Abstract
Gelişmekte olan embriyoların faringeal mezoderm baş ve kalp kaslarının geniş bölgelere katkıda bulunur. Biz (aynı zamanda brankiyal kemerli olarak da bilinir) farenks kemerli baş ve kalp progenitör hücre gelişimini ex vivo çalışma için yeni bir yöntem geliştirdik. Bu yöntemi kullanarak, biz son zamanlarda ikinci faringeal kemer kendini yenileyen kalp atalarıdır içeren ve fare kalp gelişimi sırasında atalarıdır genişletilmesi için bir mikro olarak hizmet ettiğini tarif var. progenitör hücrelerin kemerin içinde farklılaşmamış ve geniş kalır, ancak hızlı bir şekilde kemer dışarı göç gibi fonksiyonel kardiyomiyositler olur. Biz de ilk faringeal kemer kemer ayrıldıktan sonra miyotüplerinin sebebiyet veren kas atalarıdır içerdiğini bildirdi. Burada, biz diseksiyon ve fare embriyoları geliştirmekten birinci ve ikinci faringeal kemerler ex vivo kültür prosedürü göstermektedir. yöntem baş ve kalp progenitör / kas dev incelemek için birini sağlayankardiyomiyosit ayrıntılı ex vivo miyotüp formasyonu da dahil olmak üzere elopment.
Introduction
Faringeal mezoderm hücreleri kalp parça ve yutak kas yol açmaktadır. Embriyonik gelişim sırasında, ikinci kalp alanından multipotent kalp progenitör hücrelerin yutak mezodermden göç ve kardiyak çıkış yolunu ve sağ ventrikül doldurmak ve onların anormal gelişim yakından doğum kusurları ve doğum defect- konjenital kalp hastalığı lideri nedeni ile ilişkilidir İnsanlarda 1-3 benzer ölümler. Son çalışmalar yutak mezoderm mezoderm kardiyo-Kraniofasiyal gelişim 4 kritik bir parçası yaparak, kalp ek olarak, kas kafa katkıda bulunduğunu göstermiştir. Böylece, indüksiyon, çoğalması ve yutak mezoderm baş ve kalp atalarıdır farklılaşma dahil gelişimsel süreçleri etkin soruşturma 5-7 altındadır.
Yakın zamana kadar, kardiyak progenitör hücreler genişleme witho tabi olup olmadığı bilinmeyen kaldıkendi cep çevre hakkında bilgi eksikliği kısmen ut farklılaşma. Bizim yeni bir çalışma faringeal kemerler kalp ve kas atalarıdır yenilenmesi için bir mikroçevresinin olarak hizmet ve birkaç hafta üzerinde 8 ex vivo kültüre olabileceğini düşündürmektedir. Bu eksplant yöntemi kardiyo-kraniofasial atalarıdır ex vivo gelişimini incelemek için yeni ve eşsiz bir fırsat sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm fareler Johns Hopkins Üniversitesi'nde hayvan tesisi -accredited Laboratuar Hayvan Bakımı Akreditasyon Amerikan Derneği (AAALAC) muhafaza ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu belirtilen prosedürlere uygun olarak muhafaza edildi. Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tüm deneysel protokolleri onayladı.
1. Deneysel hazırlanması
- 60 dakika boyunca fosfat tamponlu çözelti içinde% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) (PBS) ile kaplayın 12 oyuklu plaka.
- Kaplama çözeltisini çıkarın ve serum içermeyen vasat (SFM) ve 200 ul ilave edin. Medya film tüm yüzey alanı kaplamaktadır emin olmak için plakayı döndürdüm.
2. Cerrahi İşlemleri
- Tam ötenazi sağlamak için servikal dislokasyon tarafından takip kurumun hayvan bakım komitesi tarafından onaylanmış protokol kullanılarak gebe fareler Euthanize.
- Sprey ve% 70 ile fare göbek bölgesini temizlemeketanol. Kirlenmesini önlemek için sıkı steril teknikler koruyun.
- Kullanım forseps ve makas göbek bölgesinde 0.5 cm 2 kesi yapmak için.
- / Çimdik kesi altında ve üstünde cildi kapmak ve yavaşça zıt yönlerde (baş ve kuyruk) cilt çekmek için parmaklarınızı kullanın.
- Göbek bölgesinde zarında bir başlangıç kesi yapmak için forseps ve makas kullanın. Yavaşça böylece rahim ifşa her bir tarafında (2 x 1.5 cm2) üzerine overlere göbek V-şeklinde membran kesti.
- Böylece yumurtalıktan rahim kurtararak, yumurtalık tarafında yumurtalık çimdik yumurtalık ve rahim makas bağlayan yumurtalık çimdik için forseps kullanabilir.
- Yavaşça forseps yumurtalık tarafından rahim yukarı çekin ve makas ile mesane bölgeden serbest rahim kesti.
- Forseps ile yumurta kanalı tarafından daha fazla yukarı rahim çekin ve böylece m rahim bırakmadan diğer tarafta makas ile yumurtalık kesmekouse.
- 50 ml'lik bir tüpe transfer rahim ve Ca + 2 ve Mg + 2 ile birlikte, steril, soğuk PBS ve 20 ml ekleyin. PBS embriyo diseksiyonu sırasında Ca 2+ ve Mg 2+ içermelidir.
- Yavaşça kan rahim yıkamak için 10 saniye boyunca tüp sallayın.
- Forseps ile tüp rahim aktarın ve 10 ml çanak koyun ve uterus üzerine soğuk PBS 5 ml ekleyin.
- Bir stereomikroskop altında rahim ile çanak yerleştirin.
Not: 2,13-2,19 Stereomikroskopta gerektirir Adımları. - Yavaşça tek rahim itibaren embriyolar ile amniyotik keseler rahim açıp dışarı incelemek için forseps iki çift kullanın.
- Dikkatle embriyo çevreleyen amniyotik kese açmak için forseps iki çift kullanın tek forseps ile kesesini tutam ve yavaşça embriyo çıkarın, kesme ve embriyo amniyon kesesi serbest bırakmak için diğer forseps kullanabilir. Belirli bir genotip Gerekirse, genotipleme için amniyotik kese tutun.
- Yan embriyo yerleştirin ve kemer ve farenks kesenin (Şekil 1A '') arasındaki kalbe posterior kemer nd 1 st ve 2 kesmek için forseps kullanabilir.
- Yavaşça diğer tarafa çevirmek embriyo ve posterior kemer ve farenks kese arasındaki kalbe 1. ve 2. kemer kesmek için forseps kullanabilir.
- Hala 1 st ve embriyoya 2. farengeal kemerli bağlanan kalp çıkış yolunu kesmek için forseps kullanabilir. Hala embriyodan, kelebeğin (Şekil 1B) şeklinde birbirine bağlı olan kemerler, çıkartın.
- Çimdik için forseps kullanabilir ve kalan kalp çıkım yolu ve foregut endoderm 1 st farengeal kemerli bırakın (Şekil 1B '* kesik çizgi ile gösterilen ve).
- Çimdik için forseps kullanabilir ve kalan kalp çıkış yolundan 2. faringeal kemerler serbestve foregut endoderm (Şekil 1B 'kesikli çizgi ve ** ile gösterilir).
- Ayrı ayrı forseps kullanarak kemerlerin her çift aktarın ve iyi belirlenmiş bir ortasında iki kemerler yerleştirin. Ayrı kuyularda Levha 1. ve 2. faringeal kemerler. Kemerler adım 1.2 ilave medya filmi ile temas içinde olduğundan emin olun. Onlar bu dönemde ek için kuyunun yüzeyi ile temas kurmaya gerek olarak kemerler, orta kapsamında DEĞİLDİR çok önemlidir.
3. Kuluçka ve Görüntüleme
- Kemerler iyi bir yüzey alanı eklemek için 2 saat boyunca 37 ° C /% 5 CO2 içinde 12 oyuklu plaka kemerler inkübe edin.
- Yavaşça kuyunun aşağı tarafı 37 ° C SFM 200 ul ekleyin. Kemerler bağlı kalır emin olun ve / N O kuluçkaya yatmaktadır.
- Ertesi gün, görsel farengeal kemerler takılı ve hafifçe aşağı tarafı 37 ° C SFM 200 ul ekleyin olduğunu kontrol ediniyi. Kemerler bekâr ve yüzen kalırsa, yavaşça sadece medyanın film kalana kadar kemerleri çıkarmadan bir pipet ile ortamı çıkarın. Kuyu ve tekrar adım 3.1 ortasına kemerler yerleştirmek için pipet kullanın.
- Günlük Monitör; herhangi bir medya buharlaştırılarak yerine 2 günde medya ~ 100-200 ul ekleyin.
Not: hücrelerini göç sonra 24-48 saat kemer etrafında görünür ve çoğalırlar ve önümüzdeki 5-8 gün içinde kemer göç edecektir. Dayak kardiyomiyositlerde 36-72 saat oluşumu 2. faringeal kemer (Şekil 2B) den görülebilir sonra. Miyotüp formasyonu eki (Şekil 2A) sonra 1 st farenks kemer 3-7 gün görülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onlar çoğalır ve baş ve kalp kas, sırasıyla (Şekil 1A, A 've A' ') olmak üzere, 1. ve 2. faringeal kemer göç olarak gelişimi sırasında, yüz kası ve kalp atalarıdır izlenebilmektedir. Yutak kemerlerin Kültürleme detaylı ex vivo kalp ve kas gelişimini incelemek için benzersiz bir yol sunuyor. Diseksiyon ve yutak kemerlerin bağlanması sonrasında, ekli kemerli göç hücrelerin kültür 24-48 saat içinde görülebilir. Kültür miyotüp oluşumu 3 gün içinde 1. farenks kemerler ve 2. faringeal kemerler gelen kardiyomiyosit oluşumu (Şekil 2A ve 2B) den izlenebilir. Kardiyomiyosit oluşumu görsel olarak kendiliğinden değiştiren hücrelerin ve / veya belirli bir kardiyomiyosit markerlerinin analizi kümeleri sözleşme ile teyit edilebilir (örneğin, Kardiyak troponin). Myotu/ yüz kas oluşumu görsel olarak uzun bir kendiliğinden seğirmesi hücreler ve / veya belirli bir kas belirteçleri (örneğin, Myogenin) analizi (uzunluğu 500 um kadar) uzatılmış gözlemlenebilmektedir edilebilir. Farelerde CRE-lox sistemi kullanarak, mezoderm döl ex vivo kültür (Şekil 2A 've 2B') döneminde CRE ifade üzerine floresan gazetecilere tarafından izlenebilmektedir. Benzer şekilde, bu yöntem ile bu ilgi, belirli bir genin koşullu elendikçe veya daha önce tarif edildiği gibi başka şekilde 8 erken dönemde embriyo öldürücülüğü yol açacak olan, aşırı ifade edildiği döl kaderini incelemek mümkündür.
Şekil 1: Fare embriyo (Mesp1 CRE, AI9) 9.5 gün sonra döllenme (E.9.5 >). (A) embriyonun tarafına bıraktı. (PA: Faringeal Arch, OT: Çıkım yolu, LV.:. Sol ventrikül (A ') Mesp1 linage-iz; RFP Mesp1 + hücreleri ve bunların soyu işaretleri Ok belirten RFP + OT ile sürekli PA2 içinde Mesp1-soy. (A '') kesikli çizgi kalbe PA1 ve PA2 posterior kesmek için nereye işaret embriyo diseksiyonu sonra (B) Kelebek gibi sağ ve sol PA1 ve pA2 FE.:. Önbağırsak endoderm (B. '), RFP işaretleri döl Mesp1 . PA1 ve PA2 (B '') * ve ** nerede kesip OT ve FE Ölçek bardan PA1 ve pA2 serbest gösterir kesikli çizgiler ile birlikte.:. 500 mikron tıklayınız bu daha büyük bir versiyonunu görmek için rakam.
/ 52.876 / 52876fig2.jpg "upload />
Şekil 2:. Kültür farengeal kemerler (A) Kültür PA1 (kültür 3 gün). (A ') RFP PA1 içinde Mesp1 döl işaretler. Oklar ve *, erken miyotüp oluşumunu göstermektedir. (A '') PA1 içinde RFP ifade Yerleşimi. (B) Yetiştirme PO2 (kültür 8 gün). (B ') RFP işaretleri PA2 olarak soy Mesp1. Oklar ve ** (Shenje ark. 8 değiştirilmiş) kardiyomiyositlerin alanını yenerek göstermektedir. (B '), PA2 RFP ifade Kaplama. Ölçek çubuğu:. 250 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu videoda, biz izole etmek ve 9.5 gün eski fare embriyolarının ilk kültür ve ikinci yutak kemerler nasıl gösterilmektedir. Farengeal kemerler, ilk kemerlerin 8 ikinci kemerli ve baş kas atalarıdır -in embriyogenez 10,11 sırasında kalbi yapmak için çok güçlü kalp progenitör hücrelerin bina blokları içeren gelişmekte olan embriyoların 9'un craniolateral tarafında görünen çıkıntı geçici segmente edilmiş .
Yutak kemerlerin diseksiyonu gelişmiş fare embriyo diseksiyon becerileri gerektirir. Kemerler başarıyla bu adım adım protokolü kullanılarak disseke ve önceden kaplanmış kuyuları aktarıldıktan sonra, bu kemerler alt bölgeye eklemek önemlidir. Bu protokol,% 10 FBS ile geri ceket kuyu gösterilmiş olmakla birlikte diğer kaplama malzemeleri (Matrigel, jelatin, fibronektin gibi) ve serum conta kullanılabilir, bağlanma ve kemerlerin>% 75 büyüme elde SFM kültüre edilmesini, takibenadencilik ortamı.
yutak kemerler geliştirme sırasında yapıların çok sayıda için primordia olarak hizmet vermektedir. Yutak kemerlerin ilk oluşumu (8 gün farelerde döllenme sonrası) sonra, TBM PA2 genişletmek ve böylece kalbi sürdürmek için gerekli hücrelerin tedarik TBM yenilenebilir bir kaynak olarak hizmet veren, kalp hücrelerine ayırt yerde kalp çıkış yolu göç Büyüme. Yutak kemerler zamansal gelişim yapıları (E8-11.5) ve çıkış yollarına TBM'lerinin göçü yaklaşık E8-E10 meydana gelir) gibi bu tekniğin bazı sınırlamaları getiriyor. TBM çalışmalar için, biz, E9-10 arasında disseke faringeal kemerler kullanmanızı öneririz bu aşamada her PO2 yaklaşık 5-800 RFP + hücreler (Mesp1 linage iz) içerirler.
Floresan etiketleme ile bu ex vivo kültür kardiyomiyositlerde veya miyotüpler i yenerek içine gelişmekte atalarıdır ve farklılaşma izlemek için bize izin verirn gerçek zamanlı. Buna ek olarak, bu ex vivo kültür sistemi, mevcut Cre / loxP çizgileri kullanılarak kalp / kas progenitör hücre çoğalması, göçü ve farklılaşmasını etkileyen hücre özerk ve mikro-çevresel faktörlerin rol incelemek için kullanılabilir. Bunun gibi, bu sistem kalp / kas oluşumu ve hastalığın daha iyi anlaşılmasına yol açabilir kalp / kas progenitör-niş çalışmaları kolaylaştırmak bekleniyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| PBS + Ca2 + Mg2 | Corning | 21-030-CV | |
| 10 cm Petri plates | Fishersci | FB0875712 | |
| Scissor | |||
| Dissection forceps | |||
| Serum Free Media: | |||
| IMDM | Cellgro | 15-016-CV | |
| Ham’s F12 | Cellgro | 10-080-CV | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| B27-retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| 10% BSA (in PBS) (Invitrogen Cat#. P2489) | Life Sciences | P2489 | |
| 100x Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081) | Gibco | 35050-61 | |
| 100x Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063) | Gibco | 15140-122 |
References
- Kelly, R. G.
- Congenital Heart Defects. , CDC. Available from: http://www.cdc.gov/ncbddd/heartdefects/index.html (2013).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Tzahor, E., Evans, S. M. Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis. Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).
- Uosaki, H., et al. Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells. PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140, 2587-2596 (2013).
- Kwon, C., et al. A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate. Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, e02164 (2014).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).
- Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis. Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).
- Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy. Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).
