Abstract
Caratterizzare timo sedimentazione progenitori è importante per comprendere le fasi di pre-timici di sviluppo delle cellule T, essenziale per elaborare strategie di sostituzione delle cellule T nei pazienti linfocitopenico. Abbiamo studiato timica stabilirsi progenitori da murino giorno embrionale 13 e 18 thymi da due complementari in vitro ed in vivo le tecniche, sia in base al metodo "goccia appeso". Questo metodo ha permesso la colonizzazione irradiati lobi del timo fetale con E13 e / o E18 progenitori timo distinguono per CD45 marcatori allotypic e successive loro progenie così. La colonizzazione con popolazioni miste consente l'analisi di cellule differenze autonome in proprietà biologiche dei progenitori, mentre la colonizzazione sia con popolazione rimuove eventuali pressioni selettive competitive. I lobi timici colonizzati possono anche essere innestati immunodeficienti topi riceventi maschi consentono l'analisi della progenie di cellule T mature in vivo, quali la dinamica di popolazione di tegli PERIFERICA sistema immunitario e colonizzazione dei vari tessuti ed organi. Colture d'organo timo fetali hanno rivelato che i progenitori E13 sviluppato rapidamente in tutto mature cellule CD3 + e hanno dato luogo al sottoinsieme di cellule T γδ canonica, noto come le cellule T epiteliali dendritiche. In confronto, i progenitori E18 hanno una differenziazione ritardata e non erano in grado di generare cellule epiteliali T dendritiche. Il monitoraggio di sangue periferico di timo-innestato CD3 - / - mice inoltre dimostrato che progenitori E18 timica decantazione generano, con il tempo, un maggior numero di cellule T mature rispetto ai loro omologhi E13, una caratteristica che non poteva essere apprezzata nel timo fetale breve termine colture d'organo.
Introduction
Linfociti T, che porta il αβ o γδ recettore delle cellule T (TCR), si differenziano in un organo specializzato, il timo. Il timo completamente sviluppato è organizzato in due regioni distinte: la corteccia, dove progenitori timiche sviluppare e dove timociti che produttivamente riorganizzare i β TCR e catena geni α sono salvati dalla morte programmata (un processo noto come selezione positiva); e il midollo, dove scelto timociti con troppo forte reattività per auto-leganti vengono eliminati (selezione negativa) 1,2. Il timo proviene dallo strato endodermico del terzo sacchetto faringeo che è poi circondata da cellule mesenchimali 3. Si è colonizzata da progenitori ematopoietici a partire da giorno embrionali E12 e, da allora in poi, il reclutamento continua è necessaria per il normale sviluppo delle cellule T 4. Immigrati del timo evolvono attraverso fasi di sviluppo successive, orchestrato da un programma strettamente regolato, iniziato e maintained per l'attivazione della via di segnalazione di Notch sui timociti in seguito all'interazione con il suo ligando, delta come 4, espresso sulle cellule epiteliali del timo (TEC) 5.
Sviluppo timocita inizia il cosiddetto CD4 - CD8 - doppia negativi (DN) fasi. Timociti DN possono essere ulteriormente suddivisi secondo l'espressione di CD25 e CD44 in DN1 (CD25 - CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) e DN4 (CD25 - CD44 -). CD24 (HSA) e CD117 (c-Kit) suddivide ulteriormente il vano DN1 in 5 sottogruppi dove DN1A e b corrispondono ai primi progenitori timo (PTE). Timociti riordinare le δ, β e α catene TCR in fase di DN e sottoposti pre-TcR selezione (stadi DN3-DN4). Essi hanno inoltre il transito al CD4 + CD8 + doppio positiva (DP) del vano in cui la catena α TcR riorganizza prima sele positivi e negativiction. In questa fase la maggior parte dei timociti sono eliminati e solo una piccola percentuale (3-5%) raggiungono il CD4 + o CD8 + T maturi vano cella.
La differenziazione percorso linfoide progredisce attraverso le tappe di HSC che generano progenitori multipotenti (MPP) e progenitori multipotenti linfoidi predisposte (LMPP) che hanno perso il eritrociti e megacariociti potenziale 6. LMPP sono fenotipicamente definito dall'assenza di marcatori di cellule del sangue differenziate (lineage negative, Lin -), l'espressione di c-kit (CD117), Sca-1 e Flt3 / Flk2 (CD135) e l'assenza di livelli rilevabili di interleuchina ( IL) -7 recettore α catena (IL-7rα o CD127). LMPPs ulteriormente differenziarsi in progenitori comuni linfoidi (CLP) 7 che a quel punto hanno perso la capacità di generare cellule mieloidi. CLP conservare linfociti (B e T cellulare), delle cellule NK, DC e cellule linfoidi innate (ILC) potenziale, e differiscono da LMPP dall'espressione di CD127 e l'assenza di elevati livelli di Sca-1.
Anche se la natura dei timici assestamento progenitori (TSP) è stato ampiamente dibattuto 8, è diventato recentemente chiaro che il cambiamento TSP fenotipo, il potenziale e la funzione di differenziazione, durante tutto lo sviluppo 9. Abbiamo eseguito in vitro e in vivo per caratterizzare il TSP, isolato da FACS cell sorting sia da E13 (prima onda) o E18 (seconda ondata). Fetali colture d'organo del timo (FTOC) con lobi timici irradiati colonizzate da un numero uguale di E13 e E18 progenitori, tenendo diversi marker allotypic, ammessi dopo la loro prole in un ambiente di sviluppo simile e rivelate cellule proprietà intrinseche, diversi tra i due tipi di progenitori. Lobi del timo colonizzati da una E13 o E18 TSP permesso lo sviluppo senza selezione a causa della concorrenza tra i due progenitori. In vivo il trapianto dei lobi timici colonizzati ha dimostrato inoltre che anche tegli progenie maturo di E13 e E18 TSP hanno differenti proprietà biologiche in vivo. TSP dalla prima ondata rapidamente generano cellule T, ma danno origine a un basso numero di cellule αβ e γδ T. Tra questi ultimi abbiamo rilevato dendritiche cellule epiteliali Vγ5Vδ1 T (detc), che hanno un TcR invariante, migrano verso l'epidermide in cui esercitano una funzione nella guarigione delle ferite e sono prodotti solo durante lo sviluppo embrionale 10. Al contrario, TSP dalla seconda ondata richiede tempo maggiore per generare un numero elevato di cellule TcR + T e non sono in grado di generare DETC.
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Protocol
Dichiarazione etica: tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo l'Istituto Pasteur Etica Carta, approvato dal Ministero dell'Agricoltura francese, e gli orientamenti dell'Unione europea. Un manipolatore con la formazione su piccola chirurgia roditore, certificato dal Ministero dell'Agricoltura francese, esegue tutti gli interventi chirurgici.
NOTA: Vedere in allegato la tabella 1 mostra la procedura di programma in 5 fasi.
1. Selezione degli embrioni
- Utilizzare 36 C57BL femmine / 6 CD45.2, 12 femmine CD45.1, 12 C57BL / 6 maschi e 12 CD45.1 C57BL / 6 maschi CD45.2. Attraversando le femmine sia con genotipo maschio produrrà embrioni CD45.1 / 2 e CD45.1 usati come fonte di TSP o CD45.2 utilizzato come fonte di destinatario lobi timici. Casa tutti i maschi singolarmente.
- Per ottenere embrioni per isolamento E18 TSP, mettere 2 femmine in una gabbia con uno CD45.1 maschile alle 06:00, 21 giorni prima dell'esperimento innesto. Verificare la presenza di un tappo vaginale il giorno dopo, prima di mezzogiorno. Sepavalutare le femmine collegati.
- Per ottenere gli embrioni E14 per essere colonizzata da TSP, ripetere la procedura (1.2), utilizzando i maschi CD45.2, 17 giorni prima dell'esperimento innesto.
- Per ottenere gli embrioni per isolare E13 TSP, ripetere la procedura (1.2), utilizzando i maschi C57BL / 6 CD45.1, 16 giorni prima dell'esperimento innesto.
2. Dissezione del embrioni Sotto una orizzontale flusso laminare Hood
NOTA: due giorni prima dell'esperimento innesto.
- Sacrificare le femmine gravide per dislocazione cervicale o progressiva somministrazione di gas CO 2 per almeno 5 minuti, in una camera chiusa saturante. Garantire la morte per arresto definitivo dei movimenti cardio-respiratorio. Bagnare l'addome con il 70% di etanolo.
- Fate una incisione longitudinale nella pelle all'addome linea mediana e aprirlo tirando la pelle a parte. Aprire il peritoneo con pinze e forbici senza toccare il tratto digestivo. Estrarre il uter bifidanoi e separarlo dalla vagina con le forbici.
- Mettere l'utero in una capsula di Petri di 90 x 15 mm, contenente 40-50 ml DPBS e tagliare trasversalmente tra decidua di ogni embrione.
- Con la coppia di forbici punta fine e una pinza sottile rimuovere la membrana muscolare dell'utero, togliere gli embrioni tagliando tra la placenta e il sacco vitellino, e rimuovere i amnios, che è mantenere gli embrioni.
- Mettere gli embrioni in una capsula di Petri 90 x 15 mm contenente siero fetale di vitello HBSS + 1% (FCS). Per gli embrioni più vecchio di E15, togliere le teste con un paio di forbici prima di ogni ulteriore dissezione.
3. Isolamento del timo
- Sotto la lente d'ingrandimento binoculare, posizionare l'embrione, che giace in posizione supina (vista ventrale), su un letto di garza umida.
- Inserire una pinza longitudinalmente lungo la cartilagine dello sterno, pizzico e aprire la griglia toracica. Con pinze curve, tirare la parete toracica da parte per visualizzare il tlobi hymic su ciascun lato della trachea.
- Tenere con cura ogni lobo pizzicando sotto con una pinza sottile e metterli in una capsula di Petri contenente 1 ml HBSS + 1% FCS. Isolare i lobi e rimuovere il tessuto connettivo circostante con due 1 ml siringhe + 26 G ⅜ "aghi, senza danneggiare la capsula.
- Lavare lobi in 3 ml di HBSS + 1% FCS per eliminare le cellule del sangue.
NOTA: Prima E15, lobi timici sono situate su ciascun lato della trachea e fusibile successivamente nel mezzo di costituire un organo bi-lobare.
4. sospensioni cellulari
- Tease oltre i lobi sotto la lente di ingrandimento binoculare, con due aghi 26 G montate su 1 ml siringhe, in HBSS + 1% FCS. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una maglia di nylon.
5. La colorazione con anticorpi fluorescenti e ordinamento delle cellule
NOTA: Tutti gli anticorpi sono già titolati per ottenere la definizione ottimale delle popolazioni (il titration può variare con il lotto di anticorpi).
- Incubare i timociti (E13 o E18) per 15-30 minuti a 4 ° C con 100 pl di un cocktail di anticorpi biotinilati per colorare le cellule positive lineage (anti-CD19, anti-Gr1, anti-Ter119, anti-NK1.1 , CD11c anti-, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25).
- Per lavare via l'eccesso di anticorpi rallentano i tubi con 4 ml HBSS + 1% FCS a 280 xg per 7 minuti, eliminare il supernatante e ri-sospensione il pellet in fresco HBSS + 1% FCS. Ripetere la centrifugazione.
- Incubare le cellule marcati con biotina E18 con microsfere streptavidina durante 15 min a 4 ° C e lavare le cellule due volte in HBSS 1% FCS. Risospendere le cellule in 2 ml HBSS + 1% FCS. La maggior parte dei timociti E13 sono lignaggio negativo e, pertanto, non hanno bisogno di MACS arricchimento prima separazione delle cellule.
- Passare le celle nella colonna LS, secondo le istruzioni del produttore. Quando tutta la sospensione cellulare è entrato colonna aggiungere 2 ml HBSS + 1% FCS. Recuperare il4 ml della colonna scorrono attraverso e centrifugare le cellule per 7 minuti a 280 x g.
- Risospendere il pellet di una impoverito E18 o totali timociti E13 in 50 ml di miscela di anticorpi TSP (anti-CD117 APC, anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24 FITC, anti-CD44 APCCy7 e streptavidina Pacific Blue ) e incubare per 20 min a 4 ° C al buio.
- Lavare le cellule con 4 ml HBSS + 1% FCS e risospendere le cellule in 1 ml HBSS + 1% FCS con ioduro di propidio.
- Ordinare il TSP Lin - CD44 + CD117 + CD24 basso CD127 + CD135 + cellule in un FACS (con 4 laser) su un provette da 1,5 ml contenenti 200 ml terreno completo + 20% FCS. Prima porta le cellule in base alle loro dimensioni e granularità sulla FSC e canali SSC. Eliminare le cellule morte (colorazione con ioduro di propidio), cancello fuori doppiette e segnare la fluorescenza in scala esponenziale. Circa 100 o 600 TSP possono essere ottenuti da uno E13 o E18 uno timo, respectively.
6. La colonizzazione di E14 timica lobi con Progenitori: Hanging Tecnica Goccia
- Irradiare (30 Grays = 30 Gy) E14 lobi del timo da embrioni CD45.2, 3 ore prima della cultura.
NOTA: E14 o E15 lobi timici sono stati utilizzati con successo come destinatario di progenitori delle cellule T. Utilizzando destinatari lobi timici di successivi giorni gestazionale risultati in necrosi precoce a causa delle dimensioni più grandi dell'organo mentre lobi del timo in precedenti giorni di gestazione sviluppano male, probabilmente a causa di sviluppo incompleto delle cellule epiteliali. - Centrifuga allineati TSP e risospendere le cellule in terreno di coltura (OPTI-MEM terreno completo con il 10% FCS, penicillina (50 unità / ml), streptomicina (50 mg / ml) e 2β-mercaptoetanolo (50 micron)) tale che 35 ml contiene 500 TSP.
- Mettere una goccia di 35 ml di sospensione cellulare ogni altro bene di una piastra ben Terasaki 60.
NOTA: 35 gocce microlitri può fondere se sono collocati in pozzi contigui. - Inserire un lobo irradiati sulla superficie di ciascuna goccia. Chiudere la piastra Terasaki e ruotare la piastra capovolta per consentire le cellule raggiungono il polo apicale della goccia per gravità.
- Hit delicatamente il lato superiore della piastra capovolta per obbligare i lobi di scorrere verso il bordo apicale della goccia. Incubare la piastra Terasaki invertita in un incubatore umidificato per 48 ore a 37 ° C + 5% CO 2. Dopo la colonizzazione, sia la cultura E14 thymi in FTOC 7, o trapianto sotto la capsula renale di un destinatario del mouse per adulti 8.
7. fetale timica Cultura Organo
- Inserire 3 ml di terreno completo su una piastra di Petri da 35 mm. Inserire un filtro a membrana isopore galleggia sul supporto. Posizionare i lobi ricostituiti sul bordo della membrana con una pinza (non più di 8 lobi su una membrana).
- Porre le capsule Petri contenenti lobi timici all'interno di un piatto 90 millimetri Petri, insieme con un piatto 35 mm, senza coperchio, contenente 2 ml di water, per assicurare l'umidità ottimale. Incubare 12 giorni a 37 ° C + 5% CO 2.
8. Innesti sotto la capsula renale Under sterili Condizioni
NOTA: Il parenchima renale è circondato da tessuto connettivo formando una capsula. La regione sub-capsulare è particolarmente ricca di vasi sanguigni e linfatici fornendo in tal modo un ambiente adatto per lo sviluppo di innesti (ad esempio, i lobi del timo, isole pancreatiche o cuori neonati). Innesti si realizza al rene sinistro perché è più accessibile rispetto al rene destro. CD3 - / - topi maschi sono stati utilizzati come destinatari evitando reazione GVH a causa di antigeni di istocompatibilità minori legate al cromosoma Y, perché la determinazione del sesso prima di E15 non è fatto facilmente.
- Sterilizzare gli strumenti ed indossare guanti sterili lungo la chirurgia. Anestetizzare il mouse per iniezione intra peritoneale di una soluzione di ketamina 10 mg / ml + Xylazina 1 mg /ml diluito in PBS: (50 a 100 microlitri per 10 g di peso corporeo), utilizzando una siringa da 1 ml. Verificare anestesia verificando la mancanza di riflessi interdigitali. Mettere una goccia di gel idro-Optimune su ciascun occhio per prevenire la disidratazione durante l'anestesia.
NOTA: La soluzione deve essere preparata estemporaneamente e riscaldata a temperatura ambiente prima dell'iniezione. L'anestesia dura almeno 20 minuti. Il grado di anestesia dovrebbe essere controllato lungo tutta la chirurgia. L'anestesia può essere prolungata iniezione intra peritoneale di mezza dose ogni 20 min. - Posizionare il mouse sul lato destro, sotto una cappa a flusso lamina orizzontale. Sterilizzare il campo chirurgico con etanolo al 70% e il 10% di soluzione di ioduro dermica. Con una parte pinza capelli mouse lungo una lunghezza di 2 centimetri appena sopra l'articolazione della zampa posteriore. Radere l'area chirurgica.
- Con un bisturi praticare un'incisione 1,5 cm di lunghezza della prima, il tessuto cutaneo, quindi con forbici tagliare il tessuto muscolare. Applicare una leggera pressione su entrambi i lati dell'incisione, Che costringerà il rene fuori della cavità addominale.
- Applicare soluzione salina con un batuffolo di cotone con auricolari per mantenere il rene umido. Se avete difficoltà a esporre l'organo, utilizzare una pinza piatta per estrarre il tessuto adipociti circostante a cui è collegato il rene. Mantenere il rene fuori della cavità retroperitoneale da un batuffolo di cotone posto sotto l'organo.
- Con due pinza sottile, praticare un foro 2-3 mm nella capsula (evitare di toccare il parenchima per prevenire le emorragie). Durante tutta la procedura chirurgica mantenere la capsula renale esposti continuamente inumidito.
- Inserire attentamente i lobi sotto la capsula renale, mantenendo la parete della capsula aperta e far scorrere l'innesto sotto la capsula verso il polo bordo. Posizionare fino a 6 lobi per rene.
- Sostituire il rene nella cavità retro-peritoneale. Suturare la aponeurosi muscolare, poi la pelle con i singoli nodi chirurgo. Bagnare la ferita con soluzione al 10% di povidone ioduro. Posizionare il mouse su una pa riscaldatod a 37 ° C.
- Indagine il mouse trapiantato fino al completo recupero dall'anestesia per il controllo dei movimenti cardiaci, respiratori e basette, i colori delle mucose fino al recupero totale visto da Self Contained movimenti.
NOTA: si consiglia l'iniezione di soluzione analgesico (buprenorfina, 0,1 mg / kg) del muscolo intra subito dopo l'intervento chirurgico e 2 giorni dopo l'intervento per prevenire il dolore post-operatorio. - Mantenere l'animale operato in isolamento fino alla completa guarigione. Controllare ogni giorno i punti della ferita per verificare e prevenire l'infezione. Mai osservata infezione della ferita seguendo questa procedura.
NOTA: analisi settimanale di cellule del sangue periferico dal CD3 - / - mice innestate consentono di rilevare la timica popolazioni provenienti originati sia da E13 o E18 progenitori utilizzando il marcatore allotypic CD45 e lignaggio cellule T anticorpi specifici (Figura 3).
9. Analisi della progenie TSP mediante citometria di flusso
- Sospensioni cellulari Macchia da lobi individuali con una miscela di anticorpi contenenti anticorpi che riconoscono CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, Vδ1 PE e incubare come descritto nel capitolo 5.
- Risospendere le cellule in HBSS + 1% FCS + propidio ioduro e analizzare in un citometro a flusso (vedere i risultati in figura 2).
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Representative Results
Per scegliere un metodo per esaurire lobi timici di timociti endogeni che permettono il migliore sviluppo dei progenitori colonizzatrici, abbiamo confrontato i livelli di ricostituzione delle cellule T in lobi del timo colonizzati dopo l'irradiazione o un desossi-guanosina 5 giorni (d-Gua) trattamento. I risultati mostrano che, mentre non vi è alcuna differenza a giorno 9 della cultura, lobi irradiati contenevano più cellule T rispetto a quelli trattati con d-Gua, al giorno 12. Pertanto, l'irraggiamento è più appropriato di d-Gua trattamento per ottenere lo sviluppo delle cellule T dopo colonizzazione timica (Figura 1). Per studiare il potenziale di sviluppo di E13 e E18 TSP, abbiamo colonizzato E14 irradiato lobi del timo con una miscela di un numero uguale di due tipi di progenitori. I risultati mostrano che E13 TSPs generino meno timociti e meno DP di E18 TSP ma, al contrario, E13 TSP generare DETC e frequenze più elevate di CD3 + cellule mature (Figura 2). Per analizzare la pentola in vivoziale di E13 e E18 TSP, lobi timici colonizzati con ogni tipo di progenitori sono stati innestati sotto la capsula renale di CD3 - / - destinatari. I risultati mostrano che, coerentemente con la FTOC, E13 TSP ha dato origine a cellule T più veloce di progenitori E18 ma il numero di cellule T circolanti era significativamente inferiore (figura 3).
Figura 1: lo sviluppo delle cellule T è più efficiente in irraggiato che in deossiguanosina trattati, lobi timici colonizzati E14 lobi del timo (CD45.2) erano o irradiato con 30 Gy o trattati per 5 giorni con deossi-guanosina (d-Gua).. Lobi del timo sono state poi colonizzate con 1.000 Lin - CD117 + Sca-1 + cellule (TSS) E14 FL isolati da CD45.1 / 2 embrioni, in appeso goccia per 48 ore e coltivati su un filtro. Non sono state osservate differenze nell'efficienza di enendogena deplezione thymocyte tra i due gruppi di lobi timici. Sviluppare timociti colorate con anticorpi contro CD45.1, CD45.2, CD3, Vγ5, Vδ1 e CD4 sono stati analizzati a giorno 9 e 12 da FACS. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: A differenza di E18, E13 TSP generare Vγ5Vδ1 DETC CD45.2 lobi timici sono stati irradiati e colonizzate per 48 ore con una coorte mista di 500 E13 TSP da CD45.1 / 2 embrioni e 500 E18 TSP da embrioni CD45.1. . In queste condizioni sperimentali, E13 e E18 TSP si sviluppano nello stesso ambiente e le differenze nel tasso di differenziazione e di cellule T mature sottoinsiemi osservati dopo la cultura può solo riflettere differenze nella cella biologico intrinsecoproprietà. Dopo 12 giorni di coltura timociti dai singoli lobi sono stati analizzati mediante citometria a flusso dopo colorazione con anticorpi riconoscere CD45.1, CD45.2, CD4, CD8, CD3, Vγ5, Vδ1. (A) Pannelli mostrano il numero di cellule recuperate in ciascun lobo. (B) Flusso Rappresentante citometria profilo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: E13 TSP sviluppare più velocemente di E18 lobi CD45.2 timo sono stati irradiati e colonizzate per 48 ore con 500 E13 TSP o 500 E18 TSP da embrioni CD45.1 TSP.. CD3 - / - mice sono stati innestati con 4 lobi timici colonizzati sia con E13 o E18 TSP. Il sangue periferico è stato raccolto a intervalli settimanali e analizzati da FACS per Doné cellule (CD45.1) CD3 + T. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| passo 1 | Accoppiamento topi per ottenere embrioni E18 (giorno -21); accoppiamento topi per ottenere embrioni E14 (giorno -17); accoppiamento topi per ottenere embrioni E13 (giorno -16) | ||
| passaggio 2a | La dissezione degli embrioni, giorno -2 | ||
| passaggio 2b | L'irradiazione di E14 lobi del timo, giorno -2 | ||
| passaggio 2c | Preparazione, colorazione, e ordinamento delle cellule da E13 e E18 lobi del timo, giorno -2 | ||
| passaggio 2d | Hanging cultura goccia, giorno -2 | ||
| passo 3a | Fetale timica Cultura Organo, giorno 0 | ||
| passo 3b | Graft sotto la capsula renale, giorno 0 | punto 4 | FTOC: citometria a flusso, giorno 12 |
| punto 5 | Graft: flusso settimanale analisi di citometria di cellule T circolanti, giorni 15, 22, 35 |
Tabella 1: La procedura 5 fasi applicato nell'esperimento Time-table dell'esperimento dalla accoppiamento dei diversi ceppi di topi fino all'analisi dei topi innestati.. Innesti vengono eseguiti in sette settimane topi. Prendendo il momento del trapianto come giorno 0, giorno -21 è l'accoppiamento dei topi per ottenere embrioni E18, giorno -17 per ottenere embrioni E14, giorno -16 per ottenere embrioni E13, e nel giorno -2 smistamento dei E13 e E18 TSP , irradiazione lobi del timo e appeso tecnica goccia.
| Anticorpo | Numero Clone | Anticorpo | Numero Clone | |
| CD25 | 7D4 | CD19 | 6D5 | |
| CD44 | IM7 | Ter 119 | TER-119 | |
| CD24 | M1 / 69 | NK1.1 | PK 136 | |
| CD117 | 2B8 | CD11c | HL3 | |
| CD3 | 145-2C11 | Gr1 | RB6-8C5 | |
| CD4 | RM4-5 | GD | eBioGL3 | |
| CD8 | 53-6,7 | Sca-1 | D7 | |
| CD135 | A2F10 | CD45.2 | 104 | |
| CD127 | A7R34 | Ly5.1 | A20 |
Tabella 2: Anticorpi e clone numeri.
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Discussion
Due saggi principali possono essere utilizzati per analizzare differenziazione delle cellule T ex vivo. Il più recentemente riportato è il co-coltura di progenitori emopoietici con cellule stromali BM, OP9, esprimendo i ligandi di Noth1, delta come 1 o 4 12. Questo test 2-D è facile da eseguire, altamente efficiente e sensibile, permettendo analisi a livello di singola cellula. Tuttavia, esso non sostiene lo sviluppo delle cellule T oltre lo stadio di DP né la generazione di γδ DETC 13, entrambi i quali richiedono interazioni dirette con l'epitelio timico.
FTOCs sono da tempo utilizzati per analizzare lo sviluppo delle cellule T 3. Il punto di forza di questo saggio sta permettendo la generazione di tutti maturi compartimenti delle cellule T, un immobile concesso dalle efficaci interazioni 3-D di timociti con l'epitelio timico. Abbiamo testato qui due metodi attualmente utilizzati per esaurire timociti endogene permettendo così la colonizzazione efficiente progenitori esogeni. Sia ionizzanti irradiazione e deossiguanosina trattamento efficiente esaurita sviluppo timociti. Tuttavia, lobi timici solo irradiati sostenuti un robusto sviluppo delle cellule T per periodi di tempo più lunghi che suggeriscono che il trattamento d-Gua potrebbe anche influenzare componenti del compartimento epiteliale. Lobi timici embrionali furono colonizzate dai progenitori esogeni con il metodo "goccia appeso". Colonizzazione di lobi irradiati con entrambe le popolazioni in concorso consente di rilevare cellule differenti proprietà biologiche autonome. La colonizzazione con uno solo dei sottoinsiemi TSP rivela la loro capacità di differenziazione in un ambiente non competitivo.
Lo svantaggio di questo metodo è una minore efficienza nella frequenza di TSP che si sviluppano in cellule T rispetto a OP9Dl co-culture 14. Tuttavia abbiamo fatto cellule o DN1 DN2 singoli colonizzare singoli lobi timici con efficienza più vicina a quella ottenuta con le cellule stromali. A reductio dieci volten in efficienza della produzione delle cellule T è trovato quando FL o BM progenitori ematopoietici sono utilizzati per la FTOC non osservata nel delta OP9 come le culture. Questo sviluppo meno efficiente suggerisce che non tutte le cellule BM o FL con potenziale delle cellule T possono colonizzare il timo.
L'innesto lobi timici colonizzati offre una migliore offerta di sostanze nutritive e ossigeno per lo sviluppo thymi che in FTOC, e la possibilità di seguire il destino della progenie di TSP, in vivo. L'utilizzo di questi due strategie combinate potremmo descrivere le fasi di differenziazione e di potenziale funzionale della progenie di TSP. Perché CD3 - / - mice CD45.2 15, che non è in grado di sviluppare le cellule T mature, sono stati utilizzati come padroni di casa, si potrebbe insieme con le differenze allotypic CD45, senza ambiguità seguire le cellule T appena generato nei loro ambienti naturali
Il romanzo aspetti della procedura sperimentale qui descritta è la combinazione di FTOC ricostituitacon il trapianto in vivo. Questo ha permesso identificare e rintracciare la progenie di sottoinsiemi definiti di progenitori emopoietici. Abbiamo trovato che TSP dalla prima e seconda onde generare differenti sottogruppi di cellule γδT, diverso numero di cellule αβT e hanno diversi cinetica di differenziazione.
Stadio di embrioni: il giorno 0 è considerato 18 ore dopo l'accoppiamento dei topi, secondo il rilevamento spina. Dissezioni del thymi richiede una buona luce fredda 150 W, un microscopio dissezione binocolo e una certa pratica per dissezioni, anestesia e le procedure di innesto.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Supportato da l'Istituto Pasteur, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant 'linfopoiesi'), il REVIVE futuro programma di investimenti e "La Ligue contre le Cancer".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26 G ⅜" 0.45 x 10 mm syringes with needles | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility actions |
| Ketamine 100 mg/ml (stock solution) | MERIAL | Anesthesic | |
| Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution | AXIENCE | Morphinic analgesic | |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | Eye protection | |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fetal calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2-Mercaptoethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine iris scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| 2 pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1x270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
- Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu Rev Immunol. 26, 355-388 (2008).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation. Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).
- Calderon, L., Boehm, T. Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments. Cell. 149, 159-172 (2012).
- Adolfsson, J., et al. Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment. Cell. 121, 295-306 (2005).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26, 678-689 (2007).
- Ramond, C., et al. Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus. Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).
- Allison, J. P., Havran, W. L. The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Barbee, S. D., et al. Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).
- Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver. Blood. 99, 463-471 (2002).
- Malissen, M., et al. Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene. EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).
