Abstract
Kännetecknande tymiska lösa stamceller är viktigt att förstå de pre-tymiska stadier av T-cellsutveckling, viktigt att utarbeta strategier för T-cellersättning i lymfopen patienter. Vi studerade tymus lösa stamceller från mus embryonala dag 13 och 18 Thymi med två kompletterande in vitro och in vivo-tekniker, båda baserade på "hängande drop" -metoden. Denna metod får kolonisera bestrålade foster tymiska lober med E13 och / eller E18 tymiska stamceller kännetecknas av CD45 allotypiska markörer och därmed efter deras avkomma. Colonization med blandade populationer tillåter analysera cell autonoma skillnader i biologiska egenskaper hos föregångare när kolonisering med antingen befolkning bort eventuella konkurrensselektionstryck. De koloniserade tymiska lober kan också ympas i immunodeficienta manliga recipientmöss möjliggör analys av den mogna T-cell avkomma in vivo, såsom populationsdynamik av than perifera immunsystemet och kolonisering av olika vävnader och organ. Fostrets tymiska kulturer organ visade att E13 gångare utvecklades snabbt till alla mogna CD3 + celler och gav upphov till den kanoniska γδ T-cellgrupp, som kallas dendritiska epitelceller T-celler. I jämförelse, E18 stamceller har en fördröjd differentiering och kunde inte generera dendritiska epitel T-celler. Övervakningen av perifert blod från tymus-ympade CD3 - / - möss visade dessutom att E18 tymus sedimenterings progenitorer genererar, med tiden, ett större antal mogna T-celler än deras E13 motsvarigheter, en funktion som inte kan uppskattas på kort sikt fetal tymus organkulturer.
Introduction
T-lymfocyter, som bär αβ eller γδ T-cellsreceptor (TCR), skilja på en specialiserad organ, bräss. Den fullt utvecklade bräss är organiserad i två skilda områden: hjärnbarken, där tymiska stamceller utvecklas och där tymocyter som produktivt ordna om TCR β och α kedjegener räddas från programmerad celldöd (en process som kallas positiv selektion); och märgen, där utvalda tymocyter med alltför stark reaktivitet mot självligander raderas (negativ selektering) 1,2. Tymus härstammar från endodermalt lagret av tredje svalg påse som senare omgiven av mesenkymala celler 3. Den är koloniseras av hematopoietiska progenitorer som startar vid embryonal dag E12 och därefter är kontinuerlig rekrytering krävs för normal T-cellutveckling 4. Tymiska invandrare utvecklas genom successiva utvecklingsstadier, iscensatt av en hårt reglerad program, initierat och maintained genom aktiveringen av Notch signaleringsvägen på tymocyter vid interaktion med dess ligand, deltaliknande 4, uttryckt på tymiska epitelceller (TEC) 5.
Tymocyt utveckling börjar vid den så kallade CD4 - CD8 - dubbel negativa (DN) steg. DN tymocyter kan ytterligare delas enligt uttrycket av CD25 och CD44 i DN1 (CD25 - CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) och DN4 (CD25 - CD44 -). CD24 (HSA) och CD117 (c-Kit) delar in ytterligare DN1 facket i 5 delmängder där DN1a och b motsvarar tidiga tymiska stamceller (ETP). Tymocyter ordna TCR δ, β och α kedjor i DN stadiet och genomgå pre-TcR urval (DN3-DN4 stadier). De ytterligare väg till CD4 + CD8 + dubbla positiva (DP) utrymme där TcR α-kedjan ordnar före positiv och negativ seleInsatser. I detta skede de flesta tymocyter elimineras och endast en liten andel (3-5%) når CD4 + eller CD8 + mogna T-cellfacket.
Den lymfoida differentieringsväg fortskrider genom de olika stadierna av HSCs som genererar multi progenitorceller (MPP) och lymfoid-primas multi stamceller (LMPP) som förlorat erytrocyter och megakaryocyter potential 6. LMPP är fenotypiskt definieras genom frånvaron av differentierade blodcellmarkörer (härstamning negativ, Lin -), ett uttryck av c-Kit (CD117), Sca-1 och Flt3 / FLK2 (CD135) och frånvaro av detekterbara nivåer av interleukin ( IL) -7 receptor α-kedjan (IL-7rα eller CD127). LMPPs ytterligare differentiera till gemensamma lymfoida stamceller (CLP) 7 som genom detta skede har förlorat förmågan att generera myeloidceller. CLP behålla lymfocyter (B och T-cell), NK-celler, DC och medfödd lymfoidcell (ILC) potential, och skiljer sig från LMPP av uttrycket av CD 127 och frånvaron av höga halter av Sca-1.
Även om arten av de tymiska sedimente progenitorer (TSP) har i stor utsträckning diskuterat 8 blev det nyligen klart att TSP förändring fenotyp, differentieringspotential och funktion, genom hela utvecklingen 9. Vi spelade in vitro och in vivo-analyser för att karaktärisera TSP, isoleras genom FACS cellsortering från antingen E13 (första vågen) eller E18 (andra vågen). Fostrets tymiska organkulturer (FTOC) med bestrålade tymiska lober koloniserades av lika många E13 och E18 progenitorceller, bärande olika allotypiska markörer, tillåts följa deras avkomma i en liknande utvecklingsmiljö och avslöjade cell inneboende egenskaper, olika mellan de båda typerna av stamceller. Tymiska lober koloniserades av antingen E13 eller E18 TSP tillåtna utveckling utan val på grund av konkurrensen mellan de båda stamfäder. In vivo transplantation av de koloniserade tymiska lober visade vidare att även than mogen avkomma av E13 och E18 TSP har olika biologiska egenskaper in vivo. Tsk från den första vågen snabbt generera T-celler, men ger upphov till låga antalet αβ och γδ T-celler. Bland de senare vi upptäckt Vγ5Vδ1 dendritiska epitelceller T-celler (DETC), som har en invariant TcR, migrera till epidermis där de utövar en funktion vid sårläkning och endast tillverkas under fosterutvecklingen 10. Däremot TSP från den andra vågen tar längre tid att generera ett stort antal TcR + T-celler och är oförmögna att generera DETC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: alla experiment utfördes i enlighet med Pasteurinstitutet Ethic stadga, som antogs av den franska jordbruksdepartementet, och EU: s riktlinjer. En manipulator med utbildning på små gnagare kirurgi, certifierad av det franska ministeriet för jordbruk, utför alla kirurgiska ingrepp.
OBS: Se bilaga Tabell 1 visar 5-steg plan förfarandet.
1. Urval av de embryon
- Använd 36 C57BL / 6 CD45.2 kvinnor, 12 kvinnor CD45.1, 12 C57BL / 6 CD45.1 hanar och 12 C57BL / 6 CD45.2 män. Passerar honorna med antingen manlig genotyp kommer att producera embryon CD45.1 / 2 och CD45.1 användes som en källa för TSP eller CD45.2 användes som en källa för mottagande tymiska lober. House har alla män individuellt.
- För att erhålla embryon för E18 TSP isolering, placera 2 honor i en bur med en manlig CD45.1 på 06:00, 21 dagar före ympning experiment. Kontrollera förekomsten av en vaginal plugg nästa dag, före kl. Sepabetygsätta pluggade honorna.
- För att få E14 embryon som ska koloniseras av TSP, upprepa proceduren ovan (1,2), med hjälp av manlig CD45.2, 17 dagar före ympning experiment.
- För att få embryon att isolera E13 TSP, upprepa proceduren ovan (1,2), med hjälp av hannar C57BL / 6 CD45.1, 16 dagar före ympning experiment.
2. Dissekering av embryon under en horisontell laminärflödeshuv
OBS: Två dagar före ympning experiment.
- Offra dräktiga hondjur genom cervikal dislokation eller genom progressiv tillförsel av CO 2 gasen under åtminstone 5 minuter, i en mätt sluten kammare. Se till döden genom slutgiltiga arresteringen av hjärt-andningsrörelser. Blöt buken med 70% etanol.
- Gör en längsgående snitt i huden vid mittlinjen av buken och öppna den genom att dra i huden isär. Öppna bukhinnan med pincett och sax utan att röra matsmältningskanalen. Dra ut KLYVD uteross och skilja den från slidan med saxen.
- Placera livmodern i en 90 x 15 mm petriskål innehållande 40-50 ml DPBS och skär på tvären mellan varje embryots decidua.
- Med par fina spets sax och en fin pincett bort muskeln membranet i livmodern, ta ut embryon genom att skära mellan moderkakan och gulesäcken, och ta bort de Amnios, som behåller embryon.
- Placera embryon i en petriskål 90 x 15 mm innehållande HBSS + 1% fetalt kalvserum (FCS). För embryon äldre än E15, ta bort huvudet med en sax innan ytterligare dissekering.
3. Isolering av Thymus
- Enligt kikare förstoringsglas, placera embryot, som ligger i ryggläge (ventrala vy), på en våt gasväv sängar.
- Sätt en pincett i längdriktningen längs brosk av bröstbenet, nypa och öppna bröst nätet. Med böjda pincett, dra bröstväggen åt sidan för att visualisera thymic lober på varje sida av luftstrupen.
- Håll försiktigt varje lob genom att nypa under med en fin pincett och placera dem i en petriskål med 1 ml HBSS + 1% FCS. Isolera loberna och avlägsna omgivande bindväv med två 1 ml sprutor + 26 G ⅜ "nålar, utan att skada kapseln.
- Tvätta loberna i 3 ml HBSS + 1% FCS för att eliminera blodkroppar.
OBS! Innan E15 är tymiska lober placerade på vardera sidan av luftstrupen och senare säkring i mitten för att utgöra en bi-lobär orgel.
4. cellsuspensioner
- Reta isär lober under kikare förstoringsglas, med två 26 G nålar monterade på 1 ml sprutor, i HBSS + 1% FCS. Filtrera cellsuspensionen genom ett nylonnät.
5. Färgning med fluorescerande antikroppar och cellsortering
OBS: Alla antikroppar tidigare titreras för att uppnå optimal definition av befolkningen (den titratjon kan variera med antikroppen sats).
- Inkubera tymocyter (E13 eller E18) under 15-30 min vid 4 ° C med en 100 pl av en cocktail av biotinylerade antikroppar för att färga härstamnings positiva celler (anti-CD19, anti-Gr1, anti Ter119, anti-NK1.1 , anti- CD11c, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25).
- För att tvätta bort överskott av antikroppar spinn ner rören med 4 ml HBSS + 1% FCS vid 280 xg under 7 minuter, eliminera supernatanten och åter suspendera pelleten i färsk HBSS + 1% FCS. Upprepa centrifugeringen.
- Inkubera E18 biotinmärkta celler med streptavidin mikropärlor under 15 minuter vid 4 ° C och tvätta cellerna två gånger i HBSS 1% FCS. Återsuspendera cellerna i 2 ml HBSS + 1% FCS. De flesta E13 tymocyter är härstamning negativa och behöver därför inte MACS anrikning före cellsortering.
- Passera cellerna på LS-kolonn enligt tillverkarens instruktioner. När alla cellsuspensionen in i kolonnen tillsätt 2 ml HBSS + 1% FCS. Återställa4 ml av kolonnen flöda genom och centrifugera cellerna under 7 min vid 280 x g.
- Återsuspendera pelleten i antingen utarmade E18 eller totala E13 tymocyter i 50 pl av TSP-antikropp-blandning (anti-CD117 APC, anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24 FITC, anti-CD44 APCCy7 och streptavidin Pacific Blue ) och inkubera under 20 minuter vid 4 ° C i mörker.
- Tvätta cellerna med 4 ml HBSS + 1% FCS och återsuspendera cellerna i 1 ml HBSS + 1% FCS med propidiumjodid.
- Sortera den tsk Lin - CD44 + CD117 + CD24 låg CD127 + CD135 + celler i en FACS (med 4 lasrar) på en 1,5 ml rör innehållande 200 pl komplett medium + 20% FCS. Gate första cellerna efter deras storlek och kornighet på FSC och SSC kanaler. Eliminera döda celler (färgning med propidiumjodid), gate ut dubbletter och gör det fluorescens i exponentiella skalor. Omkring 100 eller 600 tsk kan erhållas från en E13 eller en E18 bräss, respektivEly.
6. Colonization av E14 Thymic lober med stamceller: Hanging Drop Teknik
- Bestråla (30 Grays = 30 Gy) E14 tymiska lober från CD45.2 embryon, 3 timmar innan kulturen.
OBS: E14 eller E15 tymiska lober har med framgång använts som mottagare av T-cellsföregångare. Använda mottagaren tymiska lober senare graviditets dagar leder till ökat nekros på grund av den större storleken på orgeln medan tymiska lober på tidigare graviditets dagar utvecklas dåligt, förmodligen på grund av ofullständig utveckling av epitelcellerna. - Centrifugera sorterat TSPS och återsuspendera cellerna i odlingsmedium (OPTI-MEM komplett medium med 10% FCS, penicillin (50 enheter / ml), streptomycin (50 | ig / ml) och 2β-merkaptoetanol (50 pM)), så att 35 il innehåller 500 TSP.
- Placera en 35 l droppe av cellsuspensionen varannan brunn på en 60 väl Terasaki-platta.
OBS: 35 l droppar kan smälta om de placeras i angränsande brunnar. - Placera en bestrålad lob på ytan av varje droppe. Stäng Terasaki-platta och vrid plattan upp och ner för att låta cellerna når den apikala pol nedgången av tyngdkraften.
- Hit försiktigt den övre sidan av den inverterade plattan att tvinga loberna att glida till den apikala kanten av droppen. Inkubera den inverterade Terasaki-platta i en fuktad inkubator under 48 h vid 37 ° C + 5% CO2. Efter kolonisering, antingen kultur E14 Thymi i FTOC 7, eller transplantat under njurkapseln hos en mottagande vuxen mus 8.
7. Fetal Thymic orgel kultur
- Placera 3 ml komplett medium på en 35 mm petriskål. Placera en isopore membranfilter flyter på mediet. Placera ombildade lober på kanten av membranet med en pincett (högst 8 lober på ett membran).
- Placera petriskålar innehållande tymiska lober i en 90 mm petriskål, tillsammans med en 35 mm maträtt, utan lock, innehållande 2 ml water, för att säkerställa optimal fuktighet. Inkubera 12 dagar vid 37 ° C + 5% CO2.
8. Transplantat under njurkapseln under sterila betingelser
OBS: njure parenkymet är omgiven av bindväv som bildar en kapsel. Underkapsel regionen är särskilt rik på blod och lymfkärl och därigenom ger en lämplig miljö för utveckling av transplantat (t.ex. tymiska lober, pankreasöar eller nyfödda hjärter). Transplantat görs vanligtvis på den vänstra njuren, eftersom det är mer tillgänglig än den högra njuren. CD3 - / - hanmöss användes som mottagare och därmed undvika transplantat-mot-värd-reaktion på grund av smärre histokompatibilitetsantigener kopplade till Y-kromosomen eftersom könsbestämning innan E15 inte är lätt gjort.
- Sterilisera instrumenten och bära sterila handskar längs operationen. Söva musen genom intraperitoneal injektion av en lösning av Ketamin 10 mg / ml + Xylazin 1 mg /ml utspädd i PBS: (50 till 100 | j, l per 10 g kroppsvikt), under användning av en 1 ml spruta. Kontrollera anestesi genom att kontrollera brist på inter reflexer. Placera en droppe av vattenkraft Optimune gel på varje öga för att förhindra torrhet under narkos.
OBS: Lösningen bör vara beredd ex tempore och värmdes vid rumstemperatur före injektion. Bedövningen varar minst 20 minuter. Graden av anestesi bör kontrolleras längs hela operationen. Bedövningen kan förlängas genom intraperitoneal injektion av halv dos varje 20 min. - Placera musen på sin högra sida, enligt ett horisontellt lamina flöde huva. Sterilisera det kirurgiska området med 70% etanol och 10% jodid HUD- lösning. Med en tång del musen håret längs en 2 cm lång precis ovanför leden mellan bakben. Raka operationsområdet.
- Med en skalpell, göra ett snitt 1,5 cm längd första, den kutana vävnaden, sedan med sax klippa muskelvävnad. Applicera ett lätt tryck mot båda sidor av snittet, Vilket kommer att tvinga njuren ur bukhålan.
- Applicera saltlösning med en bomulls-bud för att hålla njuren fuktig. Om du har svårt att utsätta organ, använda en platt pincett för att dra ut den omgivande adipocyt vävnad som njuren är fäst. Behåll njuren ur retroperitoneal kaviteten genom en bomullspinne placerad under orgeln.
- Med två fina pincett, gör en 2-3 mm hål i kapseln (Undvik att röra parenkymet för att förhindra blödning). Under hela kirurgiska ingrepp hålla den exponerade njurkapseln kontinuerligt fuktad.
- Sätt försiktigt flikarna under njurkapseln, genom att hålla väggen i kapseln öppnas och skjut transplantatet under kapseln mot kanten stolpen. Placera upp till 6 lober per njure.
- Ersätt njuren i retro peritonealhålan. Sutur muskel aponeuroses, sedan huden med enskilda kirurg knop. Blöt såret med 10% jodid povidon-lösning. Placera musen på en uppvärmd pad vid 37 ° C.
- Undersökning den transplanterade musen tills fullständig återhämtning från anestesi genom kontroll av hjärt-, lung- och morrhår rörelser, slemhinnor färger tills total återhämtning ses av självständiga rörelser.
OBS: Vi rekommenderar injektion av analgetisk lösning (Buprenorfin, 0,1 mg / kg) intra muskel strax efter operationen och 2 dagar efter operation för att förhindra post-kirurgi smärta. - Håll den opererade djur isolerade tills återhämtat sig helt. Inspektera varannan dag stygnen av såret för att kontrollera och förhindra infektion. Aldrig observerade sårinfektion efter den här proceduren.
OBS: Veckovis analys av perifera blodceller från CD3 - / - ympade möss tillåter oss att detektera tymus härledda populationer härstammar från antingen E13 eller E18 progenitorer använder CD45 allotypiska markör och T-cell härstamning specifika antikroppar (figur 3).
9. Analys av TSP avkomma genom flödescytometri
- Fläck cellsuspensioner från enskilda lober med en antikropp blandning innehållande antikroppar som känner igen CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, Vδ1 PE och inkubera enligt beskrivningen i avsnitt 5.
- Återsuspendera cellerna i HBSS + 1% FCS + propidiumjodid och analysera i en flödescytometer (se resultaten i figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att välja en metod för att utarma tymiska lober endogena tymocyter som möjliggör den bästa utvecklingen av koloniserande stamceller, vi jämförde nivåerna av T-cells beredning i tymiska lober koloniserade efter bestrålning eller en 5-dagars deoxi-guanosin (d-Gua) behandling. Resultaten visar att även om det inte finns någon skillnad på dag 9 av kultur, innehöll bestrålade lober fler T-celler än de som behandlades med d-Gua, på dag 12. Således är lämpligare än d-Gua behandling bestrålning för att erhålla T-cellutveckling efter tymisk kolonisering (Figur 1). För att studera den utvecklingsmässiga potential E13 och E18 TSP, koloniserade vi E14 bestrålas tymiska lober med en blandning av lika antal av de två typerna av stamceller. Resultaten visar att E13 TSPS ger upphov till färre tymocyter och mindre DP än E18 TSP men, i motsats, E13 TSP generera DETC och högre frekvenser av CD3 + mogna celler (Figur 2). För att analysera in vivo pottenrential- av E13 och E18 TSP ades tymiska lober koloniserade med varje typ av ursprungsceller ympade under njurkapseln av CD3 - / - mottagare. Resultaten visar att, i överensstämmelse med FTOC, E13 TSP gav upphov till T-celler snabbare än E18 progenitorer men antalet cirkulerande T-celler var signifikant lägre (figur 3).
Figur 1: cellutveckling T är mer effektiva i bestrålat än i deoxiguanosin behandlas, koloniserade tymiska lober E14 tymiska lober (CD45.2) var antingen bestrålat med 30 Gy eller behandlade i fem dagar med deoxi-guanosin (d-Gua).. Tymiska lober ades sedan koloniserats med 1000 Lin - CD117 + Sca-1 + (LSK) E14 FL celler isolerade från CD45.1 / 2 embryon, i hängande droppe för 48 h och odlades på ett filter. Inga skillnader observerades i effektivitet svdogenous tymocyt utarmning mellan de två grupperna av thymic lober. Utveckla tymocyter färgade med antikroppar mot CD45.1, CD45.2, CD3, Vγ5, Vδ1 och CD4 analyserades på dag 9 och 12 genom FACS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Till skillnad från E18, E13 tsk genererar Vγ5Vδ1 DETC CD45.2 thymic lober bestrålades och koloniserade under 48 timmar med en blandad cohort av 500 E13 TSP från CD45.1 / 2 embryon och 500 E18 TSP från CD45.1 embryon. . Under dessa experimentella betingelser, E13 och E18 TSP utvecklas i samma miljö och skillnader i graden av differentiering och mogna T-cellgrupper observerades efter odling kan bara spegla skillnader i cell inneboende biologiskaegenskaper. Efter 12 dagar i odling tymocyter från individuella lober analyserades genom flödescytometri efter färgning med antikroppar som känner igen CD45.1, CD45.2, CD4, CD8, CD3, Vγ5, Vδ1. (A) Paneler visar antalet celler som återvunnits i varje lob. (B) representant flödescytometri profiler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: E13 tsk utvecklas snabbare än E18 tsk CD45.2 thymic lober bestrålades och koloniserade under 48 timmar med 500 E13 TSP eller 500 E18 TSP från CD45.1 embryon.. CD3 - / - möss ympade med 4 thymic lober koloniserade med antingen E13 eller E18 tsk. Perifert blod samlades upp med veckointervall och analyserades med FACS för göreller (CD45.1) CD3 + T-celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| steg 1 | Parning möss för erhållande E18 embryon (dag -21); parning möss för erhållande E14 embryon (dag -17); parning möss för erhållande E13 embryon (dag -16) | ||
| steg 2a | Dissektion av embryona, dag -2 | ||
| steg 2b | Bestrålning av E14 tymus lober, dag -2 | ||
| steg 2c | Förbereda, färgning och sortering av celler från E13 och E18 tymiska lober, dag -2 | ||
| steg 2d | Droppe kultur, dag -2 | ||
| steg 3a | Fetal Thymic orgel kultur, dag 0 | ||
| steg 3b | Graft under njurkapseln, dag 0 | steg 4 | FTOC: flödescytometrianalys, dag 12 |
| steg 5 | Graft: vecko flödescytometrianalys av cirkulerande T-celler, dagar 15, 22, 35 |
Tabell 1: Proceduren 5-steg följt i tidtabellen av experimentet från parning av olika musstammar upp till en analys av de ympade mössen experiment.. Transplantat utförs i 7 veckor gamla möss. Att ta sig tid för transplantation som dag 0, är dag -21 parning hos möss för att få E18 embryon dag -17 för att få E14 embryon dag -16 för att få E13 embryon, och i dag -2 sorteringen av E13 och E18 TSP , bestrålning tymisk lob och hängande drop teknik.
| Antikropp | Klon Antal | Antikropp | Klon Antal | |
| CD25 | 7D4 | CD19 | 6D5 | |
| CD44 | IM7 | Ter 119 | TER-119 | |
| CD24 | M1 / 69 | NK1.1 | PK 136 | |
| CD117 | 2B8 | CD11c | HL3 | |
| CD3 | 145-2C11 | Gr1 | RB6-8C5 | |
| CD4 | RM4-5 | GD | eBioGL3 | |
| CD8 | 53-6,7 | Sca-1 | D7 | |
| CD135 | A2F10 | CD45.2 | 104 | |
| CD127 | A7R34 | Ly5.1 | A20 |
Tabell 2: Antikroppar och klonnummer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Två huvud analyser kan användas för att analysera T-celldifferentiering ex vivo. Den senast rapporterade är co-kultur av hematopoetiska stamceller med BM stromaceller, OP9, uttrycka ligander av Noth1, delta som 1 eller 4 12. Det är lätt att utföra, effektiv och känslig Detta 2-D-analys, vilket gör analysen på den enda cellnivå. Men varken stöder T-cellsutveckling bortom stadiet av DP eller generering av γδ DETC 13, som båda kräver direkta interaktioner med tymisk epitel.
FTOCs har länge använts för att analysera T-cell utveckling 3. Den största styrkan i denna analys tillåter generering av alla mogna T-cellsfack, en egenskap som beviljas av de effektiva 3-D interaktioner av tymocyter med tymisk epitel. Vi testade här två metoder som för närvarande används för att utarma endogena tymocyter vilket möjliggör effektiv kolonisering av exogena stamceller. Både joniserande strålning och deoxiguanosin behandling effektivt utarmat utveckla tymocyter. Dock endast bestrålade tymiska lober sustained en robust T-cellsutveckling under längre tidsperioder antyder att d-Gua behandling kan också påverka komponenterna i epiteliala utrymmet. Embryonala tymiska lober koloniserades av exogena stamceller med hjälp av "hängande drop" -metoden. Colonization av bestrålade lober med båda populationerna i konkurrens gör att upptäcka olika cell autonoma biologiska egenskaper. Colonization med endast en av TSP delmängder avslöjar deras differentiering kapacitet i en icke-konkurrensutsatt miljö.
Nackdelen med denna metod är en lägre effektivitet i frekvensen av TSP som utvecklas till T-celler i jämförelse med OP9Dl co-kulturer 14. Vi har emellertid gjort enkel DN1 eller DN2 celler att kolonisera enskilda tymiska lober med effektivitet närmare den som erhålls med stromaceller. En tiofaldig reduction i effektivitet av T-cellproduktion hittas när FL eller BM hematopoetiska progenitorer används för FTOC som inte observeras i OP9 deltaliknande kulturer. Detta mindre effektiv utveckling tyder på att inte alla BM eller FL-celler med T-cellpotential kan kolonisera bräss.
Ympning koloniserade tymiska lober ger en bättre syre- och näringstillförseln till att utveckla Thymi än i FTOC, och möjligheten att följa vad som händer med avkomman av TSP, in vivo. Med hjälp av dessa två kombinerade strategier kan vi beskriva stegen av differentiering och funktionell potential avkomma tsk. Eftersom CD3 - / - möss CD45.2 15, som inte kan utveckla mogna T-celler, användes som värdar, vi kunde tillsammans med CD45 allotypiska skillnader otvetydigt följa nyligen genererade T-celler i deras naturliga miljöer
De nya aspekterna av den experimentella procedur som beskrivs här är kombinationen av rekonstituerade FTOCmed in vivo transplantation. Detta gjorde det möjligt att identifiera och spåra avkomma av definierade grupper av hematopoetiska stamceller. Vi fann att TSP från de första och andra vågor genererar olika undergrupper av γδT celler, olika antal αβT celler och har olika kinetik för differentiering.
Stadium embryona: dagen 0 anses 18 timmar efter parning av mössen, enligt den plug-avkänning. Dissektioner av Thymi kräver en bra kallt ljus 150 W, en kikare dissektion mikroskop och lite övning för dissektioner, anestesi och förfaranden graft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Med stöd av Pasteurinstitutet, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant "Lymphopoiesis), den REVIVE Future Investment Program och" La Ligue contre le Cancer ".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26 G ⅜" 0.45 x 10 mm syringes with needles | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility actions |
| Ketamine 100 mg/ml (stock solution) | MERIAL | Anesthesic | |
| Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution | AXIENCE | Morphinic analgesic | |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | Eye protection | |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fetal calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2-Mercaptoethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine iris scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| 2 pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1x270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
- Rodewald, H. R.
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation. Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).
- Calderon, L., Boehm, T. Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments. Cell. 149, 159-172 (2012).
- Adolfsson, J., et al. Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment. Cell. 121, 295-306 (2005).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26, 678-689 (2007).
- Ramond, C., et al. Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus. Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).
- Allison, J. P., Havran, W. L. The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J.
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Barbee, S. D., et al. Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).
- Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver. Blood. 99, 463-471 (2002).
- Malissen, M., et al. Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene. EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).
