Abstract
Svalg mesoderm utvecklings embryon bidrar till breda områden av huvud och hjärta muskulatur. Vi har utvecklat en ny metod för att studera huvud och hjärta stamceller utveckling med svalg bågar (även känd som brankiala bågar) ex vivo. Med denna metod har vi nyligen beskrivit att den andra svalg bågen innehåller självförnyande hjärt stamceller och fungerar som en mikro för expansion av stamceller under mushjärta utveckling. Progenitorcellerna förbli odifferentierade och expansiv inuti bågen, men snabbt bli funktionella kardiomyocyter då de migrerar ut ur bågen. Vi rapporterade också att första svalget båge innehåller muskel stamceller som ger upphov till myotuber efter att ha lämnat bågen. Här visar vi förfarandet för dissekering och ex vivo kultur av första och andra svalg bågar från utvecklings musembryon. Metoden gör det möjligt att studera huvud och hjärta stamfader / muskel deveckling, inklusive cardiomyocyte och myotube bildning i detalj ex vivo.
Introduction
Svalg mesoderm celler ger upphov till delar av hjärtat och svalget muskler. Under fosterutvecklingen, multihjärt progenitorceller från andra hjärt fältet migrera från svalg mesoderm och fylla hjärt utflöde och höger kammare, och deras onormal utveckling är nära förknippad med medfödd hjärtsjukdom-den vanligaste orsaken till fosterskador och födelse Defekt- relaterade dödsfall hos människor 1-3. Nyligen genomförda studier har visat att svalg mesoderm bidrar att huvudet muskler, förutom till hjärtat, vilket gör mesoderm en kritisk del av hjärt-kraniofaciala utveckling 4. Således utvecklingsprocesser inklusive induktion, proliferation och differentiering av huvud och hjärta stamceller i svalg mesoderm är under aktiv utredning 5-7.
Tills nyligen, var det fortfarande okänt om hjärt progenitorceller genomgår expansions without differentiering, delvis på grund av bristen på information om deras cellulära miljö. Vår senaste undersökning visar att svalg valv fungera som en mikro för förnyelse av hjärt- och muskel stamceller och kan odlas ex vivo under flera veckor 8. Denna Explantation metod erbjuder en ny och unik möjlighet att studera utvecklingen av hjärt-kraniofaciala stamceller ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Samtliga möss hölls vid en American Association för ackreditering av Laboratory Animal Care (AAALAC) -accredited djuranläggning vid Johns Hopkins University och förvaras i enlighet med de förfaranden som anges i vägledningen för vård och användning av försöksdjur. Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) godkände samtliga experimentella protokoll.
1. Försöks Framställning
- Coat 12-brunnar med 10% fetalt bovint serum (FBS) i fosfatbuffrad lösning (PBS) under 60 minuter.
- Avlägsna beläggningslösning och tillsätt 200 | il av serumfritt medium (SFM). Snurra plattan för att säkerställa att en film av medium täcker hela ytarean.
2. kirurgiska ingrepp
- Euthanize dräktiga möss med hjälp av institutionens djurvård kommitté-godkänt protokoll följt av halsdislokation att säkerställa fullständig dödshjälp.
- Spray och rengör magen regionen av mus med 70%etanol. Behåll strikta sterila tekniker för att undvika kontaminering.
- Använd pincett och sax för att göra en 0,5 cm 2 snitt vid naveln regionen.
- Använd fingrarna för att nypa / greppa huden ovanför och under snittet och dra försiktigt huden i motsatta riktningar (huvud och svans).
- Använd pincett och sax för att göra en inledande snitt i membranet vid naveln regionen. Skär försiktigt membranet i V-form från naveln till äggstockarna på varje sida (2 x 1,5 cm 2), varigenom avslöjar livmodern.
- Använd pincett för att nypa äggledaren som förbinder livmodern till äggstockarna och sax för att nypa äggledaren på äggstocken sidan, vilket frigör livmodern från äggstocken.
- Dra försiktigt upp livmodern genom äggledaren med pincett och skär livmodern fri från blåsan regionen med en sax.
- Dra livmodern ytterligare upp genom äggledaren med tången och klipp äggledaren med sax på den andra sidan, för att därigenom frigöra livmodern från mouse.
- Överför livmodern till en 50 ml rör och tillsätt 20 ml kall steril PBS med Ca2 + och Mg2 +. PBS måste innehålla Ca2 + och Mg2 + under embryo dissektion.
- Skaka försiktigt röret i 10 sekunder för att tvätta livmodern för blod.
- Överför livmodern från röret med pincett och placera det i en 10 ml skål och tillsätt 5 ml kall PBS på toppen av livmodern.
- Placera skålen med livmodern under ett stereomikroskop.
Anm: Steg 2,13-2,19 kräver ett stereomikroskop. - Använd två par pincett för att försiktigt öppna livmodern och dissekera ut amniotic säckar med embryon från livmodern en efter en.
- Använd två par pincett för att försiktigt öppna fostersäcken som omger embryot, nypa säcken med en pincett och försiktigt ta bort den från embryot, använda andra pincett för att skära och frigöra fostersäcken från embryot. Om en specifik genotyp behövs, hålla fostersäcken för genotypning.
- Placera embryot på sidan och använda pincett för att klippa den 1: a och 2: a båge posteriort till hjärtat mellan bågen och svalg påsen (Figur 1A '').
- Flip försiktigt embryot till den andra sidan och använda pincett för att klippa den 1: a och 2: a båge posteriort till hjärtat mellan bågen och svalg påsen.
- Använd pincett för att skära hjärt utflöde som fortfarande ansluter den 1: a och 2: a svalg valv till embryot. Avlägsna de bågar, som fortfarande är fästa tillsammans i form av en fjäril (Figur 1B), från embryot.
- Använd pincett för att nypa och frigöra 1 st svalg valv från den kvarvarande hjärt utflöde och foregut endoderm (Figur 1B '' anges med streckad linje och *).
- Använd pincett för att nypa och släppa 2: a svalg valv från den kvarvarande hjärt utflödeoch foregut endoderm (Figur 1B '' anges med streckad linje och **).
- Överför varje par av bågar separat använder pincett och placera båda valv i mitten av en utsedd väl. Plate 1: a och 2: a faryngeala valv i separata brunnar. Se till att bågarna är i kontakt med filmen av medium tillsattes i steg 1,2. Det är viktigt att valv INTE täcks av mediet, eftersom de måste ta kontakt med ytan av brunnen för fastsättning under denna period.
3. Inkubation och Imaging
- Inkubera valv pläterade i 12-brunnar i 37 ° C / 5% CO2 under 2 h för valv för att fästa till brunnen ytarea.
- Försiktigt till 200 | il av 37 ° C SFM längs sidan av brunnen. Se till att valv sitter kvar och inkubera O / N.
- Nästa dag, visuellt kontrollera att svalg valv är fästa och försiktigt lägga 200 pl av 37 ° C SFM ner sidan avväl. Om valv fortfarande lös och flytande, försiktigt bort media med en pipett utan att ta bort bågar tills endast en film av media kvar. Använd pipettspets för att placera valv i mitten av brunnen och upprepa steg 3,1.
- Övervaka dagligen; lägga ~ 100-200 pl av media varje 2: a dag att ersätta någon avdunstat media.
Obs: 24-48 h efter migrerande celler visas runt bågen och kommer proliferera och migrera från båge under de närmaste 5-8 dagarna. Efter kan observeras 36-72 h bildningen av slå cardiomyocytes från 2: a svalg båge (Figur 2B). Myotube bildning kan observeras från de 1: a faryngeal arch 3-7 dagar efter fastsättning (Figur 2A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under utveckling, kan ansiktsmuskulatur och hjärt stamceller spåras eftersom de förökar sig och migrera från den 1: a och 2: a svalg båge, för att bli huvud och hjärta muskulatur, respektive (Figur 1A, A 'och A' '). Odling svalget valv erbjuder ett unikt sätt att studera hjärta och muskelutveckling i detalj ex vivo. Efter dissekering och fastsättning faryngeala valv, kan observeras migrerande celler från bifogade bågar inom 24-48 timmar av kultur. Inom tre dagars odling myotube bildning kan observeras från en st faryngeala valv och cardiomyocyte bildning från de två nd pharyngeal bågar (fig 2A och 2B). Cardiomyocyte bildning kan visuellt bekräftas genom spontant contracting kluster av migrerande celler och / eller analys av specifika cardiomyocyte markörer (t.ex., Cardiac Troponin T). Myotuvara / ansiktsmuskelbildning kan observeras visuellt med länge avlånga (upp till 500 um i längd) spontant ryckningar celler och / eller analys av specifika muskelmarkörer (t.ex. myogenin). Genom att använda cre-lox systemet i möss, kan mesoderm avkomma spåras av fluorescerande reportrar vid cre-uttryck under ex vivo kultur (Figur 2A 'och 2B). Likaså är det med denna metod möjligt att studera vad som händer med avkomma i vilken en specifik gen av intresse är villkor slås ut eller överuttrycks, vilket annars skulle resultera i tidig embryonal letalitet som vi tidigare beskrivits 8.
Figur 1: musembryo (Mesp1 CRE, AI9) 9,5 dagar efter befruktningen (E.9.5 >). (A) Vänster sida av embryo. (PA: Pharyngeal Arch, OT: utflöde, LV:.. Vänster kammare (A) Mesp1 Linage-spår, RFP markerar Mesp1 + celler och deras avkomma Arrow indikerar RFP + Mesp1-avkomma i PA2 som är kontinuerlig med OT. (A '') Streckad linje anger var att skära PA1 och PA2 posterior till hjärtat (B) Fjäril liknande höger och vänster PA1 och PA2 efter dissektion från embryot FE:.. Foregut endoderm (B ".) RFP märken Mesp1 avkomma . i PA1 och PA2 (B ') * och ** tillsammans med de streckade linjerna anger var att skära och frigöra PA1 och PA2 från OT och FE Skala bar:.. 500 pm Klicka här för att se en större version av denna figur.
upload / 52.876 / 52876fig2.jpg "/>
Figur 2:. Odlade svalg bågar (A) Odlade PA1 (3 dagars odling). (A) RFP markerar Mesp1 avkomma i PA1. Pilar och * indikerar tidig myotube bildning. (A '') överlagring av RFP expression i PA1. (B) odlade PA2 (8 dagars odling). (B) RFP märken Mesp1 avkomma i PA2. Pilar och ** indikerar att slå område i hjärtmuskelceller (modifierad från Shenje et al. 8). (B ') Overlay av RFP uttryck i PA2. Skala bar:. 250 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna video visar vi hur man kan isolera och kultur första och andra svalg valv av 9,5 dagar gamla musembryon. Svalget valv är övergående, segmenterade utbuktningar som visas på craniolateral sidan utvecklings embryon 9, som innehåller flera potenta hjärt progenitorceller-byggstenar för att få hjärtat under embryogenes 10,11 -I andra valv och huvud muskel stamceller i första bågar 8 .
Dissekering av svalget valv kräver avancerade mus embryo dissekering färdigheter. När bågar har framgångsrikt dissekerades med användning av denna stegvisa protokoll och överfördes till pre-belagda brunnar, är det kritiskt att valv fäster bottenområdet. I detta protokoll, vi belägga brunnar med 10% FBS, följt av odling i SFM resulterar i vidhäftning och tillväxt av> 75% av bågar, men andra beläggningsmaterial kan användas (matrigel, gelatin, fibronektin etc) samt serum containing media.
De svalg bågar fungerar som primordia för en mängd strukturer under utveckling. Efter inledande bildandet av svalg bågar (8 dagar efter befruktning hos möss), CPC expandera i PA2 och migrera in i hjärt utflöde där de differentieras till hjärtceller, vilket fungerar som en förnybar CPC som levererar celler som behövs för att upprätthålla hjärta tillväxt. Eftersom svalget valv är temporala utvecklings strukturer (E8-11.5) och migrering av CPC i utflöde sker från ca E8-E10) detta medför vissa begränsningar i tekniken. För CPC studier rekommenderar vi att du använder svalget valv dissekerade mellan E9-10 i detta skede varje PA2 innehåller cirka 5-800 RFP + celler (Mesp1 Linage spår).
Med fluorescerande märkning tillåter oss denna ex vivo kultur för att övervaka utvecklings stamceller och deras differentiering till att slå cardiomyocytes eller myotuber In realtid. Dessutom kan detta ex vivo odlingssystem användas för att studera roller cell autonoma microenvironmental faktorer som påverkar hjärt / muskel stamceller spridning, migration och differentiering med hjälp av befintliga Cre / loxP linjer. Som sådan, är detta system förväntas underlätta hjärt / muskelstamfader-nisch studier, vilket kan leda till en bättre förståelse för hjärta / muskelbildning och sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| PBS + Ca2 + Mg2 | Corning | 21-030-CV | |
| 10 cm Petri plates | Fishersci | FB0875712 | |
| Scissor | |||
| Dissection forceps | |||
| Serum Free Media: | |||
| IMDM | Cellgro | 15-016-CV | |
| Ham’s F12 | Cellgro | 10-080-CV | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| B27-retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| 10% BSA (in PBS) (Invitrogen Cat#. P2489) | Life Sciences | P2489 | |
| 100x Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081) | Gibco | 35050-61 | |
| 100x Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063) | Gibco | 15140-122 |
References
- Kelly, R. G. The second heart field. Curr Top Dev Biol. 100, 33-65 (2012).
- Congenital Heart Defects. , CDC. Available from: http://www.cdc.gov/ncbddd/heartdefects/index.html (2013).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Tzahor, E., Evans, S. M. Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis. Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).
- Uosaki, H., et al. Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells. PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140, 2587-2596 (2013).
- Kwon, C., et al. A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate. Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, e02164 (2014).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).
- Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis. Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).
- Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy. Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).
