Abstract
El mesodermo faríngea de los embriones en desarrollo contribuye a amplias regiones de la cabeza y la musculatura del corazón. Hemos desarrollado un nuevo método para estudiar la cabeza y progenitor corazón desarrollo de las células con arcos faríngeos (también conocido como arcos branquiales) ex vivo. Usando este método, hemos descrito recientemente que el segundo arco faríngeo contiene progenitores corazón auto-renovación y sirve como un microambiente para la expansión de los progenitores durante el desarrollo del corazón de ratón. Las células progenitoras permanecen indiferenciadas y expansivo en el interior del arco, pero rápidamente se convierten en cardiomiocitos funcionales a medida que migran fuera del arco. También informó que el primer arco faríngeo contiene progenitores musculares que dan lugar a miotubos después de dejar el arco. Aquí, se demuestra el procedimiento para la disección y la cultura ex vivo de primer y segundo arcos faríngeos de desarrollo de embriones de ratón. El método permite a uno para estudiar la cabeza y el corazón progenitor / dev muscularelopment, incluyendo cardiomiocitos y myotube formación en detalle ex vivo.
Introduction
Las células del mesodermo faríngeos dan lugar a partes del corazón y los músculos faríngeos. Durante el desarrollo embrionario, las células progenitoras multipotentes cardiacos desde el segundo campo corazón migran desde el mesodermo faríngea y pueblan el tracto de salida del ventrículo derecho y cardiaco, y su desarrollo anormal está estrechamente asociada con la enfermedad-el corazón congénita causa de defectos de nacimiento y-defecto de nacimiento muertes relacionadas en seres humanos 1-3. Estudios recientes han demostrado que mesodermo faríngea contribuye a la cabeza músculos, además del corazón, haciendo que el mesodermo una parte crítica del desarrollo cardio-4 craneofacial. Por lo tanto, los procesos de desarrollo incluyendo la inducción, proliferación, y diferenciación de progenitores de la cabeza y del corazón en el mesodermo faríngea están bajo investigación activa 5-7.
Hasta hace poco, seguía siendo desconocida si las células progenitoras cardíacas experimentan witho expansióndiferenciación ut, debido en parte a la falta de información sobre su entorno celular. Nuestro estudio reciente sugiere que los arcos faríngeos sirven como un microambiente para la renovación de los progenitores cardíacos y musculares y pueden ser cultivadas ex vivo durante varias semanas 8. Este método de explante ofrece una novedosa y única oportunidad de estudiar el desarrollo de progenitores cardio-craneofacial ex vivo.
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Protocol
Todos los ratones fueron mantenidos a una Asociación Americana para la Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC) acreditado por animalario de la Universidad Johns Hopkins y alojados de conformidad con los procedimientos establecidos en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) aprobó todos los protocolos experimentales.
1. Preparación Experimental
- Escudo placa de 12 pocillos con 10% de suero bovino fetal (FBS) en solución tamponada de fosfato (PBS) durante 60 min.
- Retire solución de revestimiento y añadir 200 l de los medios de comunicación libre de suero (SFM). Girar la placa para asegurarse de que una película de los medios cubre toda la superficie.
2. Procedimientos Quirúrgicos
- La eutanasia a los ratones embarazadas que utilizan cuidado de los animales protocolo comité aprobados de la institución seguido por dislocación cervical para asegurar la eutanasia completa.
- Rocíe y limpie la región del vientre del ratón con el 70%etanol. Mantener estrictas técnicas estériles para evitar la contaminación.
- Use pinzas y tijeras para hacer un 0,5 cm2 incisión en la región del ombligo.
- Utilice los dedos para pellizcar / agarrar la piel por encima y por debajo de la incisión y tire suavemente la piel en direcciones opuestas (cabeza y cola).
- Utilice pinzas y tijeras para hacer una incisión inicial en la membrana en la región del ombligo. Cortar con cuidado la membrana en forma de V desde el ombligo hasta los ovarios en cada lado (2 x 1,5 cm 2), revelando así el útero.
- El uso de fórceps para pellizcar el oviducto que conecta el útero con el ovario y tijeras para pellizcar el oviducto en el lado del ovario, liberando así el útero desde el ovario.
- Tire suavemente hasta el útero por el oviducto con las pinzas y cortar el útero libre de la región de la vejiga con unas tijeras.
- Tire del útero más arriba por el oviducto con las pinzas, y cortar el oviducto con unas tijeras en el otro lado, liberando de este modo el útero de la mOuse.
- Transferir el útero a un tubo de 50 ml y añadir 20 ml de PBS frío estéril con Ca2 + y Mg2 +. PBS debe contener Ca 2+ y Mg 2+ durante la disección de embriones.
- Agite suavemente el tubo durante 10 segundos para lavar el útero para la sangre.
- Transferir el útero desde el tubo con pinzas y colocarlo en una placa de 10 ml y añadir 5 ml de PBS frío en la parte superior del útero.
- Coloque el plato con el útero bajo un microscopio estereoscópico.
Nota: Los pasos 02/13 a 02/19 requiere un microscopio estereoscópico. - Use dos pares de pinzas para abrir suavemente el útero y diseccionar sacos amnióticos con embriones desde el útero uno por uno.
- Use dos pares de pinzas para abrir cuidadosamente el saco amniótico que rodea al embrión, pellizcar el saco con uno fórceps y suavemente sacarlo de la embrión, utilizar las otras pinzas para cortar y liberar el saco amniótico a partir del embrión. Si un genotipo específico necesario, mantenga saco amniótico para el genotipado.
- Coloque el embrión en el lado y utilizar pinzas para cortar el 1 ° y 2 ° arco posterior al corazón entre el arco y la bolsa faríngea (Figura 1 A '').
- Voltear suavemente el embrión para el otro lado y utilizar pinzas para cortar la primera y segunda arco posterior al corazón entre el arco y la bolsa faríngea.
- Utilice unas pinzas para cortar el tracto de salida cardíaco que todavía se está conectando el 1 y 2 de la faringe arcos al embrión. Retire los arcos, que todavía están unidos juntos en la forma de una mariposa (Figura 1B), a partir del embrión.
- Utilice pinzas para pellizcar y suelte los arcos 1 st faríngeas del restante del tracto de salida cardíaco y endodermo del intestino anterior (Figura 1B '' se indica con línea discontinua y *).
- El uso de fórceps para pellizcar y suelte los arcos faríngeos 2º del resto del tracto de salida cardíacoy endodermo del intestino anterior (Figura 1B '' se indica con línea discontinua y **).
- Transferir cada par de arcos por separado utilizando fórceps y colocar ambas arcadas en el medio de un así designado. Plate 1 y 2 de la faringe arcos en pocillos separados. Asegúrese de que los arcos están en contacto con la película de los medios agregados en el paso 1.2. Es crucial que los arcos no están cubiertos por medio, ya que necesitan para hacer contacto con la superficie del pozo para la fijación durante este período.
3. Incubación e Imagen
- Incubar arcos plateados en la placa de 12 pocillos en 37 ° C / 5% de CO 2 durante 2 horas para arcos para fijar a la superficie también.
- Añadir suavemente 200 l de 37 ° C SFM por el lado del pozo. Asegúrese de que los arcos permanecen unidos e incubar O / N.
- Al día siguiente, comprobar visualmente que arcos faríngeos se unen y agregan suavidad 200 l de 37 ° C SFM por el lado de labien. Si arcos permanecen sin ataduras y flotante, retire con cuidado los medios de comunicación con una pipeta sin remover arcos hasta que sólo queda una película de los medios de comunicación. Utilice punta de la pipeta para colocar arcos en el medio de la etapa de bien y de repetición 3.1.
- Monitorear diariamente; añadir ~ 100-200 l de los medios de comunicación cada segundo día para reemplazar cualquier medio evaporó.
Nota: 24-48 h después de la migración de las células aparecen alrededor del arco y proliferar y migrar de arco en los próximos 5-8 días. Después de 36 a 72 horas de formación de los cardiomiocitos que baten se puede observar desde el 2º arco faríngeo (Figura 2B). Formación myotube se puede observar a partir de los 1 st faríngea arco 3-7 días después de la unión (Figura 2).
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Representative Results
Durante el desarrollo, los progenitores del músculo y del corazón faciales se pueden remontar a medida que proliferan y migran desde el 1 ° y 2 ° arco faríngeo, para convertirse en la cabeza y la musculatura del corazón, respectivamente (Figura 1 A, A 'y A' '). El cultivo de arcos faríngeos ofrece una forma única para estudiar el corazón y el músculo de desarrollo en detalle ex vivo. Después de la disección y la unión de los arcos faríngeos, que migran las células de los arcos conectados se pueden observar dentro de 24 a 48 horas de la cultura. Dentro de los 3 días de formación myotube cultura se puede observar desde el 1 de arcos faríngeos y la formación de los cardiomiocitos de los arcos faríngeos 2 nd (Figura 2A y 2B). La formación de los cardiomiocitos se puede confirmar visualmente mediante la contratación espontáneamente grupos de células y / o análisis de marcadores específicos que migran cardiomiocitos (por ejemplo, troponina T). Myotuse formación / músculo facial se puede observar visualmente por largo alargada (hasta 500 micras de longitud) células y / o análisis de marcadores específicos de músculos (por ejemplo, miogenina) espontáneamente espasmos. Al utilizar el sistema Cre-lox en ratones, la progenie mesodermo puede rastrearse por los reporteros fluorescentes sobre cre-expresión durante ex vivo de cultivo (Figura 2A 'y 2B'). Asimismo, con este método es posible estudiar el destino de la progenie, en el que un gen específico de interés se condicionalmente noqueado o sobreexpresado, que de otro modo daría lugar a letalidad embrionaria temprana como hemos descrito previamente 8.
Figura 1: Ratón embrión (cre Mesp1, AI9) 9,5 días después de la fecundación (E.9.5 >). (A) lado del embrión izquierda. (PA: faríngea Arco, OT: tracto de salida, LV:.. Ventrículo izquierdo (A ') Mesp1 linaje-trace; RFP marca células Mesp1 + y su progenie flecha indica RFP + Mesp1-progenie en PA2 que se continúa con el Antiguo Testamento. (A '') La línea de indicar dónde cortar PA1 y PA2 posterior al corazón (B) PA1-mariposa como derecha e izquierda y PA2 después de la disección del embrión FE:.. endodermo del intestino anterior (B. ') marcas RFP Mesp1 progenie . en PA1 y PA2 (B '') * y ** junto con las líneas de trazos indica dónde cortar y liberar PA1 y PA2 de la OT y FE Barra de escala:.. 500 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2:. Arcos faríngeos cultivadas (A) PA1 cultivadas (3 días de cultivo). (A ') RFP marca Mesp1 progenie en PA1. Flechas y * indican la formación myotube temprano. (A '') Superposición de expresión RFP en PA1. (B) PA2 Cultivadas (8 días de cultivo). (B ') marcas RFP Mesp1 progenie en PA2. Flechas y ** indican área de los cardiomiocitos (modificado de Shenje et al. 8) de latir. (B '') Superposición de expresión RFP en PA2. Barra de escala:. 250 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este vídeo, se demuestra cómo aislar y cultura primero y segundo arcos faríngeos de 9,5 días de edad embriones de ratón. Arcos faríngeos se transitoria, segmentados abultamientos que aparecen en el lado craneolateral de embriones en desarrollo 9, que contienen bloques cardiaca de creación de células progenitoras múltiples potentes para hacer que el corazón durante la embriogénesis 10,11 -en segundo arcos y progenitores musculares cabeza en primera arcos 8 .
Disección de arcos faríngeos requiere habilidades avanzadas de disección de embrión de ratón. Una vez que los arcos se han diseccionado con éxito utilizando este protocolo escalonado y trasladado pozos pre-revestidas, es fundamental que los arcos se unen a la zona inferior. En este protocolo, nosotros los pozos capa con 10% de SFB seguidos por la cultura en la ordenación forestal sostenible que resulta en unión y el crecimiento de> 75% de los arcos, sin embargo otros materiales de recubrimiento se pueden utilizar (matrigel, gelatina, fibronectina, etc.), así como conta sueromedios INING.
Los arcos faríngeos sirve como primordios para una multitud de estructuras durante el desarrollo. Después de la formación inicial de los arcos faríngeos (8 días después de la fertilización en ratones), CPC se expanden en el PA2 y migran en el tracto de salida cardíaco donde se diferencian en células cardiacas, sirviendo así como una fuente renovable de CPC que suministra células necesarias para sostener corazón crecimiento. Como los arcos faríngeos son estructuras temporales de desarrollo (E8-11.5) y la migración de CPC en el tracto de salida se produce a partir de aproximadamente E8-E10) esto trae ciertas limitaciones a la técnica. Para los estudios de la CPC, se recomienda utilizar arcos faríngeos disecados entre E9-10, en esta etapa cada PA2 contener aproximadamente 5-800 RFP + células (traza linaje Mesp1).
Con marcaje fluorescente, esta cultura ex vivo nos permite monitorear progenitores en desarrollo y su diferenciación en cardiomiocitos vencer o miotubos ien tiempo real n. Además, este sistema de cultivo ex vivo se puede utilizar para estudiar los roles de los factores de células autónomas y microambientales que afectan a la proliferación cardíaca / progenitoras musculares celular, la migración, y diferenciación utilizando líneas de Cre / loxP existentes. Como tal, se espera que este sistema para facilitar / musculares estudios progenitora-nichos cardíacas, que pueden conducir a una mejor comprensión de la formación del corazón / muscular y la enfermedad.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| PBS + Ca2 + Mg2 | Corning | 21-030-CV | |
| 10 cm Petri plates | Fishersci | FB0875712 | |
| Scissor | |||
| Dissection forceps | |||
| Serum Free Media: | |||
| IMDM | Cellgro | 15-016-CV | |
| Ham’s F12 | Cellgro | 10-080-CV | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| B27-retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| 10% BSA (in PBS) (Invitrogen Cat#. P2489) | Life Sciences | P2489 | |
| 100x Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081) | Gibco | 35050-61 | |
| 100x Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063) | Gibco | 15140-122 |
References
- Kelly, R. G.
- Congenital Heart Defects. , CDC. Available from: http://www.cdc.gov/ncbddd/heartdefects/index.html (2013).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Tzahor, E., Evans, S. M. Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis. Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).
- Uosaki, H., et al. Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells. PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140, 2587-2596 (2013).
- Kwon, C., et al. A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate. Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, e02164 (2014).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).
- Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis. Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).
- Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy. Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).
