Summary

Gjøre og ikke gjøre i utarbeidelsen av Muscle frysesnitt for histologisk analyse

Published: May 15, 2015
doi:

Summary

Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

Abstract

Histologisk evaluering av muskelbiopsi har fungert som et uunnværlig verktøy i forståelsen av utvikling og progresjon av patologi av nevromuskulære sykdommer. Men for å gjøre det, trenger riktig omsorg for å bli tatt når excising og bevare vev for å oppnå optimal farging. En metode for vev bevaring innebærer fikse vev i formaldehyd og deretter bygge dem med parafinvoks. Denne metoden bevarer morfologi godt og tillater langtidslagring ved romtemperatur, men er tungvint og krever håndtering av giftige kjemikalier. Videre formaldehyd fiksering resulterer i antigen kryssbinding, noe som nødvendiggjør antigen hente protokoller for effektiv immunfarging. Tvert imot, ikke frosset snitte krever fiksering og beholder derfor biologisk antigen konformasjon. Denne metoden gir også en klar fordel i rask tur rundt tid, noe som gjør det spesielt nyttig i situasjoner som trenger rask histologisk evaluering som intraoperative kirurgiske biopsier. Her beskriver vi den mest effektive metoden for å forberede muskelbiopsi for visualisering med forskjellige histologiske og immunologiske flekker.

Introduction

Undersøkelse av muskel histologi spiller en avgjørende rolle i forståelsen av ulike typer nevromuskulære lidelser 1-4. Når det kombineres med andre teknikker, gjør det forskerne å få et bedre inntrykk av manifestasjon og progresjon av patologi og kan også være avgjørende for å evaluere effekten av en terapeutisk intervensjon 5-10. Imidlertid, for å være nøyaktig, vev må bli bevart på riktig måte for å bevare den fysiologiske tilstanden umiddelbart før fjerning. Dette krever stor forsiktighet ved fjerning, bevaring, seksjonering, og farging.

Vev kan være forberedt på to forskjellige måter for lys mikroskopisk undersøkelse. Den første metoden, formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) seksjoner, krever vev å være løst i 10% naturlig bufret formaldehyd før de blir integrert med parafinvoks 11,12. Fiksering trinn bidrar til å bevare morfologi bedre, men også tverrforbindelser endogen proteins noe som nødvendiggjør komplisert antigen hentefremgangsmåter for farging og eliminerer muligheten for enzymatiske flekker på slike seksjoner 12. Frosne seksjoner, på den annen side, trenger ikke å være pre-fast eller prosessert; Derfor proteiner er i stand til å beholde innfødte biologiske konformasjoner 13,14. Videre frosne seksjoner også gir mulighet for rask behandlingstid, som til tider er nødvendig, for eksempel i intraoperativ diagnostisering av sarkomer og andre kirurgiske biopsier 15. Imidlertid, hvis det ikke gjøres ordentlig, er denne metoden utsatt for frostskade, som innfører endringer i muskelen arkitektur gjør seksjonene uegnet for histologisk undersøkelse. Denne oppgaven vil skissere den mest effektive metoden for å forberede muskelbiopsi for å oppnå optimal farging for skikkelig undersøkelse.

Protocol

1. Tissue Harvest og frysing av muskelvev Avlive musen med en overdose av isofluran (2-klor-2- (difluormetoksy) -1,1,1-trifluor-etan). Utfør dette trinnet i et avtrekksskap og bruke en sekundær containment metode som eksikkator eller en glassklokke med en bomullsdott dynket i isofluran. Bekreft død ved å ta godt klemme footpad. Bruk en sekundær metode for aktiv dødshjelp som halsdislokasjon. Fukt pelsen med 70% alkohol for å redusere stikker av løse hårstrå på musklene. Skrelle …

Representative Results

Oppsettet for høsting og frysing av vev kan sees i figur 1. Skåret vev må lagres på et gasbind fuktet med PBS for å unngå tørking (figur 1A). Når vev er valgt for å brukes for histologisk analyse bør de dyppet i oktober og lagt ut på cryo formen i riktig orientering og så nær fysiologisk lengde som mulig for å sikre nøyaktig morfologi (figur 1B). Slurry av isopentan egnet for frysing vev kan oppnås ved avkjøling av isopentan i flytende nitrogen og omrø…

Discussion

Histologi og immunhistokjemi har blitt brukt som viktige verktøy for å forstå manifestasjon og progresjon av patologi i ulike nevromuskulære sykdommer. Klassisk, ble muskelbiopsi først løst i formaldehyd og deretter embedded med parafinvoks. Mens formaldehyd fiksering bevarer vevet arkitektur og lar vev lagring og transport ved RT, også inaktiverer det enzymer og tverrbindinger proteiner nødvendig ytterligere skritt for å oppnå nøyaktig farging. Dette problemet er eliminert ved bruk av frossen seksjoner men d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank Alex Miller for manuscript revisions. This work was supported with the research grants awarded to M.G. from Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) and Muscular Dystrophy Association (218938).

Materials

Cryostat Leica CM 1850  Leica Microsystems Inc. Buffalo Grove, IL 60089 United States, office phone 1-800 248 0123
Richard Allen Scientific
Microscope Nikon Eclipse 50i  Nikon Instruments Inc. 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A.
Phone: +1-631-547-8500
Olympus
Image analysis software Nikon Imaging Software Basic Research Nikon Instruments Inc. 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A.
Phone: +1-631-547-8500
Image J, Metamorph
Isoflurane 14043-220-05 JD Medical Dist. Co., Inc. JD Medical Distrubuting Co., Inc 1923 West Peoria Avenue Phoenix, Arizona 85029
OCT 4583 Sakura Inc. Sakrua Fintek, USA, Torrence, CA 90501, USA
Leica Microsystem
Freeze It 23-022524 Thermofisher 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139
VWR Scientific
Disposable tissue mold 22-363-554 Thermofisher 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139
VWR Scientific
Colorfrost plus slides 9991001 Thermofisher 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139
VWR Scientific
Acetone 650501-4L Sigma-Aldrich 3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103
VWR Scientific
Ethyl alcohol HC-1300-1GL Thermofisher 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139
VWR Scientific
2-methyl butane M 32631-SL Sigma-Aldrich 3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103
VWR Scientific
Xylene HC-7001GA Thermofisher 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139
VWR Scientific
Cytoseal 280 8311-4 Thermofisher 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139
VWR Scientific
Hematoxylin Gill #3 CS402-1D Thermofisher 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139
VWR Scientific
Eosin 6766007 Thermofisher 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139
VWR Scientific

References

  1. Bonnemann, C. G., et al. Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies. Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).
  2. Caughey, J. E., Pachomov, N. The diaphragm in dystrophia myotonica. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).
  3. Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings. AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).
  4. Platzer, A. C., Chase, W. H. Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy. The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).
  5. Mercuri, E., et al. Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine. Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).
  6. Tasca, G., et al. Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles. PloS one. 7, e38779 (2012).
  7. Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy. The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).
  8. Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A. Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).
  9. Mehuron, T., et al. Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy. Skeletal muscle. 4, 14 (2014).
  10. Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A. Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).
  11. Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy. Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).
  12. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).
  13. Maccarty, W. C. The Diagnostic Reliability of Frozen Sections. The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).
  14. Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as ‘gold standard’ for immunohistochemistry. Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).
  15. Turan, T., et al. Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia. Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).

Play Video

Cite This Article
Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do’s and Don’ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis. J. Vis. Exp. (99), e52793, doi:10.3791/52793 (2015).

View Video