Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis – the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.
Graviditet kännetecknas av infiltration av leukocyter i reproduktiva vävnader och på moder och foster gränssnitt (decidua basalis och decidua parietalis). Detta gränssnitt är den anatomiska platsen för kontakt mellan moderns och fostervävnader; därför är det en immunologisk ningsställe under graviditet. Infiltrerande leukocyter på moder och foster gränssnitt spelar en central roll vid transplantationer, graviditet underhåll och tidpunkten för leverans. Därför kommer fenotypiska och funktionella karakterisering av dessa leukocyter ge insikt i de mekanismer som leder till graviditet störningar. Flera protokoll har beskrivits för att isolera infiltrera leukocyter från decidua basalis och decidua parietalis; Men bristen på konsekvens i reagens, enzymer och inkubationstider gör det svårt att jämföra dessa resultat. Häri beskrivs är en ny metod som kombinerar användning av milda mekaniska och enzymatiska dissociation tekniker för att bevara livskraften och integritet extracellulära och intracellulära markörer i leukocyter isolerade från mänskliga vävnader på moder och foster gränssnitt. Bortsett från immunfenotypning, cellodling och cellsortering, de framtida tillämpningar av detta protokoll är många och varierande. Efter detta protokoll, kan de isolerade leukocyter användas för att bestämma DNA-metylering, uttryck av målgener, leukocyter vitro funktionalitet (dvs, fagocytos, cytotoxicitet, T-celltillväxt, och plasticitet, etc.) i, och produktionen av reaktiva syreradikaler på moder och foster gränssnitt. Dessutom, med hjälp av den beskrivna protokollet, har detta laboratorium kunnat beskriva nya och ovanliga leukocyter på moder och foster gränssnitt.
Graviditet kännetecknas av tre distinkta immunologiska faser: 1) implantation och tidig placentation samband med en pro-inflammatorisk respons (dvs liknar implantation ett "öppet sår"); 2) den andra trimestern och det mesta av den tredje trimestern av graviditeten när immun homeostas uppnås genom en övervägande anti-inflammatoriskt tillstånd på moder och foster gränssnitt; och 3) förlossning, en pro-inflammatoriskt tillstånd 1-7. Immunceller spelar en viktig roll i regleringen av det inflammatoriska svaret på moder och foster gränssnitt där deras förekomst och lokalisering förändring under hela graviditeten 6-9.
Hos människa representerar moder till foster gränssnitt ett område för direktkontakt mellan moderns (decidua) och foster (chorion eller trofoblasten) vävnader. Detta gränssnitt innefattar: 1) decidua parietalis som linjer livmodern som inte omfattas av moderkakan och är i sammanställningtill chorion laeve; och 2) decidua basalis, som ligger i basalplattan av moderkakan där det invaderas av mellanrums trofoblaster 10 (Figur 1). Intimiteten av dessa kontaktytor skapar förutsättningar för foster antigen exponering för moderns immunförsvar 11-13. Inte överraskande, leukocyter utgöra upp till 30-40% av de decidual cellerna 8,9,14,15 utöver typiska stromal-typ celler och körtelceller 8,14,16. Rollen av leukocyter på moder och foster gränssnitt omfattar flera processer som inkluderar begränsning av trofoblaster invasion 17, ombyggnad av spiral artärer 18,19, underhåll av moderns tolerans 12,20, och initiering av arbetskraften 21-26. Leukocyter för både adaptiva och medfödda lemmar i immunsystemet, det vill säga, T-celler, makrofager, neutrofiler, B-celler, dendritiska celler och NK-celler, har identifierats i decidual vävnader, och derasproportioner och aktiveringsstatus har visat sig variera spatialt och tidsmässigt hela dräktigheten 6-10,12,14,24,27-30. Störningar i leukocytpopulationen och / eller funktion är associerade med spontan abort 31, preeklampsi 32, intrauterin tillväxthämning 32,33, och för tidigt värkarbete 7,24. Därför kommer studiet av de fenotypiska egenskaper och funktioner av leukocyter på mänskliga moder och foster gränssnitt underlätta klarlägga de immunologiska vägar dysreglerad i graviditetsstörningar.
En av de mest kraftfulla verktyg som används för att bestämma fenotypen och funktionella egenskaper hos leukocyter är flödescytometri, teknik som gör den kvantitativa analysen av flera parametrar samtidigt 34-36. För att analysera leukocyter från flödescytometri, krävs isolering av leukocyter i en enkelcellsuspension. Därför ett sätt skilja infiltrerande leukocytes från moder till foster gränssnitt behövs för att studera deras fenotypiska och funktionella egenskaper.
Flera metoder har beskrivits för att isolera leukocyter från den humana moder och foster gränssnitt 10,14,25,27,37-39. Medan vissa tillämpa mekanisk uppdelning 10,25,27,38, andra använder enzymatisk digestion 37,40 för vävnadsdissociering. Eftersom mekanisk uppdelning ger ett lägre utbyte och minskad livsduglighet 41, och enzymatisk dissociation kan påverka viabiliteten och cellytmarkör retentionen 42, den metod som beskrivs häri kombinerar försiktig mekanisk dissociation med enzymatisk förbehandling för att öka utbytet av isolerade leukocyter utan att äventyra cellviabilitet. En liknande kombination av metoder har visat sig vara effektiv vid isolering av leukocyter från de decidual vävnad vid moder och foster gränssnitt 39. Därför protokollet beskrivet häri innebär mechaniska uppdelning med en automatisk vävnads dissociator som ökar konsekvens samtidigt som du sparar tid och arbete i jämförelse med traditionella mals med motsatta skalpeller, rakblad eller kirurgiska saxar 10,28. Enzymet väljs för vävnadsdissociering var Accutase. Till skillnad från vanligt förekommande kollagenas 43, dispas 44, och trypsin 45, Accutase (en cell lossnar lösning) kombinerar både allmän proteolytisk och kollagenolytiska aktiviteter som bidrar till en effektiv och skonsam dissociation 46,47. Efter dissociation, är leukocyter anrikade från den totala befolkningen i de decidual cellerna genom densitetsgradientcentrifugering. Olika densitetsgradient medier har tidigare utnyttjats, den vanligaste av dessa är Percoll (en suspension av kolloidala kiseldioxidpartiklar) 48 och Ficoll (en polymer av sackaros med en hög syntetisk molekylvikt) 49. Den överlägsna effektivitet av isolering av den sackaros polymeren har varit previously visas 50, och det protokoll som beskrivs häri ytterligare bevisar att detta densitetsgradient media ger en tillräckligt hög renhet av mononukleära leukocyter.
Följaktligen, det protokoll som beskrivs häri kombinerar den mekaniska vävnaden disaggregation med en automatisk vävnads dissociator, enzymatisk digerering med en cell avskildhet lösning och leukocyt separation med en densitetsgradient media (1,077 + 0,001 g / ml) för att isolera leukocyter från humana decidual vävnader. Detta protokoll har visat sig bevara cellyteantigener tillsammans med cellviabilitet. De isolerade leukocyter kan användas för flera tillämpningar som inkluderar immunfenotypning med flödescytometri och funktionella studier in vitro.
Karakterisering av de funktionella och fenotypiska egenskaper hos infiltrerande leukocyter vid humana moder och foster gränssnitt är väsentlig för förståelsen av de immunmekanismer som leder till graviditetsstörningar. Flera tekniker har beskrivits för att isolera leukocyter från humant moder och foster gränssnitt under hela graviditeten 10,14,25,28,37,42,43. Men var och en av dessa tekniker är distinkt, använder olika enzymer eller enzymkombinationer, kräver olika dissociation gånger, inte ange…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Eunice Kennedy Shriver det nationella institutet av barnhälsa och mänsklig utveckling, NIH / DHHS. Detta arbete stöddes också delvis av Wayne State University Perinatal initiativet i Maternal, perinatal och barns hälsa. Vi tackar Maureen McGerty (Wayne State University) för hennes kritiska läsningar av manuskriptet.
Dissection | |||
Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers | Any vendor | 20012-027 | |
1X phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | (1X PBS) | |
Large and small Petri dishes | Any vendor | ||
Dissociation | |||
Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (cell detachment solution) |
Sterile 2 mL safe-lock conical tubes | Any vendor | ||
50 mL conical centrifuge tubes | Any vendor | ||
100 µm cell strainers | FALCON/Corning | 352360 | |
5 mL round bottom polystyrene test tubes | Any vendor | ||
Transfer pipettes | Any vendor | ||
C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
Cell Culture | |||
RPMI culture medium 1640 | Life Technologies | 22400-089 | (1X) (10% FBS and 1% P/S) |
Plastic chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
Incubator | Thermo Scientific Corporation | HEPA Class 100 | |
Water bath | Fisher Scientific | ISOTEMP 110 | |
Cell counter | Nexelcom | Cellometer Auto2000 | |
Microscope | Olympus | Olympus CKX41 | |
Cell Separation | |||
MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
Cell separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
30μm pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
15mL safe-lock conical tubes | Any Vendor | ||
MACS buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS) | ||
Reagents | |||
FcR Blocking | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | (Fc Block) |
Anti-human cell surface antigen antibodies | BD Biosciences | (Table 1) | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
LIVE/DEAD viability dye | BD Biosciences | 564406 | |
Lyse/Fix buffer | BD Biosciences | 346202 | |
FACS buffer | (1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS) | ||
Staining buffer | BD Biosciences | 554656 | |
Trypan Blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250-011 | |
Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | 20% density gradient media |
Additional Instruments | |||
Incubator with shaker | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
Flow cytometer | BD Biosciences | LSR-Fortessa | |
Centrifuge | Beckman Coulter | SpinChron DLX | |
Vacuum system | Any vendor | ||
Automatic tissue dissociator | Miltenyi Biotec | gentleMACS Dissociator |