Gjøre og ikke gjøre i utarbeidelsen av Muscle frysesnitt for histologisk analyse

Summary

Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

Abstract

Histologisk evaluering av muskelbiopsi har fungert som et uunnværlig verktøy i forståelsen av utvikling og progresjon av patologi av nevromuskulære sykdommer. Men for å gjøre det, trenger riktig omsorg for å bli tatt når excising og bevare vev for å oppnå optimal farging. En metode for vev bevaring innebærer fikse vev i formaldehyd og deretter bygge dem med parafinvoks. Denne metoden bevarer morfologi godt og tillater langtidslagring ved romtemperatur, men er tungvint og krever håndtering av giftige kjemikalier. Videre formaldehyd fiksering resulterer i antigen kryssbinding, noe som nødvendiggjør antigen hente protokoller for effektiv immunfarging. Tvert imot, ikke frosset snitte krever fiksering og beholder derfor biologisk antigen konformasjon. Denne metoden gir også en klar fordel i rask tur rundt tid, noe som gjør det spesielt nyttig i situasjoner som trenger rask histologisk evaluering som intraoperative kirurgiske biopsier. Her beskriver vi den mest effektive metoden for å forberede muskelbiopsi for visualisering med forskjellige histologiske og immunologiske flekker.

Introduction

Undersøkelse av muskel histologi spiller en avgjørende rolle i forståelsen av ulike typer nevromuskulære lidelser ^1-4. Når det kombineres med andre teknikker, gjør det forskerne å få et bedre inntrykk av manifestasjon og progresjon av patologi og kan også være avgjørende for å evaluere effekten av en terapeutisk intervensjon ^5-10. Imidlertid, for å være nøyaktig, vev må bli bevart på riktig måte for å bevare den fysiologiske tilstanden umiddelbart før fjerning. Dette krever stor forsiktighet ved fjerning, bevaring, seksjonering, og farging.

Vev kan være forberedt på to forskjellige måter for lys mikroskopisk undersøkelse. Den første metoden, formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) seksjoner, krever vev å være løst i 10% naturlig bufret formaldehyd før de blir integrert med parafinvoks ^11,12. Fiksering trinn bidrar til å bevare morfologi bedre, men også tverrforbindelser endogen proteins noe som nødvendiggjør komplisert antigen hentefremgangsmåter for farging og eliminerer muligheten for enzymatiske flekker på slike seksjoner ^12. Frosne seksjoner, på den annen side, trenger ikke å være pre-fast eller prosessert; Derfor proteiner er i stand til å beholde innfødte biologiske konformasjoner ^13,14. Videre frosne seksjoner også gir mulighet for rask behandlingstid, som til tider er nødvendig, for eksempel i intraoperativ diagnostisering av sarkomer og andre kirurgiske biopsier ^15. Imidlertid, hvis det ikke gjøres ordentlig, er denne metoden utsatt for frostskade, som innfører endringer i muskelen arkitektur gjør seksjonene uegnet for histologisk undersøkelse. Denne oppgaven vil skissere den mest effektive metoden for å forberede muskelbiopsi for å oppnå optimal farging for skikkelig undersøkelse.

Protocol

1. Tissue Harvest og frysing av muskelvev Avlive musen med en overdose av isofluran (2-klor-2- (difluormetoksy) -1,1,1-trifluor-etan). Utfør dette trinnet i et avtrekksskap og bruke en sekundær containment metode som eksikkator eller en glassklokke med en bomullsdott dynket i isofluran. Bekreft død ved å ta godt klemme footpad. Bruk en sekundær metode for aktiv dødshjelp som halsdislokasjon. Fukt pelsen med 70% alkohol for å redusere stikker av løse hårstrå på musklene. Skrelle …

Representative Results

Oppsettet for høsting og frysing av vev kan sees i figur 1. Skåret vev må lagres på et gasbind fuktet med PBS for å unngå tørking (figur 1A). Når vev er valgt for å brukes for histologisk analyse bør de dyppet i oktober og lagt ut på cryo formen i riktig orientering og så nær fysiologisk lengde som mulig for å sikre nøyaktig morfologi (figur 1B). Slurry av isopentan egnet for frysing vev kan oppnås ved avkjøling av isopentan i flytende nitrogen og omrø…

Discussion

Histologi og immunhistokjemi har blitt brukt som viktige verktøy for å forstå manifestasjon og progresjon av patologi i ulike nevromuskulære sykdommer. Klassisk, ble muskelbiopsi først løst i formaldehyd og deretter embedded med parafinvoks. Mens formaldehyd fiksering bevarer vevet arkitektur og lar vev lagring og transport ved RT, også inaktiverer det enzymer og tverrbindinger proteiner nødvendig ytterligere skritt for å oppnå nøyaktig farging. Dette problemet er eliminert ved bruk av frossen seksjoner men d…

Materials

Cryostat	Leica CM 1850	Leica Microsystems Inc.	Buffalo Grove, IL 60089 United States, office phone 1-800 248 0123 Richard Allen Scientific
Microscope	Nikon Eclipse 50i	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Olympus
Image analysis software	Nikon Imaging Software Basic Research	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Image J, Metamorph
Isoflurane	14043-220-05	JD Medical Dist. Co., Inc.	JD Medical Distrubuting Co., Inc 1923 West Peoria Avenue Phoenix, Arizona 85029
OCT	4583	Sakura Inc.	Sakrua Fintek, USA, Torrence, CA 90501, USA Leica Microsystem
Freeze It	23-022524	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
Disposable tissue mold	22-363-554	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
Colorfrost plus slides	9991001	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
Acetone	650501-4L	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific
Ethyl alcohol	HC-1300-1GL	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
2-methyl butane	M 32631-SL	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific
Xylene	HC-7001GA	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
Cytoseal 280	8311-4	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 VWR Scientific
Hematoxylin Gill #3	CS402-1D	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
Eosin	6766007	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific