רוז בנגל Photothrombosis ידי דימות אופטי Confocal Published: June 23, 2015 doi: 10.3791/52794

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Lora Talley Watts¹, Wei Zheng¹, R. Justin Garling², Victoria C. Frohlich³, James Donald Lechleiter¹

¹Department of Cellular and Structural Biology, The University of Texas Health Science Center San Antonio, ²School of Medicine, The University of Texas Health Science Center San Antonio, ³Cell & Tissue Imaging Center, St. Jude Children’s Research Hospital

Introduction

ההדמיה היתרי הטכניקה המתוארת של in vivo תגובות הסלולר הבאה אינדוקציה של רוז בנגל מייד photothrombosis בעכבר ללא פגע. רוז בנגל (4,5,6,7-tetrachloro-2 ', 4', 5 ', 7'-tetraiodofluorescein) הוא צבע רגיש לשימוש כדי לגרום שבץ איסכמי במודלים של בעלי חיים (עכבר וחולדה). בעקבות הזרקה של RB בולוס דרך וריד הזנב והתאורה שלאחר מכן דרך גולגולת דלילה עם אור לייזר 564 ננומטר, פקיק מושרה גורם שבץ פיסיולוגי ^1. השיטה שתוארה במקור על ידי רוזנבלום ואל-Sabban בשנת 1977, ומאוחר יותר הותאמה על ידי ווטסון באמצע 1980 ^1,2. בקיצור, רוז בנגל הוא מוקרן עם אור ירוק העירור (לייזר 561 ננומטר במקרה שלנו), אשר מייצר את הייצור של מיני חמצן מגיבים, אשר לאחר מכן מפעיל גורם רקמה, יוזם מפל הקרישה. האינדוקציה של מפל הקרישה מייצרת איסכמי lesיון שהוא פתולוגית רלוונטי לשבץ קליני ^3.

יש שבץ הפתופיזיולוגיה מורכבת בשל יחסי הגומלין של סוגי תאים שונים רבים, כולל נוירונים, גליה, האנדותל ואת המערכת החיסונית. בחירת הטכניקה הטובה ביותר ללמוד תהליך סלולארי מסוים מחייב שיקולים רבים. טכניקות ניסיוניות נופלות באופן כללי לאחת משלוש קטגוריות: במבחנה, in vivo ובסיליקון ועם כל יתרונות וחסרונות שיש במבחנה יש חסרון העיקרי של הסרת תאים מהסביבה הטבעית שלהם ולכן לא יכולה להתרבות תופעות ראו בשלמותה,. חיים של בעלי חיים. בvivo טכניקות לספק לשכפול ניסיוני משופר של מדינות מחלה עם משמעות translational גדלה. בסיליקון ובדרך כלל מתייחס למודלים ממוחשבים של מחלה או תהליך סלולארי, ובזמן שמנוצל יותר ויותר ללמוד תגובות בין תרופתיות פוטנציאליות לבחינהple, כל מידע שלוקט חייב עדיין להיבדק בתאים חיים או רקמה.

המודל האידיאלי של שבץ במעבדת ההגדרה צריך להפגין תכונות פתולוגיים דומות לאלה ראו באוכלוסייה האנושית. אמנם יש מאפיינים פיסיולוגיים שכיחים של שבץ באוכלוסייה האנושית, יש גם הבדלים רבים, תלוי בסוג של פציעה חווה. שבץ באוכלוסייה האנושית מתרחש כחסימות קטנות או גדולות ספינה, נגעים מדממים, ועורק לעורק או לב ותסחיפים שיגרמו כרכי אוטם מגוונים כמו גם הבדלים במנגנונים הקשורים לכל פתולוגיה. היתרון של שימוש במודלים של בעלי החיים שבץ הוא הדור של אוטמים לשחזור המחקים מאפיינים של שבץ אדם. דגמי השבץ בבעלי החיים הנפוצים ביותר כוללים חסימת עורק באמצעות: עורקים התיכון ספיגה מוחין (שיטות נימה תסחיפים או endovascular) שMCAO דיסטלי דגמים ומודל photothrombosis. היתרונותחסרונות של כל דגם ד נבדקו במקום אחר (ראה ⁴ ו ^-5). מודלים גלובליים איסכמי (MCAO), בעוד קל יחסית לביצוע הם פחות רלוונטיים לאירוע מוחי אנושי מאשר דגמי שבץ מוקדי. בנוסף, שיטות אלה הן משתנים מאוד בגרימת נגעי אוטם המוח לשחזור. מודל photothrombosis הוא מאוד לשחזור, כל עוד הניסוי שולט ניסויים שלהם גם, מתן יתרון ברור על פני דגמי MCAO. עם זאת, בשל עלבון microvasculature המודל שתואר להציג פנומברה איסכמית מינימאלית, האזור שבו תאים נחשבים להציל ^6,7. בנוסף, בצקת vasogenic והיווצרות בצקת ציטוטוקסיות יכולים גם להיגרם ההקרנה של אזור ההדמיה הבאה. למרות מגבלות אלה הטכניקה סיפקה תובנה חדשה תהליכים פיסיולוגיים רבים לאחר שבץ ^{8, 9, 10, 11.}

Protocol

הערה: נהלי כל החיה אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של האוניברסיטה למדעי בריאות טקסס מרכז סן אנטוניו ועלו בקנה אחד עם ההנחיות להגיע.

1. הרדמה לקליפת מוח הכנה

1. מניחים את העכבר בתא אינדוקציה עם isofluorane 2-3% מעורבבים עם חמצן כדי לגרום להרדמה. שים לב לירידת קצב הנשימה כעכבר מושרה. לצבוט את הכפה של העכבר כדי לקבוע אם העכבר הוא מוכן לעבור לחרטום. הערה: רמת הרדמה היא שלב קריטי בכל הכנת in vivo ויש להיזהר שלא לגרום לרמה שתגרום איסכמיה הגלובלית.
2. לאחר העכבר הוא הרדים מספיק, להעביר את בעלי החיים לניתוח פלטפורמת ההדמיה / ולמקם את האף של העכבר בחרטום ולהחיל isofluorane 1-1.2% כדי לשמור על מדינה בהרדמה. ודא שהעכבר שוכב על שיתוף טמפרטורהכרית חימום ntrolled כדי לשמור על טמפרטורת הגוף (37 מעלות צלזיוס +/- 0.5 מעלות צלזיוס) לאורך כל ההליכים שנותרו. מניחים משחה וטרינר על העיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
3. לפקח הפיסיולוגיה של העכבר באמצעות מערכת דופק oximetry באמצעות קליפ הזנב או רגל מסופק עם המערכת. בדוק שקצב הנשימה נשמר בין 50-65 נשימות / דקה. בדוק שקצב הלב נשאר בין 300-450 פעימות לדקה וריווי חמצן נשמר בין 97-98% כדי להבטיח את הישרדות לטווח הארוך של בעלי החיים.
4. כאשר העכבר הוא הרדים כראוי, לגלח את השיער מעל הגולגולת באמצעות קוצץ חשמלי, להסיר שיער שייר ונקי עם בטאדין, ואחריו ספוגית אתנול. חזור על תהליך זה עד שלוש פעמים על מנת להבטיח סביבה כירורגית סטרילית.

2. נוהל כירורגי

1. עם הקרקפת ניקתה ומגולחת באופן מלא, לעשות חתך 5 מ"מ בקרקפת של העכבר כדי לחשוף את fissu הגולגולתמיל ולאתר גבחת.
2. השתמש מוליך כותנה סטרילי כדי להסיר כל שנותר fascia שמעל הגולגולת.
3. דבק טבעת מותאמת אישית נירוסטה (איור 1) עם דבק רקמות העצם המכסה את הקליפה הקודקודית באמצעות קואורדינטות stereotaxic של גבחת: -1 ל-3 מ"מ ורוחב: 2-4 מ"מ. הערה: הדבק בדרך כלל קובע בתוך 2 דקות לאחר המיקום של הטבעת על העצם.
4. להדביק את הטבעת לבעל stereotaxic (איור 2) כדי לייצב את העכבר, ולמנוע תנועה במהלך הדמיה.
5. תחת מיקרוסקופ לנתח כיתה כירורגית, לקדוח לאט סעיף 1-2 מ"מ בגולגולת באמצעות כלי מהירות מבוקרת כמו DREMEL (Meisinger מקדח 3.9 מ"מ) והקפד לשמור על רמת השטח כפי שהוא קדח. להשיג זאת באמצעות דפוס זיג זג. כדי להימנע מחום לבנות, להגדיר את מהירות תרגיל לנמוך ולקחת הפסקות תכופות.
6. כאשר גולגולת הגולגולת הופכת shinny במראה, תמשיך הדלילשל הגולגולת באמצעות סכין אזמל ניצול אותו דפוס זיג זג ולהשאיר את השטח דליל כדי להקל על הסרת חלק משכבות דקות של גולגולת גולגולת. באמצעות הקצה של להב סכין המנתחים לעשות משיכות יניארי קטנות עם לחץ קל כדי להסיר שכבות דקיקות של עצם בכל פעם. תמשיך את זה עד שכלי הדם נראה בבירור דרך מיקרוסקופ לנתח.
7. אם הנסיין נקבים דרך או לשבור את הגולגולת בתהליך ההרזיה, להרדימו בשל סיכוי לניזק לקליפת המוח הבסיסי.
   הערה: גולגולת העכבר היא כ 300 מיקרומטר בעובי ומורכב משתי שכבות דקות של עצם קומפקטי (שכבה אחת חיצונית ופנימית) ושכבה של עצם ספוגי דחוקה בין שתי השכבות של עצם קומפקטי. השכבה החיצונית של עצם קומפקטי ורוב העצם הספוגי יוסרו בתוך אזור קידוח 5 מ"מ וכתוצאה משכבת ​​50 מיקרומטר משוערת של עצם קומפקטי שנותר (ראה איור 2). Visualizני של כלי הדם יבטיח כי הגולגולת דלילה שלמה הסופית היא כ 50 מיקרומטר בעובי. הגולגולת לכן עדיין קיימת כאשר דיללו לעובי זה.

3. מיקרוסקופים קמה

1. השתמש מערכת הפוכה מיקרוסקופ (קונבנציונלי, confocal או מערכות שני פוטונים) שיש מהפך אובייקטיבי. הערה: אפשר גם לנצל מיקרוסקופ זקוף סטנדרטי. הגורם המגביל יהיה השטח בין הבמה והיעדים. שינויים בשלב עשויים להיות נחוצים כדי להשיג הגדרה זו.
2. אבטח את פלטפורמת הניתוח / הדמיה לבמה בהתאמה אישית הממוקמת בצד את הבסיס של המיקרוסקופ. הערה: הפלטפורמה נעשית באמצעות שקע מעבדה כדי לאפשר תנועה אנכית של פלטפורמת ניתוח / הדמיה תחת המטרה. שקע המעבדה הוא רכוב על צלחת מודבקת ארבע מוטות גליליות. (ראה איור 2).
3. מקם את המהפך האובייקטיבי המכיל 20Xאובייקטיבי על פני חלון הגולגולת. השתמש במקור אור חיצוני כדי למצוא את חלון הגולגולת ע"י הסתכלות דרך העיני של המיקרוסקופ ולמקם את המטרה באזור ההדמיה. הערה: אזור ההדמיה יהיה כונה על ידי הנוכחות של כלי הדם.
4. ליעדים על בסיס מים, להשתמש בנוזל מוח השדרה מלאכותי (aCSF) (130 מ"מ NaCl, 30 מ"מ KCl; 12 מ"מ KH ₂ PO _4; 200 מ"מ NaHCO _3; 30 מ"מ HEPES; וגלוקוז 100 מ"מ) כבינוני בשל פוטנציאל דליפה לתוך חלל הגולגולת במהלך ההדמיה (איור 3).

4. רוז בנגל דיי הכנה, מנהל ואינדוקציה של שבץ

1. הכן פתרון חדש 20 מ"ג / מיליליטר של רוז בנגל בנוזל השדרה מוחין מלאכותי (aCSF); לסנן ולעקר לפני הממשל. אל תעשה שימוש חוזר או לאחסן בנגל רוז פעם אחת זה כבר מעורב. הפוך פתרון טרי עבור כל ניסוי.
2. תן הזרקה לוריד 0.1 מיליליטר זנב של רוז בנגל בזמן שלשימורי חלון הגולגולת עם לייזר 561 ננומטר, כדי להבטיח הזרקה נאותה של הפתרון. הערה: רוז בנגל יהיה דמיין בתוך 5 שניות לאחר ההזרקה בכלי הדם של המוח. כל הכלי צריך להיות מלא עם רוז בנגל.
3. לאחר הזרקה מספיקה של צבע רוז בנגל לבחור כלי מתאים לפקק מבוסס על קוטר כלי (40-80 מיקרומטר) כדי להבטיח שחזור של בפרט נפח נגעים. להבחין בין עורקים וורידים ע"י הסתכלות בכיוון זרימת דם: העורקים יעברו מקוטר גדול יותר לכלי קוטר קטנים יותר, ורידים לעבור מקטנים לכלי קוטר גדולים יותר. המטרה זו מושגת בקלות על ידי הדמיה פעם רוז בנגל מוזרק.
4. לשנות את הגדרת מיקרוסקופ כדלקמן:
   1. להגדיל את הזמן להתעכב. הערה: זה ישתנה בהתאם למערכת מיקרוסקופ מנוצל.
   2. להגדיל את כוח הלייזר עד 100%.
   3. לאסוף תמונות רצף זמן במסגרת 1 / sec באמצעותמהירות סריקה המרבית.
5. סרוק את העכבר עד קריש יציב נוצר בתוך הכלי. הערה: בדרך כלל זו מושגת תוך 5 דקות של סריקה רציפה (ראה איור 4).
6. בעקבות האינדוקציה של היווצרות קריש דם באמצעות רוז בנגל, להסיר את העכבר מאזור ההדמיה חזרה למיקרוסקופ לנתח. מוציא בזהירות את טבעת הנירוסטה מגולגולת הגולגולת. בדוק את חלון הגולגולת לכל דימום. אם דימום מתרחש, לסיים את הניסוי.
7. השתמש 6.0 תפר monofilament כדי לסגור את החתך מעל הגולגולת. מניחים משחה אנטיביוטית לאורך קו התפר כדי למנוע זיהום. הזרק Buprenex תת עורי כל 12 שעות במשך שלושה ימים לניהול כאב (0.05 מ"ג / קילוגרם).
8. להחזיר את העכבר לחדר התאוששות לאחר ההסרה מההרדמה עד ער לחלוטין ולנוע בחופשיות.
9. החזר את העכבר לכלוב נקי לחקירה נוספת במועד מאוחר יותר.

5. הדמיה אורך בימים שלאחר מכן

1. להעסיק את השיטות הבאות כדי לבצע הדמיה אורך בימים שלאחר מכן הודעה photothrombosis.
   1. להרדים את העכבר כפי שתואר בסעיף 1 לשיטות.
   2. על הולם הרדמה מחדש לפתוח את הקרקפת על ידי הסרת כל תפרי שייר לפתוח מחדש את העור שמעל תחום ההדמיה נקדח בעבר.
   3. השתמש מוליך כותנה סטרילי כדי להסיר כל שנותר fascia שמעל הגולגולת.
   4. דבק טבעת מותאמת אישית נירוסטה (איור 1) עם דבק רקמות העצם שמעל תחום ההדמיה הקודם.
   5. להדביק את הטבעת לבעל stereotaxic (איור 2) כדי לייצב את העכבר, ולמנוע תנועה במהלך הדמיה.
   6. אתר את כלי הדם שבבסיס הגולגולת דליל בעבר. השתמש הזרקה לוריד זנב של FITC-dextran כדי לאמת את הנוכחות של הקריש המושרה בעבר.
   7. השתמש 6.0 תפר monofilament כדי לסגור את בcision על הגולגולת. מניחים משחה אנטיביוטית לאורך קו התפר כדי למנוע זיהום. הזרק Buprenex (0.05mg / קילוגרם) תת עורי כל 12 שעות במשך שלושה ימים לניהול כאב.
   8. להחזיר את העכבר לחדר התאוששות לאחר ההסרה מההרדמה עד ער לחלוטין ולנוע בחופשיות.

6. אימות של אינדוקציה שבץ (פוסט מורט)

1. בסיומו של מחקר, לוודא שבץ באמצעות כלוריד צביעת 2,3,5-triphenyltetrazolium (TTC) כפי שמוצג באיור 5 נפח. ניתן למצוא השיטה המלאה ב ^-12.

Representative Results

מטרתה של שיטה זו הייתה לגרום לשבץ איסכמי במודלים של בעלי חיים (עכבר וחולדה) הבאים הזרקה של RB בולוס דרך וריד הזנב והתאורה הבאה של גולגולת דלילה עם אור לייזר 561 ננומטר. התמונות באיור 4 מדגימות את ההתקדמות של היווצרות קריש דם בתוך כלי אחד לאחר הקרנה של האזור בדקות 0, 1, 1.5 ו -2. לפני היווצרות קריש כל הכלי לבן בשל זרימה חופשית רוז בנגל. בעקבות האינדוקציה של הקרנה של כלי השיט יש מחשיך ברור בחלקים של כלי השיט ומציין את האינדוקציה של היווצרות קריש דם (מסגרות 1 ו -1.5 דקות). בעקבות חסימה מלאה יש הצטברות ניכרת של צבע רוז בנגל (אזור הלבן) שקדמה לקריש (האזור שחור) בתוך הכלי. המסגרת של 2 דקות מדגימה את החסימה של העורק המלאה.

כדי לאמת את הנוכחות של כתמי TTC שבץ איסכמי יכולה להיות מנוצלת. TTC הוא שיתוף mmonly משמש כתם לגילוי של אוטם מוחי על ידי ההיווצרות של מוצרי TTC formazan אדומים ברקמה בריאה. חוסר ייצור formazan (רקמה לבנה) מציין את אזור האוטם. האזורים שצוינו על ידי התיבות באיור 5 מדגימים את גדלי נגע האופייניים השיגו 1 ו -5 ימים משני בעלי חיים נפרדים הבאים קריש מיוצר בתוך כלי כ 80mm בקוטר. ניתוח תמונה מתבצע על סורק מיטה שטוח והשימוש בתוכנת ImageJ. אזורים של עניין ניתן להסיק בתוך ImageJ למדוד את השטח של נפח הפעימה לכל מוח.

איור 1:. נירוסטה טבעת שלוש תצוגות (למעלה, בצד ונוף תחתון) מוצגות של בעל טבעת הנירוסטה שמוחל על הגולגולת של העכבר כדי להדביק אותו לבעל stereotaxic.

p-together.within עמודים = "תמיד">
איור 2:. התקנת פלטפורמת הדמיה מיקרוסקופיות לphotothrombosis RB הפלטפורמה כירורגית / ההדמיה מכילה בעל לצינור ההרדמה עם nosecone ובעל stereotaxic לטבעת פלדת אל-חלד שמודבק בגולגולת של החיה כדי להקטין תנועה של בעלי החיים ב הדמיה. הפלטפורמה ממוקמת על גבי ומאובטח לשקע מעבדה כדי לאפשר תנועה אנכית למיקום העכבר תחת מטרת מיקרוסקופ. שקע המעבדה לאחר מכן מצורף לבמת מיקרוסקופ, המאפשרת לתנועה אופקית. הבמה מיקרוסקופ ממוקמת על גבי ומאובטחת לארבע מוטות גליליות.

איור 3: תמונה של הדמיה / עיצוב פלטפורמה כירורגית ונטייה תחת inv האובייקטיביערטער. () הפנל בצד השמאל מדגים תמונה מייצגת של המיצוב של עכבר הרדים (חרטום הרדמה הוסר זמן קצר כדי לצלם את התמונה). שים לב לשימוש בטבעת פלדה מותאמת אישית לצרף גולגולת העכבר כדי להקטין את התרומה של חפצי נשימה לאורך כל הליכי ההדמיה. התמונה מימין מראה תמונה של חלון קליפת המוח תחת מיקרוסקופ לנתח. (ב) סקיצה של הכנת הגולגולת דקה מנוף עטרה הוכחת השכבות של הגולגולת ביחס למאטר הדורה והעובי של האזור דליל ביחס לעובי גולגולת המלא.

איור 4: תמונה של היווצרות קריש רוז בנגל נציג תמונות של כלי יחיד המכיל צבע רוז בנגל שהוזרקה דרך VEI הזנב.n של העכבר. התמונות ממחישות את ההתקדמות של היווצרות קריש דם בתוך הכלי לאחר הקרנה של האזור בדקות 0, 1, 1.5 ו -2. שים לב להצטברות של הצבע רוז בנגל (הלבן) שקדמו לקריש (השחור) במסגרת 2 דקות המדגימה את החסימה של העורק המלאה.

איור 5: כלוריד 2,3,5-triphenyltetrazolium תמונה (TTC) של נגע מושרה RB נציג תמונות מוצגות בימי 1 ו -5 אינדוקציה ההודעה photothrombosis.. העכברים הוקרבו והמוח במהירות הוסר וחתוך לחלקים עטרה 1 מ"מ ומוכתם בTTC על פי שיטות סטנדרטיים. TTC הוא כתם נפוץ לגילוי של אוטם מוחי על ידי ההיווצרות של מוצרי TTC formazan אדומים ברקמה בריאה. חוסר ייצור formazan (רקמה לבנה) מציין את אזור האוטם.אזורים שצוינו על ידי התיבות להדגים את גודל הנגע הטיפוסי שהושג בעקבות קריש מיוצר בתוך כלי כ -80 מיקרומטר קוטר.

איור 6: ייצוג סכמטי של הליך photothrombotic רוז בנגל.

Discussion

היכולת לתרגם הפתופיזיולוגיה שבץ ניסיונית מבעלי חיים לבני אדם יישום כבר נגועה בכישלון. עם זאת, השימוש במודלים של בעלי חיים, כגון מודל photothrombosis, מאפשר להבנה משופרת של הפתופיזיולוגיה שבץ וחקר גישות טיפוליות חדשות כדי לספק neuroprotection בעקבות שבץ. משיכות בקליפת המוח קטנות וmicroinfarctions מיוצר על ידי מודל photothrombotic קליני רלוונטיות לשבץ תת קליני או "שקט" ^13-15, שבה יש שכיחות גבוהה ומשפיע על כ 4 אחוזים מאוכלוסיית ארצות הברית (כ -11 מיליון בני אדם) בכל השנה ^16. שבץ שקט אין הסימפטומים הקלאסיים השבץ נוכחים באירוע מוחי גדול יותר, כמו שיתוק, אובדן חושי וקושי בדיבור כגון ראו בחסימת עורק המוח האמצעי (MCA) או התקף איסכמי חולף (TIA) ^17. כמו כן, שבץ שקט הוא שונה משבץ אַגמִימִי, שנגרמת על ידי חסימה של עורק חודר יחיד במבני מוח עמוקים יותר או בגזע המוח וגם מבחינה קלינית מתבטאת במנוע, חושי או מעורבים גירעונות ^18. חולים עם תת-קליני או שבץ "שקט" בדרך כלל לא להציג כל סימפטומים חיצוניים, ולעתים קרובות לא מודעים שהם אפילו סבלו משבץ. תוצאות שבץ שקטים בירידה תת-קלינית בתפקוד הקוגניטיבי הוצגה על ידי גירעונות בזיכרון, קבלת החלטות, ושינויים בהתנהגות. לאורך זמן, שבץ שקט מרובה להוביל לסימנים קליניים משמעותיים של אובדן זיכרון הידוע בכלי דם או דמנציה רבת אוטם. עם זאת, נזק מוחי שבץ שקט יכול להיות מזוהה באמצעות הדמייה, ומציב את מטופל בסיכון לTIA ושבץ גדול בעתיד ^19.

מודל photothrombosis מאפשר לייצור לשחזור במודל vivo של פקקת בעכבר ללא פגע, מורדם באמצעות הצבע רגיש לרוז בנגל (RB) בקומביאומה עם מיקרוסקופיה confocal. ישנם יתרונות רבים של in vivo מודל photothrombosis. אחד יתרונות של שיטה זו הוא היכולת להגדיר מראש את מיקומו של האירוע המוחי באמצעות קואורדינטות stereotaxic; מאפשר לאדם ללמוד אוכלוסיות תאים מסוימות על פני בעלי חיים. בנוסף, שחזור של גודל נגע ונפח נשלט גם ניצול שיטה זו על ידי שינוי עוצמת אור הלייזר והשליטה לגודל כלי שמוקרן ^20. שיטה זו מאפשרת גם למחקר מפורט של שינויים בעצביים פרי אוטם ומתאים נגדי קליפה ^4. למרות ששבץ שקט יחיד גורם גירעונות מינימאליים, שחזור של מודל זה מאפשר ליכולתו להשפיע על משיכות שקטות מרובות באזורים ספציפיים, אשר ניתן להשתמש בי לחקות תפקוד מוח שונים כגון דמנציה וסקולרית. פיתוח של סף בין שבץ שקט מרובה וגירעונות ניכרים קליני ניתן לקבוע בספציפיכמו גם אזורי פיק של המוח באמצעות השימוש בשיטה זו. לבסוף, המודל מאפשר למחקרים ארוכי טווח באותה החיה המאפשרים לנצפו תופעות הן אקוטיות וכרוניות.

יש, עם זאת, כמה חסרונות בשימוש במודל photothrombosis. חסרון אחד כולל ייצור של נגע שהוא כאמור שיש הילה איסכמי קטנה בהשוואה לדגמים אחרים של שבץ מוקד ^4. שנית, היווצרות vasogenic ובצקת ציטוטוקסיות אפשרית בשל הנזק שעלול להתרחש במהלך האינדוקציה של photothrombosis, שדומה באופן הדוק יותר פגיעות מוח טראומטיות מאשר שבץ מוקד ^4.

בעת שימוש במודל photothrombosis יש מספר גורמים שחייבים להיות במעקב לאורך כל הניסוי. זה קריטי, כי המצב הפיזיולוגי של בעלי החיים להיות במעקב לאורך כל הליכי ההדמיה. זה ידוע היטב כי רמת הרדמה יכולה להשפיע על רח הפיזיולוגיatus של בעלי החיים, עם מעל ההרדמה גורם לירידה בקצב לב ואספקת חמצן לבעלי החיים. זהו שיקול חשוב, כמו זה להקטין את הזמינות של חמצן למוח וכתוצאה מכך איסכמיה הגלובלית. לכן, השימוש במערכת לניטור המצב הפיזיולוגי של החיה תאפשר ההקלטה לא פולשנית בו זמנית של: ריווי חמצן עורקים (SpO _2); קצב לב; דרג נשימה; התנפחות דופק (מדד של זרימת דם מקומית ואות איכות); התנפחות נשימה (תחליף ללחץ intraplueral); וטמפרטורת ליבה בעכברים וחולדות. זה הופך להיות חשוב יותר ויותר לשלוט הרדמה מבלבל כאשר עובד עם כל מודל חיה להפחתת בלבול בלתי צפוי בתרגום תוצאות ניסוי להטבות בסטוק הקליני. הבחירה, המשך ועומק ההרדמה יכולים להיות השפעה דרסטית במודל חיה של שבץ ניסיוני. המחקרים הראו שחומרי הרדמה עשויים להפחית סי האוטםze ואף עלול לספק הגנה מסוימת מאיסכמיה מוחית ^21-23,24. בנוסף, שינויים בייצור של מיני חמצן מגיבים גם הודגמו במחקר שהשווה את השימוש בהלותן וpropofol ^25. לבלבל זה חשוב כאחד מההשערות העיקריות במוות עצבי הקשורים בשבץ הוא הייצור של מיני חמצן תגובתי.

אחד סיבוכים של ניצול במיקרוסקופ vivo ללמוד את התגובה של המוח לשבץ הוא ההגבלה של עומק ההדמיה השגה. במעבדה שלנו באמצעות מיקרוסקופ confocal עומק ההדמיה שניתן להשיג הוא בטווח של 100-200 מיקרומטר, תוך שימוש במיקרוסקופ שני פוטונים יכולים להגדיל עומק זה לבין 400-500 מיקרומטר. בלבול אלה שלהקל על ידי הפיתוח של מטרות עם להגדיל את מרחקי עבודה ושל ירידה בגודל. לדוגמא, השבירה שיפוע microlenses (חיוך) היא שנינות microendoscopesקטרי שעות בין 35-1,000 מיקרומטר והם הקטנים ביותר זמינים עד כה. סוג זה של בדיקה לא יכול להיות מוכנס לתוך הרקמות ללא גרימת נזק פולשנית ויש פתחים מספריים נמוכים. בשל NA הנמוך הרזולוציה היא נחותה בהשוואה ליעדי מיקרוסקופיה אופטיות מסורתיים ^26.

לסיכום, מודל photothrombosis רוז בנגל גורם אוטם בגודל קטן ושימושי בלימוד התגובה התאית לאוטם בשני השלבים אקוטיים וכרוניים באוכלוסייה סלולרית מוגדרת היטב. מודל זה מדגים מאפיינים סלולריים חיוניים ראו עם MCAO איסכמיה מוקדי הבא ולכן הוא שימושי בהערכת טיפולי נוירו / neuroregenerative.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Rose Bengal	Sigma	330000
Isoflurane Anesthetic	MWI Veterinary Supply	088-076
Vetbond	1469SB	1469SB
aCSF	126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4).

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dissecting Scissors	Bioindustrial Products	500-410
Operating scissors 14 cm	Bioindustrial Products	12-055
Forceps Dumont High Tech #5 style, straight	Bioindustrial Products	TWZ-301.22
LabJack 132X80	Optosigma Co	123-6670
Platform for Labjack 8X 8	Optosigma Co	145-1110
Ear bar holder from stereotaxic setup	Stoelting/Cyborg	51654
Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine	DRE, Inc.	15001
Tech IV Isoflurane vaporizer	DRE, Inc.	34001
F Air Canister	DRE, Inc	80120
Bain circuit breathing tube	DRE, Inc	86111B
Rodent adapter for bain tube	DRE, Inc	891000
O2 regulator for oxygen tanks	DRE, Inc	CE001E
Rodent induction chamber	DRE, Inc	15004C
Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle	Suture Express	1639G
Objective inverter Optical Adapter	LSM technologies
Foredom drill Dual voltage 110/120	Foredom	134.53
Meisinger 3.9 mm drill bit	Meisinger		(Ref#310 104 001 001 009)