Abstract
Vattenmiljön patogen, Streptococcus iniae, ansvarar för över 100 miljoner dollar i årliga förluster för vattenbruksnäringen och kan orsaka systemisk sjukdom i både fiskar och människor. En bättre förståelse av S. iniae sjukdom patogenes kräver ett lämpligt modellsystem. Den genetiska spårbarhet och optisk transparens av de tidiga utvecklingsstadier zebrafisk möjliggör generering och icke-invasiv avbildning av transgena linjer med fluorescerande taggade immunceller. Den adaptiva immunsystemet inte är fullt fungerande förrän flera veckor efter befruktning, men zebrafisk larver har en bevarad ryggradsdjur medfödda immunsystemet med både neutrofiler och makrofager. Således generering av en larvinfektionsmodell möjliggör studier av specifika bidrag medfödd immunitet i att kontrollera S. iniae infektion.
Platsen för mikroinjektion kommer att avgöra om en infektion ärsystemisk eller initialt lokaliserade. Här presenterar vi våra protokoll för öron vesikler injektion av zebrafisk åldern 2-3 dagar efter befruktning liksom våra tekniker för fluorescerande konfokal avbildning av infektion. En lokal infektion webbplats tillåter observation av initial mikrob invasion, rekrytering av värdceller och spridning av infektioner. Våra iakttagelser med hjälp av zebrafisk larver modell av S. iniae infektion indikerar att zebrafisk kan användas för att undersöka de olika bidragen från värd neutrofiler och makrofager i lokaliserade bakterieinfektioner. Dessutom beskriver vi hur photolabeling av immunceller kan användas för att spåra enskilda värdcell öde under infektionsförloppet.
Introduction
Streptococcus iniae är en stor vattenlevande patogen som kan orsaka systemisk sjukdom i både fisk och människa en. Medan S. iniae ansvarar för stora förluster i fiskodlingsindustrin, är det också en potentiell zoonotisk patogen, kan orsaka sjukdom hos immunsupprimerade mänskliga värdar med kliniska patologier som liknar dem som orsakas av andra streptokock humana patogener. Med tanke på dess likheter med mänskliga patogener, är det viktigt att studera S. iniae sjukdom patogenes i samband med en naturlig värd. En vuxen zebrafisk modell av S. iniae infektion avslöjade robust infiltration av värd leukocyter till lokala infektionsstället samt en snabb tid som värd döden, till en tid för kort involverar det adaptiva immunsystemet 7. För att få en fördjupad undersöka det medfödda immunsvaret mot S. iniae infektion in vivo, är det nödvändigt att använda en modell som är mer mottaglig för non-invasiv levande avbildning.
Larver zebrafisk har ett antal fördelar som gör det till en alltmer attraktivt ryggradsdjur modell för att studera värd patogen interaktioner. Zebrafisk är relativt billiga och enkla att använda och underhålla jämfört med däggdjursmodeller. Adaptiv immunitet är inte funktionellt mogna förrän 4-6 veckor efter befruktningen, men larver har en mycket konserverad ryggradsdjur medfödda immunförsvaret med komplement, Toll-liknande receptorer, cytokiner och neutrofiler och makrofager med antimikrobiella kapacitet inklusive fagocytos och andnings burst 2-6, 8-11. Dessutom genetiska spårbarhet och optisk transparens av de embryonala och larvutvecklingsstadier möjliggör generering av stabila transgena linjer med fluorescerande immunceller som gör det möjligt att undersöka värd-patogen interaktioner i realtid in vivo. Genereringen av dessa transgena linjer med ett photoconvertible protein som Dendra2 möjliggör spårning av enskilda värdcell ursprung och öde under loppet av infektionen 12.
När man utvecklar en zebrafisk larver infektionsmodell, kommer den valda platsen för mikroinjektion avgöra om en infektion är initialt lokal eller systemisk. Systemiska blodinfektioner i kaudalvenen eller Kanal av Cuvier används oftast för att studera mikrobiella patogener i zebrafisk och är användbara för att studera interaktioner mellan värd och mikrobiella celler, cytokinsvar, och skillnader i virulens mellan patogenstammar. För långsammare växande mikroorganismer, kan tidig injektion i gulesäcken av ett embryo i 16-1,000 cellstadiet användas för att generera en systemisk infektion 13,14, med den optimala utvecklingsstadium för mikroinjektion av en långsamt växande mikroorganism befunnits vara mellan den 16-128 cellstadiet 15. Men gulesäcken injektioner av många mikrober i senare skeden av värdutvecklingen tenderar att vara dödlig till than värd på grund av näringsrika miljö för mikroben och brist på infiltrerande leukocyter 16-18.
En lokal infektion resulterar vanligen i riktad migration av leukocyter mot infektionsstället som lätt kan kvantifieras med icke-invasiv avbildning. Denna typ av infektion kan medge dissekering av de mekanismer som förmedlar leukocytmigrering samt utredning av olika flyttande och fagocytiska kapacitet olika leukocytpopulationer. Lokala infektioner är också användbara vid granskningen skillnader i virulens mellan bakteriestammar samt studera mikrob invasion mekanismer eftersom fysiska värd hinder måste korsas för en lokal infektion blir systemisk. Zebrafisk är vanligtvis upp vid temperaturer på 25-31 ° C 19, men de kan också hållas vid temperaturer så höga som 34-35 ° C för studier av invasions av vissa mänskliga patogener med stränga krav på temperaturför virulens 20, 21.
Många olika platser har använts för att generera en initialt lokaliserad bakteriell infektion inklusive bakhjäman ventrikeln 22, rygg svans muskel 18, perikardiell hålighet 23, och öron vesikler (öra) 5, 16, 24. Det har emellertid visat sig, att injektion av bakterier in svans muskel kan orsaka vävnadsskada och inflammation oberoende av de bakterier, som kan skeva resultat vid utredning leukocyt svar 13. Även mindre skador är associerad med injektion i bakhjäman och även om det är en början saknar leukocyter i unga embryon, bakhjäman ventrikeln vinner stadigt mer immunceller med tiden som mikroglia att bosätta. Bakhjäman ventrikeln är också en svårare plats till bilden. Öron vesikler är en sluten ihålig hålrum utan direkt tillgång till kärl 25, 26. Den är normalt saknar leukocytes, men leukocyter kan rekryteras till öron vesikler som svar på inflammatoriska stimuli såsom infektion. Det är också ett föredraget område av mikroinjektion av bakterier i zebrafisk i åldern 2-3 dagar efter befruktning (dpf) på grund av den lätthet med avbildning och visualisering av injektionen. Därför valde vi öron vesikler som vår webbplats för lokal bakteriell infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vuxna och embryonala zebrafisk bibehölls i enlighet med University of Wisconsin-Madison Research Animal Resources Center.
1. Förbereda mikroinjektion Needles
- Förbered tunt vägg glaskapillär injektionsnålar (1,0 OD / 0,75 ID) med hjälp av en mikropipett avdragare enhet med följande inställningar: lufttryck 200, värme 502, pull 90, hastighet 80, tid 70, sändningstid i början på drag 5, sändningstid vid slutet av drag 5.
- Med fin pincett, bryta av spetsen på drog nålen så att spetsöppningen har en diameter på ungefär 10 um.
2. Förbereda Larv Injection Rätter
- Skölj en gel kam med körfältsbredd på ca 4-5 mm i sterilt vatten och låt torka.
- Förbered en 1,5-2% hög smält agaroslösning i E3-medium 19 och mikrovågsugn tills lösningen är klar. När svalnat, häll lite av agarosen i en petriskål (100 x 15 mm) och snurra,lägga precis tillräckligt agaros att helt täcka botten av skålen.
- När agarosen lagret har stelnat, placera sköljda och torkade gel kam på toppen så att den icke-kammade änden är bara vilar på toppen av petriskålen och kammade änden vidrör agaros. Se till att kammen är så horisontell som möjligt, vilket skapar en 30 ° vinkel med avseende på botten agarosskikt.
- Häll en ytterligare liten mängd agaros vid gränsytan mellan kammen och botten agaros skikt så att den färska agaros skiktet täcker brunnarna i kammen. Låt svalna helt innan du tar bort kammen. Med hjälp av en pipett spets, ta bort alla överhängande delar av agaros från brunnarna.
- Pour E3 medium på toppen av sprutformen och förvara vid 4 ° C.
- Före varje användning, ersätta med färska medelstora och varma injektions ramper vid 28,5 ° C i minst en timme före injektion.
- Omedelbart före injektioner, ersätta E3 på insprutningsrampen medE3-medium innehållande 200 | ig / ml etyl 3-aminobensoat (tricaine).
3. Förbereda S. iniae Inokulat
- Förbered och autoklavera Todd Hewitt-buljong-medium kompletterat med 0,2% jästextrakt och 2% proteospepton (THY + P): 30 g / L Todd Hewitt, 2 g / L jästextrakt, 20 g / L proteospepton. För agarplattor, tillsätt 14 g / L-agar.
- Förbered bakteriekulturer kvällen innan infektioner av pipet en 100 pl alikvot av frysta bakteriell lager i 10 ml THY + P buljong i en förseglad 15 ml tub. Inkubera över natten utan omröring vid 37 ° C. Efter 14-16 timmar av tillväxt, använd natten kultur antingen göra fryslager eller förbereda för användning i injektioner.
- Gör fryslager genom att placera 1 ml av den över natten odlade kulturen i 500 ul av 80% glycerol i en 1,7 ml centrifugrör. För att undvika frys-tö-cykler, gör 100 il en användning portioner från denna blandning och förvara vid -80 ° C.
- För S. iniae används i infections, späd den över natten odlade kulturen 1: 100 för en total volym av 10 ml kultur genom tillsats av 0,1 ml av övernattskultur till 9,9 ml THY + P buljong. Odla vid 37 ° C utan omrörning under ca 4-5 h. Övervaka den optiska densiteten (OD) vid 600 nm med användning av en Nanodrop spektrofotometer och skörda bakterien i mitten av logaritmisk fas när OD600 nm når 0,250-0,500. En OD600 nm av 0,250 motsvarar ungefär 10 8 kolonibildande enheter (CFU) / ml.
- Pellets 1 ml av bakteriekulturen i en 1,7 ml centrifugrör vid 1500 xg under 5 minuter. Resuspendera i 1 ml färsk PBS och upprepa. Mät OD600 nm av bakterierna i PBS, till pellets, och återsuspendera i PBS uppnå den önskade koncentrationen.
- För att hjälpa till vid visualisering av mikroinjektion, tillfenolrött till de bakteriella suspension före injektion för en slutlig koncentration av 0,1%.
- För försök med injektion av värmeavdödade bakterier, värm bakterierna i PBS vid 95 ° C under 30 minuter.Kontrollera att värme avlivning minskat antalet livskraftiga bakterier till omätbara nivåer genom plätering en injektionsvolym (ca 1 nl) på fast THY + P agarplattor och inkubera över natten vid 37 ° C.
4. Märkning S. INIA e med en Celltracker Röd fluorescerande färg
- Att märka levande bakterieceller, bereda en stamlösning av en Celltracker fluorescerande färgämne eller motsvarande. Som färgämnet användes kommer i 20 x 50 | ig alikvoter av pulver och måste återsuspenderas i DMSO, tillsätt 7,3 | il DMSO till röret för att erhålla en 10 mM förrådskoncentration.
- Testa ett intervall av färgämneskoncentrationer (t.ex. från 0,5 till 25 | iM) på bakterierna för att bestämma den lägsta optimala koncentrationen som färgar cellerna. Snabbt delande celler och längre experiment kan kräva en högre koncentration av färgämne.
- Pellets 1,0 ml bakteriekultur i en 1,7 ml rör genom centrifugering såsom beskrivits ovan (avsnitt 3). Återsuspendera pelleten i 1ml ny PBS och tillsätt rätt volym av färgämne till bakteriekulturen.
- Inkubera utan omröring vid 37 ° C under 30 minuter. Centrifugera ner bakterierna och återsuspendera i 1 ml förvärmd THY + P buljong och inkubera utan omröring under ytterligare 30 min vid 37 ° C.
- Spinn ner bakterierna och tvätta två gånger i PBS före mäta OD600 nm och späda bakterierna för mikroinjektion som beskrivs ovan (avsnitt 3). Vi injicerar vanligen cirka 100 CFU i 1 nl injektionsvolym för våra studier av leukocytrekrytering och fagocytos.
5. Beredning av Zebrafish Larver för infektioner
- Ställ in häckande par kvällen innan och samla embryon som beskrivs av Rosen et al. 27 Inkubera embryon i E3 medium vid 28,5 ° C tills den ska infektera.
- För zebrafisk som kommer att avbildas, förhindra utvecklingen av pigment (melanin) genom att tillsätta N-fenyltiourea (PTU) tillE3-medium vid 24 h efter befruktning (HPF) för en slutlig koncentration av 0,2 nM.
- För infektioner som involverar embryon åldern 2 dpf, dechorionate embryon manuellt med ett par fina pincett. Alternativt dechorionate embryon genom att avlägsna E3 och ersätta med pronas (2 mg / ml) under ca 5 minuter eller tills försiktig pipettering bryter embryon ur chorion. De flesta larver borde ha kläckts naturligt av 3 dpf.
- Bedöva zebrafisk flera minuter innan infektionen genom att placera dechorionated larver i E3 medium innehållande 200 ug / ml tricaine.
6. öron vesikler Injektion av S. iniae in Three Day Old Larver
- Slå på microinjector och ställ in tidsintervallet till "millisekund". Öppna ventilen på koldioxidtanken för att låta gas in i ledningen. Trycket microinjector bör läsa ungefär 20 PSI. Justera trycket i microinjector enheten genom medurs vridning av svarta räfflade vredet för inkrlättade trycket eller moturs skärning för minskad tryck.
- Vortex beredda S. iniae kultur i fenolrött och PBS och använd en microspets för att ladda 2-3 pl av kulturen till en drog kapillär injektionsnål.
- Montera den laddade nålen på en mikromanipulator ansluten till en magnetisk monter och placera den under ett stereomikroskop så att nålen är i ungefär en 45-65 ° vinkel i förhållande till basen av mikroskop.
- Tryck på fotpedalen av microinjector att dispensera en droppe av inokulatet på spetsen av nålen. Mät diametern på droppen med hjälp av skalan bar i okularlinsen mikroskopets.
- Alternativt uppskatta diametern av droppen genom injicering av en volym i en droppe av mineralolja på en glasmikroskopskiva med ett skalfältet. Diametern på drop bör vara ungefär 0,10 mm, vilket är ungefär en 1 nl volym.
- Justera droppstorlek genom att justera längden inställningen påmicroinjector eller genom klippning av mer av nålspetsen med fina pincett. Observera att injektionstiden bör vara mellan 20-35 ms för att undvika att alltför mycket vävnadsskada.
- Med hjälp av en plast överföringspipett, överföring 12 sövda larver i varje brunn i sprutformen.
- Använd en glasstav, hår slinga, eller plastspets för att försiktigt placera larver så att huvudena pekade mot baksidan av mikroskopet och gulesäcken är emot den vänstra sidan av brunnen. Rikta vänstra örat av larven upp mot taket.
- Tittar genom okulär lins stereo, använd vreden på mikromanipulator att rada upp den laddade nålen med öron vesikler så att båda är i samma synfält. Pierce det yttre epitel lagret av öron vesikler med nålspetsen så att nålspetsen är innanför vesikler.
- Tryck på fotpedalen för att injicera 1 nl av den önskade dosen av S. iniae. Var noga med att använda entillräckligt låg tryck för att inte brista kaviteten. Om injektionen lyckas öron vesikler, men inte den omgivande vävnaden, bör fylla med fenolrött inokulat (Figur 1 Ai). Omedelbart avlägsnas mis-injicerade fisk från insprutningsplattan.
- Försiktigt dra in nålen ur larven och flytta insprutningsplattan för hand så att nästa larven är i sikte. Gör detta under 5X förstoring.
Anm: indragning av nålen kan resultera i avsättningen av vissa bakterier utanför öron vesikler, som kan skeva överlevnad och leukocytrekrytering resultat. För att undvika detta rekommenderas att injicera fluorescerande färgämnesmärkta bakterier och visuellt skanna injiceras larver under ett fluorescerande mikroskop för att avlägsna eventuella larver där detta har inträffat. En injiceras korrekt larv visas i (Figur 1 Bi). - För att säkerställa att injektionsvolym / inokulat förblir densamma under loppet av försöket, injicera en droppe av bakterie suspension i en 1,7 ml centrifugrör innehållande 100 l sterilt PBS efter varje 48: e embryo. Plate de 100 pl på THY + P agarplattor vid 37 ° C över natten för att bestämma CFU i insprutningsvolymen.
- När hela gruppen av 12 larver på insprutningsrampen har injicerats, försiktigt använda en plast överföringspipett att ta bort larverna från brunnarna och placera dem i en ny petriskål (35 x 10 mm 2). Avlägsna tricaine lösningen och ersätta med cirka 2 ml färskt E3 medium för att tillåta larverna att återhämta sig.
- Pipettera injicerade larver i enskilda brunnar i en 96-brunnars platta och inkubera vid 28,5 ° C. Övervaka larver över tid för överlevnad i dessa plattor eller ta bort senare för avbildning eller CFU räknas.
7. Sudan Black Infärgning av neutrofiler
Anm: Följande steg kan göras i rumstemperatur i en liten petriskål (35 x 10 mm 2) på en orbitalskakare såvida otherwise anges. För varje steg, är mängden reagens som används ca 2 ml per skål, med bara tillräckligt med vätska för att helt täcka larverna.
- För fixering av infekterade larver, använd en glas pasteurpipett att ta bort E3 medium och ersätta med en iskall 4% paraformaldehyd i PBS-lösning. Placera omedelbart fisken vid 4 ° C för att avliva. Fix natten vid 4 ° C.
- Tvätta tre gånger i PBS under 5 min vardera.
- Fläcken med Sudan Black (0,18% stam utspätt 1: 5 i 70% etanol, 0,1% fenol) under 30 min till 5 h. Använd en stereomikroskop för att kontrollera om neutrofila granulat har tagit upp fläcken.
- Utför en serie av fem minuterstvättar med början med en enda tvätt i 70% etanol följt av en enda tvätt av en 1: 1 förhållande av 70% etanol och PBS, följt av en slutlig tvätt i PBS.
- Rehydrera in PBS plus 0,1% Tween (PBT).
- För att rensa pigment från larver, tvätta i 1% kaliumhydroxid / 1% väteperoxid i ca 6-10 min. Övervaka prov Closely och efter ca 5 minuter, kontrollera larver under ett stereomikroskop för att se hur mycket av pigmentet har försvunnit. Om lösningen är kvar på för länge kommer gulsäckarna svälla och brista.
- Tvätta tre gånger under 5 minuter vardera i PBS.
- Förvara proverna i antingen PBS eller PBT vid 4 ° C i upp till 1 vecka tills den ska bilden och räkna.
- Till bilden Sudan Black-färgade larver, överföra fisken i PBT och sedan till 80% glycerol och placera på ett enda hålrum depression bild. Position fast larver under ett stereomikroskop med hjälp av en pipett spets. Bild med en färg digitalkamera på ett stereomikroskop (Figur 1 Aii-iv).
8. Räkning av levande bakterier från infekterade larver
- Euthanize larver vid önskade tidpunkter efter infektion i en iskall 200-300 mg / L lösning av tricaine i E3-medium.
- Pipet avlivas larver i 1,7 ml centrifugrör. Avlägsna tricaine lösningen och ersätt med 100 pl 0,2%Triton X-100 i PBS (PBSTx).
- Homogenisera larver genom att passera upp och ner 10 gånger genom en 27 G nål.
- Bered seriella utspädningar av homogenat i steril PBS. Till exempel, om den infektiösa dosen är 100 CFU, pipett 100 pl av homogenatet i 900 ul steril PBS. Med hjälp av en ny pipettspets, överföra 100 pl av det utspädda homogenatet i 900 l steril PBS.
- Plate 100 pl av utspädning på Columbia CNA agar för selektiv isolering av grampositiva bakterier, och inkubera vid 37 ° C under 48 h. Detta medium kommer att ge större utbud än THY + P agarplattor, som kommer att stödja tillväxten av både gramnegativa och grampositiva bakterier.
- På plattor med färre än 500 enskilda kolonier, räkna antalet kolonier och multiplicera med spädningsfaktorn för att bestämma antalet CFU.
9. Fixering av larver för Imaging
- Fix larver i en iskall 4% paraformaldehyd i PBS-lösning som debeskrivs i avsnitt 7.
- Vid rumstemperatur, tvätta 3 gånger för 5 min vardera i PBS innan avbildning.
10. Beredning av larver för Live Imaging
- Förbered en 1,5% låg smältpunkt agaroslösningen i E3 genom uppvärmning i mikrovågsugn tills lösningen är klar.
- Placera agaroslösning i en 55 ° C vattenbad för att låta det svalna, men inte stelna.
- Lägg tricaine till agarosen till en slutlig koncentration av 0,016%.
- Med hjälp av en plast överföringspipett, placera 4-5 sövda larver i ett glas nedre skålen på scenen av ett stereomikroskop.
- Avlägsna tricaine och agaroslösningen från 55 ° C vattenbad och låt den svalna i rumstemperatur i 1-2 min. Medan agarosen svalnar, ta bort så mycket vätska från bedövade larver som möjligt.
- Häll den kylda agarosen i skålen tills ungefär hälften av ytan är täckt. Snurra skålen att sprida agaros. Observera att om agarosenär för varmt, kommer det att döda larverna. Dessutom, om alltför mycket agaros tillsättes till skålen, kan objektivlinsen mikroskopets nått botten av skålen vid fokusering genom agarosen.
- Med hjälp av en pipett, plocka upp larverna som flöt på sidorna av skålen och pipettera dem tillbaka in i centrum.
- Under stereomikroskop, försiktigt placera larver såsom önskas med en hår slinga, en lång pipettspets eller en glasstav. För avbildning av öron vesikler, placera larver så att den vänstra öron vesikler är platt mot botten av skålen.
- Låt agarosen svalna under ca 10 min innan förflytta skålen. Larverna kan skifta positioner om agarosen inte är solid. Pipettera försiktigt några tricaine och E3 lösning till toppen av agarosen lager för att hålla den fuktig.
11. Confocal avbildning av infektion
- Placera glaset nedre skålen med larver på scenen av ett inverterat mikroskop med en FV-1000 laserskanning confocal systemet.
- Ställ hål till 200-300 nm och använda en numerisk bländare 0,75 / 20X objektiv, ställa z-stackar med 3-6 um skivor.
- Använd kontinuerlig linje scanning för att justera lasereffekten och detektor förstärkning för varje kanal.
- Använda sekventiell line scanning för varje fluorescens kanal (t.ex. 488 och 543 nm) och differential interferens kontrast (DIC), genomföra en time lapse film av den vänstra öron vesikler var 3 min för 2-6 timmar att observera själva rekryteringen och fagocytos av neutrofiler och makrofager. För längre tidsförlopp, placera ett lock på petriskålen för att förhindra avdunstning och uttorkning av agarosen.
- Förvärva stillbilder av fast (Figur 1B) eller bor (Figur 2) larver vid 20X eller 40X förstoring.
12. Photoconversion av Dendra2-märkt Leukocyter vid öron vesikler
Obs: Dendra2 kan photoconverted från grönt till rött fluorescensgenom att fokusera en 405 nm laser (50-70% lasereffekt bör räcka) på regionen av intresse (ROI) i 1 min. Nedan är det steg-för-steg-protokoll för FV-1000 laserskanning konfokala systemet:
- Visualisera provet med hjälp av en z-stack scan med 488 nm och 543 nm lasrar. Använd kontinuerlig linje scanning för att justera lasereffekten och detektorförstärkning. Kontrollera att det inte finns något misstag photoconverted röd fluorescens.
- På "Image Acquisition Control" fönstret, under "Stimulus inställning" välj "Använd Scanner" verktyget och välj "main". Välj 405 nm laser och ställa in den på 70% effekt. Använda cirkeln alternativet, definiera ROI i öron vesikler.
- Under "Stimulus börja ställa" Välj "Aktivering i serie" med en föraktivering av 1 ram och en aktiveringstid på 60.000 ms. På "Förvärv Setting" fönstret under "Time Scan rubriken" väljer 2 iintervaller på 00:01:00 (en för pre- och en för efter photoconversion).
OBS: Efter intervallserien skanningen är klar, borde Dendra2 ha photoconverted till sitt röda fluorescerande tillstånd. - Skanna provet genom ett z-stack med hjälp av 488 nm och 543 nm laser för att visualisera photoconverted röd fluorescens samt eventuellt kvar grön fluorescens (Figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroinjektion av S. iniae in öron vesikler (figur 1 och figur 2) resulterar i en initialt lokaliserade värdsvar. När det injiceras korrekt bör bakterierna endast ses i öron vesikler och inte i den omgivande vävnader och allt blod. Detta kan visualiseras under mikroinjektion användning av fenol rött färgämne (Figur 1A). Alternativt, om märkta bakterier injiceras, en snabb genomsökning av smittade larver omedelbart efter injektion kan bekräfta bakterierna är bara i öron vesikler och inte den omgivande vävnaden (Figur 1B). Även om en dos så lite som 10 CFU vildtyp S. iniae har möjlighet att upprätta en dödlig infektion inom 24 till 48 h efter infektion (HPI), injektion av 1000 CFU av en icke-virulent stam, cPSA, inte resulterar i dödlig infektion och att stammen verkar oförmögen att föröka sig i värden 24. Således är detta lokaliserad infektionsmodell kunna differentiate mellan bakteriestammar av förändrad virulens.
Mikroinjektion Sajter initialt lokal infektion är användbara för att studera leukocytkemotaxi. Leukocytrekrytering kan genom kvantifieras antingen Sudan Black färgning av neutrofila granuler (Figur 1A) eller formaldehyd fixering av fluorescerande transgena linjerna (Figur 1B). Att visualisera rekrytering och fagocyterande förmåga immunceller, använde vi transgena linjer som uttrycker grönt fluorescerande protein Dendra2 specifikt i makrofager Tg (MPEG1: dendra2) 24 eller neutrofiler Tg (mpx: dendra2) 12. När S. iniae sprutas in i öron vesikler av 3 dpf larver, är både neutrofiler och makrofager snabbt rekryteras inom de första 2 HPI (Figur 1). Men när de utförs på rätt sätt, mikroinjektion av PBS i öron vesikler inte resulterar i samma robusta rekrytering av värd leukocyter (
Figur 2: Fagocytos S. iniae av fagocyter i öron vesikler Transgenic mpx:. dendra2 (A) eller MPEG1: dendra2 (B) larv infekterade med röd-märkt S. iniae (avbildad i magenta) och avbildas vid 60 min efter infektion med användning av en laser Scanning konfokalt mikroskop. Skala bar, 30 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Photoconversion av makrofager vid öron vesikler 5 hpi med S. iniae. Makrofager (avbildade i grönt) vid öron vesikler, som utsetts av cirkeln (A), har photoconverted (B) med hjälp av en 405 nm laser på en konfokalmikroskop och spåras över tid. Av 24 HPI, photoconverted makrofager (avbildad i magenta) har migrerat så långt som stammen / caudal hematopoetisk vävnad (C); skala bar, 50 pm. Högre förstoringar av de inramade regionerna i C visas i (i) och (ii), skalstock 30 um; Pilarna pekar photoconkonverterats makrofager. Photoconverted celler ser vitt på grund av den sammanslagna 543 nm röd fluorescens och eventuellt kvarvarande 488 nm grön fluorescens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Infektionen metod som används här är användbar för studium av värdens immunsvar mot ett initialt lokal infektion i 2-3 dpf-embryon och larver. Fokus för en inflammatorisk stimulus, såsom infektion, i en sluten hålighet, exempelvis öron vesikler möjliggör studier av neutrofila och makrofag kemotaxi och fagocytos. En varning för att injicera bakterier i öron vesikler är att möjligheten för neutrofiler att effektivt fagocytera bakterier i vätskefyllda hålrum kan vara beroende på den särskilda mikroben. Även Escherichia coli och Bacillus subtilis inte lätt fagocyteras av neutrofiler i öron vesikler 28, har vi funnit att neutrofiler kan fagocytera både Pseudomonas aeruginosa och S. iniae i detta läge 16, 24. Lokaliserad infektion är också användbart när man studerar invasivitet av olika patogener. För att orsaka en systemisk infektion, följande Injection i en sluten hålighet, exempelvis öron vesikler, måste mikroben kunna passera fysiska värdbarriärer. Alternativt kan olika patogener åberopa värdceller för transport och spridning från den ursprungliga platsen för infektion. Detta gör lokaliserade injektioner användbara för att jämföra stammar av förändrad virulens.
Under mikroinjektion, för att undvika bakterier sedimente och täpper nålen, byta nålar antingen efter varje tillstånd eller efter ca 50 larver. Detta kommer att bidra till suspensionen i nålen är mer enhetlig. Om sedimentering av bakterier i nålen verkar vara ett problem, en blandning av PBS, 2% PVP40, och 10% glycerol, kan hjälpa till att hålla en homogen suspension. För att säkerställa att varje larv sprutas med ungefär samma antal bakterier, ta CFU räknas genom homogenisering en larv omedelbart efter injektion och utstrykning homogenatet på CNA-agar. CNA agar kommer att välja för tillväxten av odlingsbara gram-positiva bakterier, inte baraS. iniae, men det kommer att ge en uppfattning om hur konsekvent injektionsdoser är mellan varje enskild larv. Med ett mål inokulat av 100 CFU per larv, det finns oftast mellan 75-150 kolonier på en CNA tallrik. Antalet icke S. iniae grampositiva kolonier växer på en CNA plattan är troligen mycket låg, eftersom de flesta PBS injicerade fisk brukar resultera i mellan 0-20 kolonier. Vid senare tidpunkter under infektionen, är det inte ovanligt att det finns variation på upp till en halv inloggnings kolonier mellan larver infekterade med samma smittdosen. Detta skulle kunna utgöra mindre skillnader mellan enskilda larv i sin förmåga att bekämpa infektionen eller kan spegla skillnader i mängden av odlingsgrampositiva bakterier i larverna eller E3 medium.
Medan injektion i öron vesikler, är det viktigt att inte injicera en alltför stor kvantitet eller med för högt tryck då detta kan leda till att hålrummet att brista. Injektionsvolymer should hållas till cirka 1 nl. Om nålen är för stor, kan mikroinjektion skada omgivande vävnad, vilket kan påverka rekryteringen av värd leukocyter till platsen för infektion eller kan tillåta bakterier att läcka ut ur öron vesikler. Det är också viktigt att bekräfta injektion i rätt utrymme. Om nålen sätts in för djupt, kan det peta igenom öron vesikler eller det kan drabba blodkärl flyter runt öron vesikler. Detta kan leda till avsättning av bakterier in i blodomloppet eller utanför vesikeln, vilka kan ändra värdsvar.
Det är också möjligt att när nålen utvinns, vissa bakterier kan oavsiktligt deponeras utanför öron vesikler som visas av et al. Colucci-Guyon 28, men vi tycker att detta endast vara fallet i mindre än 5% av injektionerna. Att försöka injicera in i centrum av öron vesikler kan bidra till att undvika denna situation. I en framgångsrik infektion, bör öron vesikler tanka wed fenolrött färgämne, men färgämnet inte bör läcka ut i de omgivande vävnaderna. Varje mis-injicerade larver bör omedelbart kasseras. Injektion märkta bakterier är ett bra sätt att bekräfta en lyckad injektion (Figur 1B). En av nackdelarna med att använda en Celltracker färgämne är att detta färgämne blir utspädd som bakterierna dela slutligen förhindrar bakterierna från att visualiseras under fluorescens. Vi valde ett rött färgämne eftersom vi använde grönmärkta neutrofila och makrofager transgena linjer för de flesta av våra studier.
Dendra2 är en photoconvertible protein från octocoral Dendronephthya sp. vilket kan photoconverted från grönt till rött fluorescerande stat med en 405 nm laser 29. Denna photoconversion är en icke-invasiv sätt att markera celler och spåra deras öde under loppet av infektion. Leukocyter rekryteras till platsen för infektion kan photoconverted och följas över tid för att övervaka deras dPRIDNING hela värdvävnader (Figur 3). Alternativt kunde leukocyter kunna photoconverted före infektion och sedan övervakas eftermikroinjektion för att fastställa ursprunget av celler rekryteras till platsen för infektionen. Märkning bakterier och immunceller möjliggör studier av leukocyt-patogen interaktioner in vivo inklusive rekrytering och fagocytos (Figur 1B och figur 2). Skilja den röda märkta S. iniae från den röda fluorescensen hos en photoconverted leukocyt är svårt, så en annan fluorescensCellTracker färgämne kan användas. Detta skulle vara särskilt användbart för att avgöra vilken av de photoconverted immunceller som lämnar öron vesikler innehåller S. iniae.
Framtida tillämpningar av öron vesikler infektion metod skulle kunna innefatta att mäta hastighet och riktning med vilken neutrofiler och makrofager röra sig som svar på olika infektioner. Infektionen kinetics kan även studeras för att se vilken cell typer är den första att komma fram till en plats för infektion och vilka celltyper mest robust rekryteras förutom där cellerna härstammar eller där de sprider 30. Förutom att studera rekrytering till ett initialt lokaliserad infektion, kan denna infektionsmodell användas för att studera funktionen av värdkomponenter immunförsvar under initial infektion. Antisense morfolino oligonukleotider som är riktade till särskilda RNA kan användas för att slå ner uttryck av värdimmun komponenter inklusive Toll-liknande receptorer, cytokinreceptorer och leukocyter och CRISPR-Cas eller Talen teknik kan användas för att skapa genetiska mutanter. Genuttryck med användning RNAseq eller qPCR kan också användas för att karaktärisera uttrycket av vissa värdgener som svar på infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna vill tacka lab medlemmar för zebrafisk skötsel och underhåll. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health, National Research Service Award A155397 till EA Harvie och NIH R01GM074827 till Anna Huttenlocher.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml Eppendorfs | MidSci | AVSS1700 | |
| 14 ml Falcon tube | BD Falcon | 352059 | |
| 27 G x ½ in. needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 96-well Plate | Corning Incorporated | 3596 | |
| Agar | BD Biosciences | 214030 | |
| CellTracker Red | Molecular Probes, Invitrogen | C34552 | |
| CNA agar | Dot Scientific, Inc | 7126A | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-7m | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ethanol 200 proof | MDS | 2292 | |
| Fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gel comb | VWR | 27372-482 | 4.2 mm width, 1.5 mm thick |
| Glass bottom dishes | Custom made by drilling a 16 - 18 mm hole in the center of a 35 mm tissue culture dish bottom and placing a 22 mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light. | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| High melt agarose | Denville Scientific, Inc. | CA3510-6 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | with FV-1000 system | |
| Low melt agarose | Fisher | BP165-25 | |
| Magnetic stand | Tritech (Narishige) | GJ-1 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipet tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | Tritech (Narishige) | M-152 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Nanodrop spectrophotmeter | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 100 x 15 mm |
| Phenol | Sigma Aldrich | P-4557 | |
| Phenol Red | Ricca Chemoical Company | 572516 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Potassium hydroxide | Sigma Aldrich | P-6310 | |
| Pronase | Roche | 165921 | |
| Protease peptone | Fluka Biochemika | 29185 | |
| Small cell culture dish | Corning Incorporated | 430165 | 35 x 10 mm |
| Sudan Black | Sigma Aldrich | S2380 | |
| Thin wall glass capillary injection needles | World Precision Instruments, Inc. | TW100-3 | |
| Todd Hewitt | Sigma Aldrich/Fluka Analytical | T1438 | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | Argent Chemical Laboratory/Finquel | C-FINQ-UE-100G | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast extract | Fluka Biochemika | 92144 |
References
- Agnew, W., Barnes, A. C. Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination. Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).
- Danilova, N., Steiner, L. A. B cells develop in the zebrafish pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish. Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).
- Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).
- Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis. Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).
- Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio. Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).
- Meijer, A. H., et al. Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish. Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).
- Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio). Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).
- Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS ONE. 6 (2), e16779 (2011).
- Veneman, W. J., Marín-Juez, R., et al. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury. Cell. Microbiol. , (2012).
- Sar, A. M., et al. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. New York, NY. (2002).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).
- Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae. Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).
- Haddon, C., Lewis, J. Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
- Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -Y., Phillips, B. Development of the zebrafish inner ear. Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
- Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
- Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).
