Abstract
Характеризуя тимуса урегулирования предшественники важно понять заранее тимуса этапы развития Т-клеток, важно разработать стратегии для замены Т-клеток в lymphopenic пациентов. Мы изучили тимуса осаждения предшественников из мышиных эмбриональных день 13 и 18 thymi двумя дополнительными в пробирке и в естественных методов, как на основе метода "висячей капли". Этот метод позволил колонизации облученных плода тимуса долей с E13 и E18 / или тимуса предшественников отличаются CD45 allotypic маркеров и таким образом их потомства следующие. Колонизация смешанным населением позволяет анализировать клетки автономные различия в биологических свойств клеток-предшественников, а колонизация или населения удаляет возможные конкурентные давление отбора. Колонизированных тимуса долей также могут быть привиты в иммунодефицитных мышей-самцов-реципиентов, позволяющих анализа зрелого Т-клеток потомства в естественных условиях, например, динамики популяций Тон периферической иммунной системы и колонизации различных органов и тканей. Эмбриональные тимуса культуры органов показало, что E13 предшественники быстро превратился всех зрелых CD3 + клеток и привело к канонической подмножества γδ Т-клеток, известный как дендритные эпителиальные Т-клеток. Для сравнения, E18 предшественники имеют отсроченный дифференциации и были не в состоянии генерировать дендритные эпителиальные Т-клетки. Контроль периферической крови тимуса привитым CD3 - / - мышей показали также, что Е18 тимуса отстойные предшественники генерации, со временем, большее число зрелых Т-клеток, чем их коллеги E13, особенность, которая не может быть оценена в краткосрочной перспективе тимуса плода органов культуры.
Introduction
Т-лимфоциты, несущие на αβ или γδ T-клеточный рецептор (TCR), дифференцироваться в специальный орган, тимус. Полностью разработан тимус состоит из двух отдельных регионов: коры, где тимуса предшественники развивать и где тимоциты, что продуктивно переставить TCR β и α генов цепи спасенных от запрограммированной смерти (процесс, известный как позитивной селекции); и мозговое вещество, где выбрана тимоцитов слишком сильной реактивности самоуправлениям лигандов удаляются (негативный отбор) 1,2. Тимуса происходит из эндодермы слоем третьего глотки мешок, который позже в окружении мезенхимальных клеток 3. Это колонизирована гемопоэтических клеток-предшественников, начиная с эмбриональный день E12 и, после этого, непрерывный набор необходимого для развития Т-клеток нормального 4. Тимуса иммигранты развиваться через последовательные стадии развития, организованы жестко регулируется программе, инициированной и почтаntained по активации сигнального пути Notch на тимоцитов при взаимодействии с его лигандом, дельта, как 4, экспрессируется на эпителиальных клетках тимуса (ТИК) 5.
Развитие тимоцитов начинается в так называемой CD4 - CD8 - дважды отрицательный (DN) этапов. DN тимоцитов может быть далее подразделены в соответствии с выражением CD25 и CD44 в DN1 (CD25 - CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) и DN4 (CD25 - CD44 -). CD24 (HSA) и CD117 (с-Kit), дополнительно подразделяет отсек dN1 в 5 подмножеств, где DN1a и б соответствуют ранних предшественников тимуса (ETP). Тимоциты переставить TCR δ, β и α цепей на стадии DN и пройти предварительную TCR выбор (DN3-DN4 стадии). Они также транзит в CD4 + CD8 + двойной положительный (ДП) отсеке TcR α цепь переставляет до положительного и отрицательного Селеие. На этом этапе большинство тимоцитов устранены, и лишь небольшой процент (3-5%) достигают CD4 + или CD8 + Т-клеток зрелых отсек.
Лимфоидной дифференциация путь проходит через этапы, которые генерируют ГСК мультипотентные предшественники (MPP) и лимфоидных грунтовка мультипотентные предшественники (LMPP), которые потеряли эритроцитов и мегакариоцитов потенциальную 6. LMPP фенотипически определяется отсутствием дифференцированных клеток крови маркеров (род отрицательным, Лин -), выражение с-Kit (CD117), SCA-1 и Flt3 / Flk2 (CD135) и отсутствие заметных уровней интерлейкина ( Иллинойс) -7-рецептор α цепи (ИЛ-7rα или CD127). LMPPs дальнейшей дифференциации в общих лимфоидных клеток-предшественников (CLP) 7, которые на этом этапе потеряли способность генерировать миелоидных клеток. CLP сохранить лимфоцитов (B и Т-клетки), NK клетки, DC и врожденная лимфоидной клетки (ILC) потенциал, и отличаются от LMPP по выражению CD127 и отсутствие высоких уровней SCA-1.
Хотя природа тимуса урегулирования предшественников (TSP) был широко обсуждается 8, стало ясно, что в последнее время ТСП изменение фенотипа, дифференциация потенциал и функция, на протяжении развития 9. Мы выступали в пробирке и в естественных условиях анализов для характеристики ПБО, изолированных на FACS сортировки клеток или от E13 (первая волна) или E18 (вторая волна). Эмбриональные тимуса культуры органов (FTOC) с долей тимуса облученных колонизированных равных чисел E13 E18 и предшественников, несущих различные маркеры allotypic, разрешенных после их потомства в аналогичной среде развития и выявленных внутренние свойства клеток, различные между двумя типами клеток-предшественников. Тимуса долей, колонизированных или E13 или E18 TSP позволило развитие без выбора из-за конкуренции между двумя предшественников. В естественных условиях трансплантация колонизированных тимуса долях показали также, что также тон зрелый потомство E13 E18 и ТСП имеют различные биологические свойства в естественных условиях. TSPS от первой волны быстро генерировать Т-клетки, но приводят к низкой численности αβ и γδ Т-клеток. Среди последних мы обнаружили Vγ5Vδ1 дендритные эпителиальные клетки Т (DETC), которые имеют инвариант TcR, мигрируют в эпидермис, где они оказывают функцию в заживлении ран и производятся только во время эмбрионального развития 10. В отличие от этого, ТСП от второй волны занять больше времени, чтобы произвести большое число TcR + Т-клеток и не в состоянии генерировать DETC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: все эксперименты проводились в соответствии с Институтом Пастера этики Устава, утвержденного Министерством сельского хозяйства Франции, и с директивами ЕС. Манипулятор с обучением на небольшой операции грызунов, заверенная французского министерства сельского хозяйства, выполняет все хирургические вмешательства.
ПРИМЕЧАНИЕ: См в приложении таблице 1 показаны процедуры 5-ступенчатую плана.
1. Выбор эмбрионов
- Используйте 36 C57BL / 6 CD45.2 женщин, 12 женщины CD45.1, 12 C57BL / 6 CD45.1 мужчин и 12 C57BL / 6 CD45.2 мужчин. Пересечение самок либо с мужской генотип будет производить эмбрионы CD45.1 / 2 и CD45.1 используется в качестве источника TSP или CD45.2 используемого в качестве источника получателей тимуса долей. Дом все мужчины отдельности.
- Для получения эмбрионов для изоляции E18 TSP, 2 место самок в клетке с одной мужской CD45.1 в 6 часов вечера, 21 дней до эксперимента прививки. Проверьте наличие вагинальной пробки следующий день, до полудня. SepaОцените подключенный самок.
- Для получения эмбрионов E14 быть колонизирована TSP, повторите процедуру, описанную выше (1,2), используя самцов CD45.2, за 17 дней до эксперимента прививки.
- Для получения эмбрионов, чтобы изолировать E13 TSP, повторите процедуру, описанную выше (1,2), используя самцов C57BL / 6 CD45.1, 16 дней до эксперимента прививки.
2. Рассечение эмбрионов Под горизонтальной ламинарного потока Hood
ПРИМЕЧАНИЕ: За два дня до эксперимента прививки.
- Жертвоприношение беременных путем смещения шейных позвонков или прогрессивной администрации СО 2 в течение по меньшей мере 5 мин, в закрытой камере насыщения. Убедитесь, смерть окончательного ареста сердечно-дыхательных движений. Намочите живота с 70% этанола.
- Сделайте продольный разрез в коже в средней линии живота и откройте его, потянув кожу друг от друга. Откройте брюшины щипцами и ножницами, не касаясь пищеварительный тракт. Вытяните бифидобактерий Uterнам и отделить его от влагалища с ножницами.
- Поместите матку в 90 х 15 мм чашки Петри, содержащей 40-50 мл DPBS и сократить трансверсально между децидуальной каждого эмбриона.
- С парой тонких ножниц наконечником и тонких щипцов удалить мышечную оболочку матки, вынуть эмбрионов путем разрезания между плацентой и желточного мешка, и снимите amnios, который подпорных эмбрионов.
- Поместите эмбрионов в чашке Петри 90 х 15 мм, содержащие HBSS + 1% фетальной телячьей сыворотки (FCS). Для эмбрионы старше E15, удалить головы с ножницами перед дальнейшей диссекции.
3. Выделение тимуса
- Под увеличительным стеклом бинокулярного, поместите эмбриона, лежа в положении лежа на спине (вид снизу), на мокрой марли постельные принадлежности.
- Вставьте один пинцет в продольном направлении вдоль хряща грудины, зажать и открыть грудной сетку. С изогнутыми щипцами, тянуть грудной стенки в сторону, чтобы визуализировать тhymic выступов на каждой стороне трахеи.
- Тщательно провести каждый лепесток, зажимая под с тонким пинцетом и поместить их в чашку Петри, содержащую 1 мл HBSS + 1% FCS. Изолировать мочки и удалить соединительную ткань, окружающую с двумя 1 мл шприцев + 26 г ⅜ "иглы, не повреждая капсулу.
- Промыть долей в 3 мл HBSS + 1% FCS, чтобы устранить клетки крови.
Примечание: Перед E15, тимуса лопасти расположены на каждой стороне трахеи и последующего предохранителей в середине, чтобы составить би-долевой орган.
4. Клеточные суспензии
- Дразнить кроме мочки под бинокулярной лупой, с двумя иглами 26 G, установленных на 1 мл шприцы, в HBSS + 1% FCS. Фильтр клеточной суспензии через нейлоновое сито.
5. Окрашивание флуоресцентными антителами и сортировки клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Все антитела ранее титруют для получения оптимального определение популяции (titratион может меняться в зависимости от партии антител).
- Инкубируйте тимоцитов (E13 или E18) в течение 15-30 мин при 4 ° С с 100 мкл коктейля биотинилированных антител для окрашивания клональные положительных клеток (анти-CD19, анти-Gr1, анти-Ter119, анти-NK1.1 , анти-CD11c, анти-CD3, анти-CD4, анти-CD8, анти-CD25).
- Смыть избытка антител спин вниз трубы с 4 мл HBSS + 1% FCS в 280 мкг в течение 7 минут, устранить супернатант и ресуспендирования осадка в пресной HBSS + 1% FCS. Повторите центрифугирования.
- Инкубируйте биотин-меченых клеток E18 стрептавидином микросфер в течение 15 мин при 4 ° С и промыть клетки дважды HBSS в 1% FCS. Повторное приостановить клеток в 2 мл HBSS + 1% FCS. Большинство тимоциты E13 являются Lineage отрицательным и, следовательно, не нужно MACS обогащение до сортировки клеток.
- Pass клеток на колонке LS, в соответствии с инструкциями изготовителя. Когда все клеточной суспензии введен в столбце добавить 2 мл HBSS + 1% FCS. Восстановление4 мл колонке течь через центрифугу и клетки в течение 7 минут при 280 х г.
- Повторное приостановить гранул либо обедненным E18 или E13 общего тимоцитов в 50 мкл смеси антител TSP (анти-CD117 APC, анти-CD135 ПЭ, анти-CD127 PECy7, анти-CD24 FITC, анти-CD44 APCCy7 и стрептавидином Pacific Blue ) и инкубируют в течение 20 мин при 4 ° С в темноте.
- Вымойте клеток с 4 мл HBSS + 1% FCS и вновь приостановить клеток в 1 мл HBSS + 1% FCS с пропидийиодидом.
- Сортировать TSPS Лин - CD44 + CD117 + CD24 + CD127 низкий CD135 + клеток в FACS (с 4 лазеров) на 1,5 мл пробирки, содержащие 200 мкл полной среды + 20% FCS. Ворота первые клетки в зависимости от их размера и степени детализации на FSC и SSC каналов. Устранить мертвые клетки (окрашивание пропидийиодидом), ворота из дублеты и забить флуоресценцию в показательных масштабах. Около 100 или 600 TSPS могут быть получены из одного E13 или E18 одной тимуса, respectivЭли.
6. Колонизация E14 тимуса Лопасти с прародителей: капля крови Техника
- Облучают (30 Грейс = 30 Гр) E14 тимуса долей от эмбрионов CD45.2, 3 ч до культуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: E14 E15 или тимуса доли были успешно использованы в качестве получателя Т-клеток-предшественников. Использование получателей тимуса долей поздних гестационный дней приводит преждевременной некроза в связи с большим размером органа, а тимуса долей на более ранних сроках беременности дней развиваются слабо, вероятно, из-за неполного развития эпителиальных клеток. - Центрифуга сортируются ОТУ и повторно приостанавливать клеток в культуральной среде (OPTI-MEM полной среде с 10% FCS, пенициллина (50 единиц / мл), стрептомицин (50 мкг / мл) и 2β-меркаптоэтанола (50 мкм)), таких, что 35 мкл содержит 500 ПБО.
- Поместите каплю 35 мкл клеточной суспензии и каждый из 60 также Тарасаки пластины.
Примечание: 35 мкл капли могут сливаться, если они размещены в смежных скважин. - Поместите один лепесток облученного на поверхности каждой капли. Закройте TERASAKI пластину и поверните пластину вниз, чтобы клетки достигают апикальной полюс капли под действием силы тяжести.
- Хит осторожно верхняя сторона перевернутой пластиной, чтобы заставить лопасти, чтобы скользить к апикальной краю капли. Инкубируйте перевернутой Тарасаки пластины в увлажненном инкубаторе в течение 48 ч при 37 ° C ± 5% CO 2. После колонизации, либо культуры E14 thymi в FTOC 7 или трансплантата под почечную капсулу реципиентной взрослой мыши 8.
7. эмбрионального тимуса Орган Культура
- Поместите 3 мл полной среды на 35 мм чашки Петри. Разместить isopore мембранный фильтр с плавающей на носителе. Поместите восстановленные долей на краю мембраны с пинцетом (не более 8 выступов на одной мембраны).
- Поместите чашки Петри, содержащие тимуса долей в чашку Петри 90 мм, вместе с 35-мм блюдо, без крышки, содержащую 2 мл водоснаг, чтобы обеспечить оптимальную влажность. Выдержите 12 дней при 37 ° C ± 5% CO 2.
8. Прививки Под почечную капсулу в стерильных условиях
Примечание: паренхима почек окружена соединительной ткани, образующего капсулу. Суб-капсульного область особенно богата кровеносными и лимфатическими сосудами, таким образом, обеспечивая благоприятную среду для развития трансплантатов (например тимуса долей, панкреатических островков или новорожденных сердца). Трансплантаты обычно делается на левой почки, потому что это более доступным, чем правой почки. CD3 - / - мышей-самцов были использованы в качестве получателей, таким образом, избежать РТПХ из-за незначительных антигенов гистосовместимости, связанных с Y-хромосоме, потому что определение пола, прежде чем E15 не легко сделать.
- Стерилизовать инструменты и носить стерильные перчатки вдоль хирургии. Обезболить мышь, внутрибрюшинной инъекции раствора кетамина 10 мг / мл + Ксилазин 1 мг /мл разведенного в PBS: (от 50 до 100 мкл на 10 г веса тела), используя 1 мл шприц. Проверьте анестезии, проверяя отсутствие межпальцевых рефлексов. Поместите каплю гидро-Optimune геля на каждый глаз, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: решение должно быть подготовлено для немедленного и нагревают при комнатной температуре перед инъекцией. Анестезия длится по меньшей мере 20 мин. Степень анестезии следует контролировать по всей операции. Анестезия может быть продлен внутрибрюшинной инъекции дозы половине каждого 20 мин. - Наведите на правой стороне, под горизонтальной капотом пластинка потока. Стерилизовать хирургическое поле с 70% этанола и 10% йодида дермы решения. С щипцов части волос мыши по длине 2 см чуть выше сустава задней ноги. Бритье хирургическую область.
- С помощью скальпеля, сделать надрез на 1,5 см длины первого, кожной ткани, а затем с ножницами вырезать мышечную ткань. Нанесите небольшое давление к обеим сторонам разреза, Который заставит почку из брюшной полости.
- Применить раствор ватным почкой, чтобы сохранить почку влажной. Если у вас есть трудности в разоблачении орган, использовать плоские щипцы, чтобы вытащить окружающей адипоцитов ткани, к которой прикреплен почек. Поддержание почку из забрюшинного полости с помощью ватного тампона помещен под орган.
- С двумя тонких щипцов, сделать 2-3 мм отверстие в капсуле (не касаясь паренхимы, чтобы предотвратить кровотечение). В течение всего хирургического вмешательства держать открытую капсулу почки постоянно увлажняется.
- Вставка тщательно лепестки под почечную капсулу, при поддержании стенки капсулы открыт, и скользить трансплантата под капсулой к краю полюса. Поместите до 6 лепестков на почки.
- Замените почку в ретро-перитонеального полости. Шовный мышечные апоневрозов, то кожу с отдельными хирург узлов. Намочите рану 10% йодида раствор повидон. Наведите на нагретой годовыхд при 37 ° С.
- Рассмотрите не пересаженных мышь до полного выхода из наркоза по контролю сердечных, респираторных и усов движений, слизистой цветов до полного восстановления видел себя не содержащихся движения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем инъекцию обезболивающего раствора (Buprenorphin, 0,1 мг / кг) внутри мышц сразу после операции и 2 дня после операции, чтобы предотвратить послеоперационной боли. - Держите управляется животное в изоляции до полного восстановления. Осмотрите каждый день стежки раны, чтобы проверить и предотвратить инфекцию. Никогда не наблюдается раневой инфекции после использования этой процедуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Еженедельный анализ клеток периферической крови от CD3 - / - мышей, привитые позволит нам обнаружить тимуса, полученные популяции возник либо из E13 или E18 предшественников, используя CD45 allotypic маркер и Т-клеток происхождение специфических антител (рисунок 3).
9. Анализ потомства TSP с помощью проточной цитометрии
- Пятно клеточные суспензии из отдельных лепестков с смесь антител, содержащие антитела, распознающие CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4, CD8 APCCy7 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, PE Vδ1 и инкубировать, как описано в разделе 5.
- Повторное приостановить клеток в HBSS + 1% FCS + пропидий йодида и анализировать в проточном цитометре (см результаты на фиг.2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для того чтобы выбрать способ истощить тимуса долей эндогенных тимоцитов, позволяющих лучшее развитие колонизации предшественников, мы сравнили уровни Т-клеток восстановления в тимуса долях колонизированных после облучения или 5-дневный дезокси-гуанозин (D-Гуа) лечения. Результаты показывают, что в то время как нет никакой разницы на 9-й день культуры, облученные лопасти содержали больше Т-клеток, чем у пациентов, получавших д-Gua, в день 12. Таким образом, облучение является более подходящим, чем д-Gua лечения, чтобы получить развитие Т-клеток после тимуса колонизации (Рисунок 1). Для изучения с развитием потенциал E13 и E18 TSP, мы колонизировали E14 облучают тимуса долей смесью равных количеств двух типов клеток-предшественников. Результаты показывают, что Е13 TSPS привести к менее тимоцитов и меньше, чем DP E18 TSP, но, в отличие от Е13 ТСП генерировать DETC и выше частоты CD3 + зрелые клетки (рисунок 2). Для анализа банк в естественных условияхференциальное из E13 и E18 TSP, тимуса долей колонизировали с каждым типом клеток-предшественников были привиты в соответствии с почечной капсулы CD3 - / - получателей. Результаты показывают, что, в соответствии с FTOC, E13 ТСП привело к Т-клеток быстрее, чем E18 предшественников, но количество циркулирующих Т-клеток была значительно ниже (фиг.3).
Рисунок 1: Развитие Т-клеток является более эффективным, чем в облученных в дезоксигуанозина обработанной, колонизировали тимуса долей тимуса E14 доли (CD45.2) были либо облучают в дозе 30 Гр или обработанные в течение 5 дней с дезокси-гуанозина (d-Гуа).. Тимуса лопасти были затем колонизировали в 1000 Lin - CD117 + SCA-1 + (LSK) E14 FL клетки, выделенные из CD45.1 / 2 эмбрионов, в висячей капли в течение 48 ч, и культивируют на фильтре. Никаких различий не наблюдалось в эффективности анdogenous тимоцитов истощение между двумя группами тимуса долях. Разработка тимоцитов окрашенные антителами против CD45.1, CD45.2, CD3, Vγ5, Vδ1 и CD4 были проанализированы в день 9 и 12 по FACS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: В отличие от E18, E13 TSPS генерации Vγ5Vδ1 DETC CD45.2 тимуса лопасти облучались и колонизировали в течение 48 ч со смешанным когорте 500 E13 TSP от CD45.1 / 2 эмбрионов и 500 Е18 TSP из эмбрионов CD45.1. , В этих экспериментальных условиях, E13 и E18 ТСП развиваться в той же среде и различий в скорости дифференцировки и зрелые Т-клеток подмножеств наблюдаемых после культуры может отражать только различия в клеточной внутренней биологическихсвойства. Через 12 дней в культуре тимоцитов из отдельных лепестков были проанализированы с помощью проточной цитометрии после окрашивания антитела, распознающие CD45.1, CD45.2, CD4, CD8, CD3, Vγ5, Vδ1. (A) Панели показывают число клеток, обнаруженных в каждой доле. (B), представитель проточной цитометрии профилей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: E13 TSPS развиваться быстрее, чем Е18 TSPS CD45.2 тимуса долей облучали и колонизировали в течение 48 часов с 500 E13 TSP или 500 E18 TSP от эмбрионов CD45.1.. CD3 - / - мышей были привиты с 4 тимуса долях колонизированных или E13 или E18 ОТУ. Периферической крови были собраны с недельными интервалами и анализировали с помощью FACS для делни (CD45.1) CD3 + Т-клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| шаг 1 | Спаривание мышей, чтобы получить эмбрионы E18 (день -21); спаривания мышей, чтобы получить эмбрионы E14 (день -17); спаривания мышей, чтобы получить эмбрионы E13 (-16 день) | ||
| шаг 2а | Вскрытие эмбрионов, -2 день | ||
| шаг 2b | Облучение E14 тимуса долей, день -2 | ||
| шаг 2с | Подготовка, окрашивание и сортировки клеток E13 E18 и тимуса долей, день -2 | ||
| шаг 2d | Висячие падение культуры, день -2 | ||
| шаг 3а | Эмбрионального тимуса органной культуре, день 0 | ||
| шаг 3b | Прививка под капсулой почек, день 0 | шаг 4 | FTOC: проточной цитометрии анализа, 12 день |
| шаг 5 | Прививка: еженедельно проточной цитометрии анализа циркулирующих Т-клеток, дней 15, 22, 35 |
Таблица 1: 5-ступенчатая процедура в эксперименте расписание эксперимента от скрещивания различных линий мышей до анализа привитых мышей.. Трансплантатов выполнены в 7-недельных мышей. Принимая время трансплантации, как день 0, день -21 это спаривание мышей, чтобы получить эмбрионы E18, день -17 до получения эмбрионов E14, день -16 до получения эмбрионов E13, а в день -2 сортировка E13 E18 и TSP облучение тимуса доли и висит метод падение.
| Антитело | Клон Количество | Антитело | Клон Количество | |
| CD25 | 7D4 | CD19 | 6D5 | |
| CD44 | IM7 | Тер 119 | ТЕР-119 | |
| CD24 | М1 / 69 | NK1.1 | ПК 136 | |
| CD117 | 2В8 | CD11c | ХЛ3 | |
| CD3 | 145-2С11 | Gr1 | RB6-8C5 | |
| CD4 | RM4-5 | Д. | eBioGL3 | |
| CD8 | 53-6.7 | SCA-1 | D7 | |
| CD135 | A2F10 | CD45.2 | 104 | |
| CD127 | A7R34 | Ly5.1 | А20 |
Таблица 2: Антитела и клон цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Две основные анализы могут быть использованы для анализа Т-клеток дифференциации экс виво. Недавно сообщил в совместное культивирование гемопоэтических клеток-предшественников с стромальных клеток, OP9, выражая лиганды Noth1, дельта, как 1 или 4 12. Этот 2-D анализа легко выполнить, высокоэффективным и чувствительной, что позволяет анализа на один уровень клеток. Тем не менее, ни поддерживает развитие Т-клеток за пределами стадии DP, ни генерации γδ DETC 13, оба из которых требуют непосредственного взаимодействия с тимуса эпителия.
FTOCs уже давно используются для анализа T развития клеток 3. Главная сила этого анализа позволяет поколение всех зрелых Т-клеток отсека, недвижимость, предоставленную эффективных 3-D взаимодействий тимоцитов с вилочковой эпителия. Мы протестировали здесь два метода в настоящее время используются для истощения эндогенных тимоцитов, таким образом, позволяя эффективно колонизацию экзогенных предшественников, Оба ионизирующего облучения и дезоксигуанозин лечение эффективно обедненного разработке тимоцитов. Тем не менее, только облученные тимуса долей устойчивый надежный развитие Т-клеток в течение более длительных периодов времени, предполагая, что лечение D-Gua может также влиять на компоненты эпителиальных отсека. Эмбриональные тимуса доли были колонизированы экзогенных предшественников, используя метод "висячей капли". Колонизация облученных лепестков с обеих популяций в конкурсе позволяет обнаруживать различные клеточные биологические свойства автономные. Колонизация только с одним из подмножеств TSP обнаруживает их дифференциации потенциала в неконкурентной среде.
Недостатком этого способа является низкая эффективность по частоте ПБО, которые развиваются в Т-клетках, по сравнению с OP9Dl совместных культурах 14. Однако мы сделали одиночные или DN1 DN2 клеток колонизировать тимуса отдельных лепестков с эффективностью ближе к полученной с клетками стромы. Десять раз доведениен в эффективности производства Т клеток происходит тогда, когда FL или BM гемопоэтические клетки-предшественники используются для FTOC, что не наблюдается в OP9 дельта как культур. Это менее эффективно развитие предполагает, что не все клетки BM или FL с Т-клеточной потенциала могут колонизировать тимуса.
Прививка колонизированных тимуса долей предлагает более питательный и кислорода к разработке thymi чем в FTOC, и возможность следить за судьбу потомства TSP, в естественных условиях. С помощью этих двух комбинированных стратегий мы могли бы описать этапы дифференциации и функционального потенциала потомства ОТУ. Потому CD3 - / - мышей CD45.2 15, что не может развиваться зрелые Т-клетки, были использованы в качестве хозяев, мы могли бы вместе с allotypic различий CD45, однозначно следовать вновь созданные Т-клеток в их естественной среде
Новые аспекты экспериментальной процедуры, описанной здесь сочетание водостойких FTOCс пересадкой в естественных условиях. Это позволило идентификации и отслеживания потомство определенных подмножеств гемопоэтических клеток-предшественников. Мы обнаружили, что TSP из первой и второй волны генерируют различные подмножества γδT клеток, различное число αβT клеток и имеют различные кинетики дифференцировки.
Стадия эмбрионов: 0 день считается 18 ч после спаривания мышей, в соответствии с разъемом обнаружения. Вскрытия о thymi требует хорошего холодного света 150 Вт, бинокулярный микроскоп рассечение и некоторую практику для вскрытия, анестезии и процедур привитых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Поддерживается в Институте Пастера, INSERM, Национальное агентство по исследованиям ANR (Гранта "лимфопоэза"), возродить инвестиционной программы будущего и "La Ligue CONTRE ле рака".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26 G ⅜" 0.45 x 10 mm syringes with needles | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility actions |
| Ketamine 100 mg/ml (stock solution) | MERIAL | Anesthesic | |
| Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution | AXIENCE | Morphinic analgesic | |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | Eye protection | |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fetal calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2-Mercaptoethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine iris scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| 2 pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1x270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
- Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu Rev Immunol. 26, 355-388 (2008).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation. Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).
- Calderon, L., Boehm, T. Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments. Cell. 149, 159-172 (2012).
- Adolfsson, J., et al. Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment. Cell. 121, 295-306 (2005).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26, 678-689 (2007).
- Ramond, C., et al. Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus. Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).
- Allison, J. P., Havran, W. L. The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Barbee, S. D., et al. Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).
- Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver. Blood. 99, 463-471 (2002).
- Malissen, M., et al. Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene. EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).
