótidos de morfolino antisentido que se dirigen a ARN específicos pueden ser usados para derribar expresión de los componentes inmunes del huésped, incluyendo los receptores de tipo Toll, receptores de citoquinas y leucocitos, y CRISPR-cas o tecnología TALEN se pueden utilizar para crear mutantes genéticos. La expresión génica utilizando RNAseq o qPCR también puede ser utilizado para caracterizar la expresión de ciertos genes del huésped en respuesta a la infección.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio para el cuidado y mantenimiento de pez cebra. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud, Premio Nacional de Servicio de Investigación A155397 a EA Harvie y NIH R01GM074827 a Anna Huttenlocher.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml Eppendorfs | MidSci | AVSS1700 | |
| 14 ml Falcon tube | BD Falcon | 352059 | |
| 27 G x ½ in. needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 96-well Plate | Corning Incorporated | 3596 | |
| Agar | BD Biosciences | 214030 | |
| CellTracker Red | Molecular Probes, Invitrogen | C34552 | |
| CNA agar | Dot Scientific, Inc | 7126A | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-7m | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ethanol 200 proof | MDS | 2292 | |
| Fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gel comb | VWR | 27372-482 | 4.2 mm width, 1.5 mm thick |
| Glass bottom dishes | Custom made by drilling a 16 - 18 mm hole in the center of a 35 mm tissue culture dish bottom and placing a 22 mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light. | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| High melt agarose | Denville Scientific, Inc. | CA3510-6 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | with FV-1000 system | |
| Low melt agarose | Fisher | BP165-25 | |
| Magnetic stand | Tritech (Narishige) | GJ-1 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipet tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | Tritech (Narishige) | M-152 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Nanodrop spectrophotmeter | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 100 x 15 mm |
| Phenol | Sigma Aldrich | P-4557 | |
| Phenol Red | Ricca Chemoical Company | 572516 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Potassium hydroxide | Sigma Aldrich | P-6310 | |
| Pronase | Roche | 165921 | |
| Protease peptone | Fluka Biochemika | 29185 | |
| Small cell culture dish | Corning Incorporated | 430165 | 35 x 10 mm |
| Sudan Black | Sigma Aldrich | S2380 | |
| Thin wall glass capillary injection needles | World Precision Instruments, Inc. | TW100-3 | |
| Todd Hewitt | Sigma Aldrich/Fluka Analytical | T1438 | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | Argent Chemical Laboratory/Finquel | C-FINQ-UE-100G | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast extract | Fluka Biochemika | 92144 |
References
- Agnew, W., Barnes, A. C. Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination. Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).
- Danilova, N., Steiner, L. A. B cells develop in the zebrafish pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish. Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).
- Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).
- Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis. Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).
- Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio. Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).
- Meijer, A. H., et al. Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish. Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).
- Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio). Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).
- Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS ONE. 6 (2), e16779 (2011).
- Veneman, W. J., Marín-Juez, R., et al. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury. Cell. Microbiol. , (2012).
- Sar, A. M., et al. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. New York, NY. (2002).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).
- Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae. Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).
- Haddon, C., Lewis, J. Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
- Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -Y., Phillips, B. Development of the zebrafish inner ear. Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
- Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
- Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).
