Abstract
Timik çökelme progenitörlerin karakterize lenfopeni hastada T hücresi değiştirilmesi için stratejiler geliştirmek için gerekli T hücresi gelişiminin önceden timik aşamaları anlamak önemlidir. Biz in vitro tamamlayıcı iki ile fare embriyonik gün 13 ve 18 Thymi gelen atalarıdır yerleşme timus okudu ve in vivo tekniklerin, hem "asılı damla" yöntemine dayalı. Bu yöntem, E13 ve / veya E18 onların soyu takip böylece CD45 alotipik belirteçler ve ayırt timik ataları ile ışınlanmış fetal timus lobları kolonize izin verdi. Nüfusu ile ya kolonizasyon olası rekabet seçici baskıları kaldırır ise karışık nüfusa sahip kolonizasyon atalarıdır biyolojik özelliklerinde hücre özerk farklılıkları analiz sağlar. kolonize timik lobları aynı zamanda t nüfus dinamikleri olarak in vivo olgun T hücre soyu analizi sağlayan bağışık yetmezliği erkek alıcı fareler, aşılı olabilirO bağışıklık sistemini ve farklı doku ve organlarda kolonizasyonu periferik. Fetal timik organ kültürleri E13 ataları içine tüm hızla gelişmiştir CD3 + hücreleri olgun ortaya ve dendritik epitel T hücreleri olarak bilinen kurallı γδ T hücre alt kümesi, doğurdu. Buna karşılık, E18 ataları gecikmiş farklılaşma ve dendritik epitel T hücrelerini oluşturmak için koyamadık. / - - timus aşılı CD3 periferik kan izleme farelerin daha E18 timik çökelme ataları, zamanla, kısa vadeli fetal timus takdir edilemedi bir özellik onların E13 muadillerine göre daha olgun T hücrelerinin büyük sayılar üretmek olduğunu gösterdi organ kültürleri.
Introduction
T lenfositleri, αβ ya γδ T hücresi reseptörü (TcR) taşıyan, özel bir organ timus ayırt eder. tam gelişmiş timus iki ayrı bölgeye düzenlenmiştir: verimli TcR β ve α zincir genleri yeniden timositleri programlanmış ölüm (pozitif seleksiyon olarak bilinen bir süreç) kurtarıldı olan timik ataları geliştirmek korteks ve; ve öz-ligantlarına çok güçlü reaktivitesi olan timositleri seçilen medulla, (negatif seleksiyon) 1,2 silinir. timus sonra mezenkimal hücreler 3 ile çevrilidir üçüncü faringeal kese endodermal tabakasının kaynaklanır. Bu tarihten sonra, sürekli işe normal T hücre gelişimi 4 için gerekli olan embriyonik gün E12 ve başlayan hematopoetik atalarıdır tarafından kolonize edildi. Timik göçmenler sıkıca düzenlenmiş bir program başlatılan ve mai tarafından orkestra, ardışık gelişim aşamalardan gelişmeye4 gibi bir ligandı ile etkileşimi üzerine timositler ile Çentik sinyal yolunun aktivasyonu, delta ile ntained, timik epitelial hücreler (Tecs) üzerinde eksprese 5.
Timosit geliştirme sözde CD4 başlar - CD8 - çift negatif (DN) aşamaları. , DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) ve DN4 (CD25 - CD44 -) - DN timositleri, daha DN1 (CD44 + CD25) içerisine CD25 ve CD44 ekspresyonu göre bölünebilir. CD24 (HSA) ve CD117 (c-Kit) daha DN1a b erken timik atalarıdır (ETP) karşılık 5 alt içine DN1 bölmesi subdivides. Timositleri DN aşamada TcR δ, β ve α zincirleri yeniden düzenlemek ve pre-TcR seçimi (DN3-DN4 aşamaları) tabi. TcR α zincir pozitif ve negatif sele öncesinde yeniden düzenler CD4 + CD8 + çift pozitif (DP) bölmeye Onlar daha geçişction. Bu aşamada en timositleri ortadan kalkar ve sadece küçük bir yüzdesi (% 3-5) CD4 + ulaşmak veya CD8 + T hücre bölmesini olgun.
lenfoid farklılaşma yolu multipotent atalarıdır (MPP) ve eritrosit ve megakaryosit 6 potansiyel kayıp lenfoid hazırlanmış multipotent atalarıdır (LMPP) oluşturmak HKH'lerin aşamalarında ilerler. , C-Kit (CD117) ekspresyonunu, Sca-1 ve Flt3 / flk2 (CD135) ve interlökin saptanamaz düzeylerde yokluğunda (- LMPP fenotipik (soy negatif Lin) farklılaşmış kan hücresi belirleyicilerinin olmaması ile tanımlanır IL) -7 zincir α reseptörü (IL-7rα veya CD127). LMPPs ayrıca bu aşamada tarafından miyeloid hücreleri üretmek için kapasite kaybetmiş ortak lenfoid atalarıdır (CLP) 7 ayırt. CLP lenfosit (B ve T hücresi), NK hücre, DC ve doğal lenfoid hücre (LAK) potansiyelini korumak ve CD1 ifadesi ile LMPP farklılık27 ve Sca-1, yüksek düzeyde olmaması.
Timik yerleşme atalarıdır (TSP) doğası yoğun 8'e tartışılan olmasına rağmen, son zamanlarda belli oldu bu gelişme 9 boyunca TSP değişim fenotip, farklılaşma potansiyeli ve fonksiyon. Biz E13 (ilk dalga) ya da E18 (ikinci dalga) arasından sıralama FACS hücre tarafından izole TSP karakterize in vitro ve in vivo deneyler gerçekleştirildi. Eşit E13 ve E18 progenitörlerinin numaraları, farklı alotipik belirteçleri taşıyan tarafından kolonize benzer gelişimsel ortamda döl aşağıdaki izin ve atalarıdır her iki tip arasındaki farklı hücre içsel özellikleri, ortaya ışınlanmış timik loblar fetal timus organ kültürleri (FTOC). E13 veya E18 TSP biri tarafından kolonize timik lob nedeniyle her iki atalarıdır arasındaki rekabete seçim olmadan gelişmesini sağladı. Kolonize timik lobların in vivo nakli daha göstermiştir ki, aynı zamanda tO E13 olgun döl ve E18 TSP in vivo olarak farklı biyolojik özelliklere sahip. Ilk dalganın gelen TSPs hızlı bir şekilde T hücreleri oluşturmak ancak αβ ve γδ T hücrelerinin sayısının az neden olmaktadır. İkincisi arasında biz bir değişmez TcR'ler, onlar yara iyileşmesinde bir işlev uygulamayın ve sadece embriyonik gelişim sırasında 10 üretilen epidermis göç var Vγ5Vδ1 dendritik epitel T hücrelerini (DETC), algıladı. Buna karşılık, TSP ikinci dalga gelen TcR + T hücrelerinin yüksek sayıda üretmek için uzun zaman alabilir ve DETC üretmek mümkün değildir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik deyimi: Bütün deneyler Fransız Tarım Bakanlığı tarafından onaylanmış Pasteur Enstitüsü Etik Şartı göre gerçekleştirilen ve AB direktiflerine bulundu. Fransa Tarım Bakanlığı tarafından onaylı küçük kemirgen cerrahisi eğitimi olan bir manipülatör, tüm cerrahi müdahaleler yapar.
NOT: 5 aşamalı planı prosedürünü gösteren Ek Tablo 1'de bakın.
Embriyolar 1. Seçim
- 36 C57BL / 6 CD45.2 kadın, 12 kadın CD45.1, 12 C57BL / 6 CD45.1 erkek ve 12 C57BL / 6 CD45.2 erkekler kullanın. Erkek genotip ile ya kadın Geçiş embriyolar CD45.1 / 2 ve CD45.1 alıcı timik lobların bir kaynak olarak kullanılabilir veya TSP CD45.2 bir kaynak olarak kullanılabilir üretecektir. Ev tek bütün erkekler.
- , E18 TSP izolasyonu için embriyolar elde 21 gün aşılama deneyden önce 06:00, az bir erkek CD45.1 ile bir kafes içinde 2 kadın yerleştirmek için. Öğleden önce, ertesi gün bir vajinal fiş varlığını kontrol edin. Sepatakılı kadın oranı.
- E14 embriyolar elde etmek için TSP tarafından kolonize edilmesi, 17 gün aşılama deneyden önce erkek CD45.2 kullanarak, (1.2) Yukarıdaki işlemi tekrarlayın.
- E13 TSP izole etmek için embriyolar elde etmek için, 16 gün aşılama deneyden önce, erkek C57BL / 6 CD45.1 kullanarak, (1.2) Yukarıdaki işlemi tekrarlayın.
Bir yatay Laminar Flow Hood altında Embriyolar 2. diseksiyonu
NOT: aşılama deneyden önce iki gün.
- Bir doyurarak kapalı bir odada, en az 5 dakika boyunca, servikal dislokasyon ile veya CO2 gazı aşamalı uygulama hamile kadın Kurban. Kardiyo-solunum hareketlerinin kesin tutuklama ile ölüm sağlayın. % 70 etanol ile karın ıslak.
- Orta hat karın derisinde uzunlamasına bir kesi yapmak ve birbirinden cilt çekerek açın. Sindirim sistemi dokunmadan forseps ve makas ile periton açın. Bifid uter çekinBizim makas ile vajinadan ayırmak ve.
- 40-50 ml DPBS içeren 90 x 15 mm Petri kabındaki rahim yerleştirin ve her embriyonun desidua arasında enine kesti.
- Ince uçlu makas çifti ve ince forseps ile rahim kas membran kaldırmak plasenta ve yolk kesesi arasındaki kesim tarafından embriyoların almak ve embriyoların istinat olduğu amnios kaldırmak.
- Petri kabı embriyolar yerleştirin HBSS +% 1 fetal buzağı serumu içeren 90 x 15 mm (FCS) üretildi. E15 daha embriyolar yaşlı için, başka diseksiyonu önce bir makas ile kafaları çıkarın.
Thymus 3. İzolasyonu
- Binoküler büyütücü mercek altında, ıslak bir gazlı yatak üzerinde, yatar pozisyonda (ventral görünüm) yatan, embriyo yerleştirin.
- Uzunlamasına sternum kıkırdak boyunca bir forseps yerleştirin çimdik ve göğüs ızgara açın. Kavisli bir forseps ile t görselleştirmek için bir kenara göğüs duvarı çekintrakea her iki tarafında hymic loblar.
- Dikkatle ince bir forseps ile altında sıkıştırılarak her lob tutun ve 1 ml HBSS +% 1 FCS içeren bir Petri kabındaki koyun. Lobları yalıtmak ve kapsül zarar vermeden, iki 1 ml şırınga + 26 G ⅜ "iğneler ile çevresindeki bağ dokusu çıkarın.
- Kan hücrelerinin ortadan kaldırmak için HBSS +% 1 FCS, 3 ml loblar yıkayın.
Not: E15 önce, timik loblar iki-lob organı teşkil etmek ortasında trakea ve daha sonra sigorta her iki tarafında yer almaktadır.
4. Hücre süspansiyonları
- HBSS +% 1 FCS 1 ml şırınga üzerine monte edilen iki 26 G iğne ile, binoküler büyütücü mercek altında lobları ayrı kızdırmak. Bir naylon örgü ile hücre süspansiyonu Filtre.
Floresan Antikor ve Hücre Sorting 5. Boyama
NOT: Tüm antikorlar daha önce nüfus optimal tanımı (titrat elde etmek için titre ediliriyon) antikor, parti ile değişebilir.
- Soy pozitif hücreleri boyamak için biyotinile edilmiş antikorların bir karışımı içinde bir 100 ul ile 4 ° C sıcaklıkta, 15-30 dakika boyunca timositleri (E13 ya da E18) inkübe (anti-CD19, anti-Gr1 anti-Ter119 anti-NK1.1 , anti-CD11c, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25).
- Antikorlar 7 dakika boyunca 280 xg'de 4 ml HBSS +% 1 FCS tüpler aşağı spin uzakta fazlalığının yıkamak için, süpernatant ortadan kaldırmak ve yeniden askıya taze HBSS +% 1 FCS pelet. Santrifüj tekrarlayın.
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca streptavidin ile mikro E18 biyotin-etiketli hücreler inkübe ve iki kez HBSS% 1 FCS hücreleri yıkayın. 2 ml HBSS +% 1 FCS hücreleri yeniden askıya. En E13 timositleri soy negatif ve bu nedenle hücre sıralama öncesinde MACS zenginleştirme gerekmez.
- Üreticinin talimatlarına göre, LS sütun üzerinde hücrelere geçerler. Tüm hücre süspansiyonu girdiğinde sütun 2 ml HBSS +% 1 FCS ekleyin. KurtarmakSütun 4 ml 280 x g'de, 7 dakika boyunca hücreler akmasına ve santrifüjlenir.
- Yeniden askıya tükenmiş E18 ya TSP antikor karışımı, 50 ul (anti-CD117 APC, anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24 FITC, anti-CD44 APCCy7 ve streptavidin Pacific Blue toplam E13 timositlerin ya pelet ) ve karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika inkübe edilir.
- 4 ml HBSS +% 1 FCS ve hücreleri yıkayın 1 ml HBSS propidium iyodür ile +% 1 FCS hücreleri yeniden askıya.
- Sıralama TSPs Lin - 200 ul komple ortam +% 20 FCS içeren bir 1.5 ml tüpler üzerine (4 lazerler ile) FACS CD44 + CD117 + CD24 düşük CD127 + CD135 + hücreler. FSC ve SSC kanallarda boyutu ve ayrıntı gibi kapı İlk hücre. (Propidyum iyodür ile boyama), ölü hücreleri, kapı dışarı çiftleri ortadan kaldırmak ve üstel ölçeklerde floresan puan. 100 civarında veya 600 TSPs bir E13 ya da bir E18 timus, respectiv elde edilebilirely.
Progenitörlerin 6. Kolonizasyon E14 ve Timik lobları: Asma Bırak Tekniği
- (30 Griler = 30 Gy) CD45.2 embriyolardan E14 timik lobları, kültür önce 3 saat ışın tedavisi.
NOT: E14 veya E15 timik loblar başarılı bir şekilde, T hücresi soylarının alıcı olarak kullanılmıştır. Erken gebelik günlerde timik lob kötü geliştirmek ise muhtemelen epitel hücrelerinin eksik gelişimine nedeniyle organın büyük boyutuna erken nekroz sonraki gebelik günler sonuçlarının alıcı timus lobları kullanma. - Santrifüj TSPs ve yeniden askıya hücreleri kültür ortamında (% 10 FCS ile OPTI-MEM tam ortam, penisilin (50 birim / ml), streptomisin (50 ug / ml) ve 2β-merkaptoetanol (50 uM)) kriteri şekilde 35 ul 500 TSP içerir.
- 60 de Terasaki plakanın her sıra hücre süspansiyonu, 35 ul damla yerleştirin.
NOT: bitişik kuyular yerleştirilir eğer 35 ul damla sigorta olabilir. - Her damla yüzeyinde biri ışınlanmış lobunu yerleştirin. Terasaki plakasını kapatın ve hücreler yerçekimiyle damla apikal kutbu ulaşmak izin ters plaka çevirin.
- Hit yavaşça ters plakanın üst tarafı damla apikal kenarına slayt lobları zorlamak için. 37 ° C ila +% 5 CO2 seviyesinde 48 saat boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde ters Terasaki tabağı inkübe edin. Bir alıcı yetişkin fare 8 böbrek kapsülü altında kolonizasyon ya kültür E14 FTOC 7 Thymi veya greft sonra.
7. Fetal Timik Organ Kültürü
- 35 mm Petri tabağına tam ortam 3 ml yerleştirin. Ortam üzerinde yüzen bir isopore zar filtresi yerleştirin. Forseps (bir membran üzerinde en fazla 8 lob) zarın kenarında yeniden loblar yerleştirin.
- Su sağlama 2. ml içeren, kapaksız, bir 35 mm çanak ile birlikte, bir 90 mm Petri kabı içinde timik lobu içeren Petri kapları yerleştirinr, uygun nem sağlamak. 37 ° C ila +% 5 CO2 seviyesinde 12 gün inkübe edilir.
Steril Koşullarda Böbrek Kapsül altında 8. Greftler
Not: Böbrek parenşiması bir kapsül oluşturan bağ dokusu ile çevrilidir. Alt kapsül bölge kan ve böylece greft gelişmesi için uygun bir ortam (örneğin timik lobları, pankreas adacıkları veya yenidoğan kalpleri) sağlayan lenfatik damarlarda özellikle zengindir. Doğru böbrek daha erişilebilir olduğundan greftler genellikle sol böbrek yapılır. CD3 - / - erkek fareler E15 önce cinsiyet belirleme kolaylıkla yapılabilir çünkü alıcılar böylece nedeniyle Y kromozomu bağlantılı küçük doku uygunluk antijenleri konakçı tepkimesiyle kaçınarak olarak kullanılmıştır.
- Aletleri sterilize ve ameliyat boyunca steril eldiven giyin. Ketamin 10 mg / ml + Ksilazin, 1 mg içeren bir çözeltiye içi enjeksiyonu ile fare anestezisi /ml PBS içinde seyreltilmiş (10 g vücut ağırlığı başına 50-100 ul), bir 1 ml şırınga ile. Interdijital reflekslerin eksikliğini kontrol ederek anestezi doğrulayın. Anestezi sırasında kurumasını önlemek için her gözün üzerine hidro-Optimune jel damla yerleştirin.
NOT: Çözelti ekstemporane şekilde hazırlanır ve enjeksiyondan önce oda sıcaklığında ısıtılmalıdır. Anestezi en az 20 dakika sürer. Anestezi derecesi, tüm ameliyat boyunca kontrol edilmelidir. Anestezi, her 20 dakikada bir doz devre içi enjeksiyonu ile uzatılabilir. - Yatay lamina akış kaputu altında, onun sağ tarafta fare yerleştirin. % 70 etanol ve% 10 iyodid dermal çözeltisi ile cerrahi alanında sterilize edin. Bir forseps kısmı ile sadece arka bacak eklem üzerinde 2 cm uzunluğu boyunca fare saç. Cerrahi alan tıraş.
- Bir neşter ile, makas kas dokusu kesim daha sonra, ilk olarak, cilt dokusuna bir insizyon 1.5 cm uzunluğunda tercih. Kesi her iki taraf için hafif bir basınç uygulayın, Karın boşluğu dışında böbrek zorlar hangi.
- Nemli böbreği korumak için pamuk tomurcuğu ile tuzlu su uygulayın. Eğer organa açığa zorluklar varsa, böbrek bağlı olduğu çevredeki adiposit doku çekerek düz forseps kullanabilir. Organın altına yerleştirilen bir pamuklu çubukla ile retroperitoneal boşluğundan dışarı böbrek koruyun.
- İki ince forseps ile, (kanamayı önlemek için parankimi dokunmaktan kaçının) kapsül içinde 2-3 mm'lik bir delik yapmak. Bütün cerrahi işlem sırasında sürekli olarak nemli maruz böbrek kapsülü tutun.
- Açılan kapsülün duvarı koruyarak, böbrek kapsülü altında dikkatlice lobları yerleştirin ve kenar kutup doğru kapsülün altında greft kaydırın. Böbrek başına 6 lobları kadar yerleştirin.
- Retro periton boşluğuna böbrek değiştirin. Kas aponörozlar, bireysel cerrah knot daha sonra deriyi dikin. % 10 iyodür povidon solüsyonu ile yarayı ıslatın. Isıtmalı pa üzerinde fare yerleştirin37 ° C 'de, d.
- Kalp, solunum ve bıyık hareketler, kendi tarafından görülen toplam kurtarma hareketleri içeriyordu kadar mukozal renklerin kontrolü ile anesteziden tam iyileşme kadar nakledilen fare Anketi.
NOT: Biz sadece cerrahi sonrası analjezik solüsyonu (Buprenorphin, 0.1 mg / kg) içi kas enjeksiyonu tavsiye ve 2 gün ameliyat sonrası ağrıyı önlemek için ameliyat takip. - Tamamen iyileşene kadar tecrit işletilen hayvan tutun. Doğrulamak ve enfeksiyonu önlemek için her geçen gün yara dikiş kontrol edin. Bu prosedür takip yara enfeksiyonu gözlendi asla.
NOT: CD3, periferal kan hücrelerinin haftalık analizi - / - aşılanmış farenin bize toplumlarında CD45 allotipik işaretleyici ve T hücre soyu spesifik antikorlar (Şekil 3) kullanılarak E13 ya da E18 progenitörlerinin ya kaynaklanan timus algılamasını sağlar.
Akış Sitometrisi ile TSP döl 9. Analizi
- Bir antikor karışımı CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan CD4 APCCy7 CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, PE Vδ1 tanıyan antikorları içeren ve bölüm 5'de tarif edildiği gibi inkübe bireysel loblar Leke hücre süspansiyonları.
- HBSS +% 1 FCS + propidyum iyodür hücreleri yeniden askıya alma ve (Şekil 2'de B deki sonuçlara bakınız), bir akış sitometresiyle analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kolonize atalarıdır iyi gelişmesini sağlayan endojen timositlerin timus lobları tüketmek için bir yöntem seçmek için, biz ışınlama sonrası kolonize timik loblarda T hücre sulandırma seviyelerini veya 5 günlük deoksi-guanozin (d-Gua) tedavisi karşılaştırıldı. Sonuçlar kültür 9. günde fark varken, ışınlanmış loblar Böylece 12. gün ile ışınlama sonra T hücresi gelişimini elde etmek üzere D-Gua tedaviden daha uygun olduğunu, d-Gua ile tedavi edilenlerden daha fazla T hücrelerini içerdiğini gösterdi timus kolonizasyon (Şekil 1). E13 ve E18 TSP gelişim potansiyelinin incelenmesi için, E14 progenitörlerinin iki tip eşit sayıda bir karışımı ile, timik loblar ışınlanmış kolonize. Sonuçlar E13 TSPs aksine az timositlerde ve E18 TSP daha az DP ancak neden olduğunu göstermektedir, E13 TSP DETC ve CD3 + ve yüksek frekanslarda hücreleri (Şekil 2) olgun üretir. In vivo pot analiz etmek/ - - E13 ve E18 TSP ential, atalarıdır her türü ile kolonize timik lob CD3 böbrek kapsülü altında aşılanmıştır Alıcıları. Sonuçlar FTOC ile tutarlı olarak, E13 TSP hızlı E18 progenitörlerin daha T hücrelerine yol açan fakat dolaşan T hücrelerin sayısı, önemli ölçüde daha düşük (Şekil 3) olarak, göstermektedir.
Şekil 1: T hücresi gelişimi, tedavi edilen deoksiguanosin daha kolonize timik loblar ışınlanmış daha verimlidir E14 timik loblar (CD45.2) vardı ya da 30 Gy ile ışınlanmış veya deoksi-guanozin (d-GUA), 5 gün süre ile muamele edilmiştir.. Bir filtre üzerinde 48 saat süreyle damla ve kültürlü asılı, CD117 + Sca-1 CD45.1 / 2 embriyolar izole + (LSK) E14 FL hücreleri - Timik lob sonra 1000 Lin ile kolonize edildi. Herhangi bir fark en etkinliği gözlenmiştirtimik lobların iki grup arasında talebinin endojen timosit tükenmesi. CD45.1, CD45.2, CD3, Vγ5, Vδ1 ve CD4 karşı antikorlar ile boyandı timositleri Geliştirme FACS günün 9 ve 12 analiz edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: E18 aksine, E13 TSPs oluşturmak Vγ5Vδ1 DETC CD45.2 timik loblar ışınlanmış ve CD45.1 embriyolar CD45.1 / 2 embriyolardan 500 E13 TSP ve 500 E18 TSP karışık kohort ile 48 saat süre ile kolonize edildi. . Bu deneysel koşullar altında, E13 ve E18 TSP sadece hücre içsel biyolojik farklılıkları yansıtmak aynı çevre ve kültür sonra gözlemlenen farklılaşma ve olgun T hücre alt oranında farklılıklar gelişirözellikleri. Bireysel loblar kültür timositlerde 12 gün sitometrisi antikorlar CD45.2, CD4, CD8, CD3, Vγ5, Vδ1 CD45.1 tanıma ile lekelemeden sonra akış sitometrisi ile analiz edildikten sonra. (A) Paneller Her lobda kazanılan hücre sayıları gösterir. (B) profilleri sitometri Temsilcisi akış. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: E13 TSPs daha hızlı geliştirmek E18 TSPs CD45.2 timik lobları ışınlanmış ve 500 E13 TSP veya CD45.1 embriyolardan 500 E18 TSP ile 48 saat boyunca kolonize edildi.. CD3 - / - fareler E13 veya E18 TSPs biriyle kolonize 4 timik lobları ile aşılanmıştır. Periferal kan, haftalık aralıklarla toplandı ve do için FACS ile analiz edilmiştirne (CD45.1) CD3 + T hücreleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| adım 1 | E18 embriyoların (gün -21) elde etmek için farelerin çiftleşme; E14 embriyoların (gün -17) elde etmek için farelerin çiftleşme; E13 embriyoların elde etmek için farelerin çiftleşme (gün -16) | ||
| adım 2a | Embriyoların diseksiyonu, gün -2 | ||
| adım 2b | E14 timik lobların Işınlama, gündüz -2 | ||
| adım 2c | , Boyama hazırlama ve E13 ve E18 hücreleri sıralama timik lobları, gün -2 | ||
| adım 2d | Asma damla kültür, gün -2 | ||
| adım 3a | Fetal Timik Organ Kültür, gün 0 | ||
| adım 3b | Böbrek kapsülü altında Graft, gün 0 | Adım 4 | FTOC: sitometri analizi akışı, gün 12 |
| Adım 5 | Ekleme: T hücrelerinin, dolaşımdaki sitometri analizi haftalık akışı, gün 15, 22, 35 |
Tablo 1:. 5 aşamalı bir prosedür aşılı farelerin analizine kadar farklı fare suşlarının çiftleşme gelen deney deney Zaman tabloda izledi. Greftler 7 haftalık farelerden gerçekleştirilir. Gün 0 olarak transplantasyon zaman ayırdığınız gün -21 E18 embriyoların elde etmek için farelerin çiftleşme, E14 embriyoların elde etmek için gün -17, E13 embriyoların elde etmek için gün -16, gündüz -2 E13 ve E18 TSP sıralama olduğunu , ışınlama timik lob ve açılan tekniği asılı.
| Antikor | Klon No | Antikor | Klon No | |
| CD25 | 7D4 | CD19 | 6D5 | |
| CD44 | IM7 | Ter 119 | TER-119 | |
| CD24 | M1 / 69 | NK1.1 | PK 136 | |
| CD117 | 2B8 | CD11c | HL3 | |
| CD3 | 145-2C11 | Gr1 | RB6-8C5 | |
| CD4 | RM4-5 | GD | eBioGL3 | |
| CD8 | 53-6,7 | Sca-1 | D7 | |
| CD135 | A2F10 | CD45.2 | 104 | |
| CD127 | A7R34 | Ly5.1 | A20 |
Tablo 2: Antikorlar ve klon numaraları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İki temel deneyler T hücre farklılaşmasını ex vivo olarak analiz etmek için kullanılabilir. En son bildirilen 1 veya 4 12 gibi Noth1 ligandlar, delta ifade BM stromal hücreler, OP9 ile hematopoetik atalarıdır ko-kültür. Bu 2 D tahlili de analiz sağlayan, son derece verimli ve hassas gerçekleştirmek kolay Tek hücreli seviyesi. Ancak, ne timik epitel ile doğrudan etkileşimleri gerektiren her ikisi de DP aşamasında ne γδ DETC 13 nesil ötesinde T hücre gelişimini destekler.
FTOCs uzun T hücresi gelişimini 3 analiz etmek için kullanılmıştır. Bu testin en önemli gücü tüm nesil T hücre bölmeleri, timik epitel ile timositlerin verimli 3-D etkileşimleri tarafından verilen bir özelliğe olgun izin veriyor. Biz burada iki yöntem halen böylece eksojen atalarıdır tarafından verimli kolonizasyonu sağlayan endojen timositleri tüketmek için kullanılan test. Hem iyonlaştırıcı radyasyon ve deoksiguanozin tedavisi verimli timositleri gelişmekte tükenmiş. Ancak, yalnızca ışınlanmış timik lob da epitel bölmesinin bileşenlerini etkileyebilecek bu D-Gua tedavi düşündüren uzun süre için sağlam T hücresi gelişimini sürdürmüştür. Embriyonik timus lobları "asılı damla" yöntemini kullanarak eksojen atalarıdır tarafından kolonize edildi. Yarışmaya her iki nüfusa sahip ışınlanmış lob Kolonizasyon farklı hücre özerk biyolojik özellikleri tespit sağlar. TSP alt yalnızca biriyle kolonizasyonu olmayan bir rekabet ortamında farklılaşma kapasitesi ortaya koymaktadır.
Bu yöntemin dezavantajı, OP9Dl ko-kültürler 14 ile karşılaştırıldığında T hücrelerine dönüşebilir TSP frekansında düşük verimliliktir. Ancak biz yakın stromal hücreler ile elde edilene verimlilik ile bireysel timik lobları kolonize tek DN1 veya DN2 hücreleri yaptık. Bir on kat reductioFL veya BM hematopoietik progenitörlerin kültürler gibi OP9 delta görülmez FTOC için kullanılan, n, T hücresi üretiminin verimliliği bulunur. Bu daha az verimli gelişme T hücre potansiyeli olan tüm BM veya FL hücreleri timus kolonize edemez düşündürmektedir.
Kolonize timik lobu Aşılama FTOC daha Thymi geliştirmek için daha iyi bir besin ve oksijen kaynağı ve in vivo, TSP döl kaderini takip imkanı sunuyor. Bu iki kombine stratejiler kullanarak biz farklılaşma ve TSPs soyu fonksiyonel potansiyeli adımları tarif olabilir. / - - CD3 Çünkü olgun T hücrelerini geliştirmek olamaz fareler CD45.2 15, biz CD45 alotipik farklılıkları ile birlikte, ev sahibi olarak olabilir kullanıldı, açıkça kendi doğal ortamlarında yeni oluşturulan T hücrelerini izleyin
Burada tarif edilen deney prosedürü, yeni yönleri yeniden oluşturulmuş FTOC birleşimidirin vivo nakli ile. Bu belirlenmesi ve hematopoetik atalarıdır tanımlanan alt soyunu izleme izin verdi. Birinci ve ikinci dalgalar γδT hücrelerin farklı alt kümelerini, αβT hücrelerinin farklı sayıda üretmek ve farklılaşma farklı kinetik var biz o TSP bulundu.
Embriyoların Sahne: gün 0 fiş algılama göre, 18 saat farelerin çiftleşme sonra kabul edilir. Thymi ait Diseksiyonlarında iyi soğuk ışık 150 W, binoküler diseksiyon mikroskobu ve diseksiyonu, anestezi ve greft işlemleri için bazı pratik gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Pasteur Enstitüsü, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant 'lenfopoiezis'), REVIVE Gelecek Yatırım Programı ve "contre le Kanser La Ligue" tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26 G ⅜" 0.45 x 10 mm syringes with needles | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility actions |
| Ketamine 100 mg/ml (stock solution) | MERIAL | Anesthesic | |
| Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution | AXIENCE | Morphinic analgesic | |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | Eye protection | |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fetal calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2-Mercaptoethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine iris scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| 2 pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1x270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
- Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu Rev Immunol. 26, 355-388 (2008).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation. Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).
- Calderon, L., Boehm, T. Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments. Cell. 149, 159-172 (2012).
- Adolfsson, J., et al. Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment. Cell. 121, 295-306 (2005).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26, 678-689 (2007).
- Ramond, C., et al. Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus. Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).
- Allison, J. P., Havran, W. L. The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Barbee, S. D., et al. Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).
- Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver. Blood. 99, 463-471 (2002).
- Malissen, M., et al. Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene. EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).
