Abstract
Svælg mesoderm udviklingslandenes embryoner bidrager til brede områder af hoved og hjerte muskulatur. Vi har udviklet en ny metode til at studere hoved og hjerte progenitorcelle udvikling med svælg buer (også kendt som Branchialfodderne buer) ex vivo. Under anvendelse af denne metode har vi for nylig beskrevet, at den anden svælg arch indeholder selvfornyende hjerte progenitorer og tjener som et mikromiljø til ekspansion af stamceller under muse hjerte udvikling. Progenitorcellerne forbliver udifferentieret og ekspansiv inde i buen, men hurtigt bliver funktionelle cardiomyocytter, når de trækker ud af buen. Vi rapporterede også, at første svælg arch indeholder muskel stamfædre giver anledning til myotuber efter at have forladt buen. Her viser vi proceduren for dissektion og ex vivo kultur af første og anden svælg buer fra udviklingen museembryoer. Metoden gør det muligt at studere hoved og hjerte stamfader / muskel development, herunder cardiomyocyte og myotube dannelse i detaljer ex vivo.
Introduction
Svælg mesoderm celler giver anledning til dele af hjertet og svælg muskler. Under fosterudviklingen, multipotente kardiale progenitorceller fra den anden hjerte felt migrere fra svælg mesoderm og befolke hjertets udstrømning tarmkanalen og højre ventrikel, og deres unormal udvikling er tæt forbundet med medfødt hjertesygdom-den førende årsag til fosterskader og fødsel defect- relaterede dødsfald hos mennesker 1-3. Nylige undersøgelser har vist, at pharyngeal mesoderm bidrager til hovedet muskler, udover hjertet, hvilket gør mesoderm en kritisk del af cardio-kraniofacial udvikling 4. Således er de udviklingsmæssige processer, herunder induktion, proliferation og differentiering af hoved og hjerte progenitorer i svælg mesoderm er under aktiv efterforskning 5-7.
Indtil for nylig, forblev ukendt, om hjerte-stamceller undergår ekspansion without differentiering, dels på grund af manglende oplysninger om deres cellulære miljø. Vores seneste undersøgelse tyder på, at svælg buer tjene som mikromiljø til fornyelse af hjerte- og muskel stamfædre og kan dyrkes ex vivo over flere uger 8. Denne eksplantat metode giver et hidtil ukendt og enestående mulighed for at undersøge udviklingen af hjerte-kraniofaciale progenitorer ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus blev holdt på et American Association for akkreditering af Laboratory Animal Care (AAALAC) -accredited dyr facilitet på Johns Hopkins University og har til huse i overensstemmelse med de procedurer, der er skitseret i Vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) godkendte alle forsøgsprotokoller.
1. Eksperimentel Forberedelse
- Coat 12-brønds plade med 10% føtalt bovint serum (FBS) i phosphatbufret opløsning (PBS) i 60 minutter.
- Fjern overtræksopløsningen, og der tilsættes 200 pi serumfrie medier (SFM). Snurre rundt plade til at sikre, at en film af medier dækker hele overfladen.
2. Kirurgiske Procedurer
- Euthanize gravide mus ved anvendelse institutionens dyrepleje udvalg-godkendt protokol efterfulgt af cervikal dislokation at sikre fuldstændig eutanasi.
- Spray og rengør maven region af mus med 70%ethanol. Opretholde strenge sterile teknikker til at undgå forurening.
- Brug pincet og saks til at lave en 0,5 cm2 snit ved navlen regionen.
- Brug fingrene til at klemme / grab huden over og under snittet og træk forsigtigt i huden i modsatte retninger (hoved og hale).
- Anvende pincet og saks til at foretage en indledende snit i membranen ved navlen regionen. Forsigtigt skære membranen i V-form fra navlen til æggestokkene på hver side (2 x 1,5 cm2), hvilket afslører livmoderen.
- Brug pincet til at knibe æggelederen forbinder livmoderen til æggestokkene og saks til at knibe æggelederen på æggestokkene side, og dermed frigøre livmoderen fra æggestokkene.
- Træk forsigtigt op i livmoderen ved æggelederen med pincet og skæres livmoderen fri fra blæren regionen med en saks.
- Træk livmoderen yderligere op ved æggelederen med pincet, og skær æggelederen med en saks på den anden side, derved frigøre livmoderen fra mOuse.
- Overfør livmoderen til et 50 ml rør, og der tilsættes 20 ml koldt sterilt PBS med Ca2 + og Mg2 +. PBS skal indeholde Ca 2+ og Mg 2+ under embryo dissektion.
- Ryst forsigtigt røret i 10 sek for at vaske livmoderen for blod.
- Overfør livmoderen fra røret med pincet og placere den i et 10 ml skål og tilsæt 5 ml koldt PBS på toppen af livmoderen.
- Sæt fadet med livmoderen under et stereomikroskop.
Bemærk: Trin 2,13-2,19 kræver et stereomikroskop. - Anvende to par tænger til forsigtigt at åbne livmoderen og dissekere ud fostervand sække med embryoner fra livmoderen én efter én.
- Brug to par pincet til forsigtigt at åbne fosterhinden som omgiver fosteret, knivspids sækken med en pincet og forsigtigt fjerne det fra embryonet, bruge de andre pincet til at klippe og slip fosterhinden fra embryoet. Hvis en bestemt genotype behov, holde fosterhinden for genotypning.
- Placer embryo på siden og bruge pincet til at skære den 1. og 2. bue posteriort til hjertet mellem buen og svælg pose (figur 1A '').
- Forsigtigt vende foster til den anden side og bruge pincet til at skære 1. og 2. bue posteriort til hjertet mellem buen og svælg posen.
- Brug pincet til at skære hjertets outflow-tarmkanalen, der stadig forbinder 1. og 2 nd svælg buer til fosteret. Fjern de buer, som der stadig er fastgjort sammen i form af en sommerfugl (figur 1B), fra embryoet.
- Brug pincet til at knibe, og frigive de 1 m svælg buer fra den resterende hjerte-udstrømning tarmkanalen og fortarm endoderm (figur 1B '' angivet med stiplet linje og *).
- Brug pincet til at knibe, og frigive de 2. svælg buer fra den resterende hjerte-udstrømning tarmkanalenog fortarm endoderm (figur 1B '' angivet med punkteret linie og **).
- Overføre hvert par buer separat ved anvendelse af pincetter og placere begge buer i midten af en udpeget godt. Plade 1 og 2. svælg buer i separate brønde. Sikre, at de buer er i kontakt med filmen af medier tilsættes i trin 1.2. Det er afgørende, buer ikke er omfattet af medium, som de behøver for at komme i kontakt med overfladen af brønden til fastgørelse i denne periode.
3. Inkubation og Imaging
- Inkuber buer udpladet i 12-brønds plade i 37 ° C / 5% CO2 i 2 timer for buer vedhæfte til brøndens overflade.
- Tilføj forsigtigt 200 pi 37 ° C SFM ned langs siden af brønden. Sørg for, at buer blive siddende og inkuber O / N.
- Næste dag, visuelt kontrollere, at svælg buer er fæstnede, og forsigtigt tilsættes 200 pi 37 ° C SFM ned langs siden af denbrønd. Hvis buer forblive Ikkefastgjorte og flydende, forsigtigt fjerne medier med en pipette uden at fjerne buer, indtil kun en film af medier er tilbage. Brug pipettespids til at placere buer i midten af brønden og gentag trin 3.1.
- Overvåg dagligt; tilføje ~ 100-200 pi medier hver 2. dag for at erstatte enhver fordampet medier.
Bemærk: 24-48 timer efter migrerende celler vises omkring buen og vil formere og migrere fra bue over de næste 5-8 dage. Efter 36-72 timers dannelsen af bankende cardiomyocytter kan observeres fra 2. svælg bue (figur 2B). Myotube dannelse kan observeres fra 1. svælg arch 3-7 dage efter fastgørelse (figur 2A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under udvikling, kan ansigts muskler og hjerte stamfædre spores, da de formerer og migrere fra 1. og 2. svælg bue, til at blive hoved og hjerte muskulatur, henholdsvis (figur 1A, A 'og A' '). Dyrkning svælg buer tilbyder en unik måde at studere hjerte og muskel udvikling i detaljer ex vivo. Efter dissektion og fastgørelse af svælg buer, kan migrerer celler fra vedhæftede buer observeres inden for 24-48 timer af kultur. Inden for 3 dage kultur myotube dannelse kan observeres fra 1 m svælg buer og cardiomyocyte dannelse fra 2 nd svælg buer (figur 2A og 2B). Cardiomyocyte dannelse visuelt kan bekræftes ved spontant kontraherende klynger af migrerende celler og / eller analyse af specifikke cardiomyocyte markører (f.eks kardial troponin T). Myotuvære / facial muskeldannelse visuelt kan observeres af lange aflange (op til 500 um i længde) spontant trækninger celler og / eller analyse af specifikke muskel markører (f.eks myogenin). Ved at bruge cre-lox-system i mus, kan afkom mesoderm spores ved fluorescerende reportere på cre-udtryk under ex vivo kultur (figur 2A 'og 2B). Ligeledes med denne metode er det muligt at studere skæbne afkom hvor et specifikt gen af interesse er betinget slået ud eller overudtrykt, hvilket ellers ville resultere i tidlig embryonisk letalitet som vi tidligere beskrevet 8.
Figur 1: Mouse embryo (Mesp1 cre, Ai9) 9,5 dage efter befrugtning (E.9.5 >). (A) Venstre side af embryo. (PA: Faryngeal Arch, OT: Udstrømning tarmkanalen, LV:.. Venstre ventrikel (A ') Mesp1 linage-trace, RFP markerer Mesp1 + celler og deres afkom Pil angiver RFP + Mesp1-afkom i PA2 der er kontinuert med OT. (A ') stiplet linje angiver, hvor at skære PA1 og PA2 posterior til hjertet (B) Butterfly-lignende højre og venstre PA1 og PA2 efter dissektion fra embryo FE:.. fortarm endoderm (B.) RFP mærker Mesp1 afkom . i PA1 og PA2 (B ') * og ** sammen med de stiplede linier indikerer hvor at skære og frigivelse PA1 og PA2 fra OT og FE Målestok:.. 500 um Klik her for at se en større version af denne figur.
upload / 52876 / 52876fig2.jpg "/>
Figur 2:. Dyrkede svælg buer (A) kulturperler PA1 (3 dages kultur). (A ') RFP markerer Mesp1 afkom i PA1. Pile og * indikerer tidlige myotube formation. (A ') Overlay af RFP udtryk i PA1. (B) kulturperler PA2 (8 dage kultur). (B ') RFP mærker Mesp1 afkom i PA2. Pile og ** angiver slå område cardiomyocytter (modificeret fra Shenje et al. 8). (B ') Overlay af RFP udtryk i PA2. Målestok:. 250 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne video viser vi, hvordan man isolere og kultur første og anden svælg buer af 9,5 dage gamle museembryoer. Svælg buer er forbigående, segmenteret buler, der vises på craniolateral side af udviklingslandene embryoner 9, som indeholder flere potente hjerte-stamceller-byggesten til at gøre hjertet under embryogenese 10,11 -I anden buer og hoved muskel stamfædre i første buer 8 .
Dissektion af svælg buer kræver avancerede mus embryo dissektion færdigheder. Når buer med succes er blevet dissekeret ved hjælp af denne trinvise protokol og overføres til pre-coatede brønde, er det afgørende, at buer tillægger det nederste område. I denne protokol, vi coat brønde med 10% FBS efterfulgt af kulturen i SFM resulterer i tilknytning og vækst i> 75% af buer, men andre belægningsmaterialer kan bruges (matrigel, gelatine, fibronectin etc.) samt serum contalingen medier.
Svælg buer tjener som primordier til et væld af strukturer under udvikling. Efter indledende dannelse af svælg buer (8 dage efter befrugtning i mus), CPC ekspandere i PA2 og migrere ind i hjerte- udstrømning tarmkanalen, hvor de differentierer til hjerteceller, hvorved de tjener som en vedvarende CPC'er der leverer celler nødvendige for at opretholde hjerte vækst. Da svælg buer er timelige udviklingsmæssige strukturer (E8-11.5) og migration af CPC'er i udstrømningen tarmkanalen sker fra ca. E8-E10) dette bringer visse begrænsninger for teknikken. For CPC studier, anbefaler vi at bruge svælg buer dissekerede mellem E9-10, på dette tidspunkt hver PA2 indeholder ca. 5-800 RFP + celler (Mesp1 linage trace).
Med fluorescerende mærkning, dette ex vivo kultur giver os mulighed for at overvåge udviklingslandene stamfædre og deres differentiering til at slå cardiomyocytter eller myorør In realtid. Derudover kan denne ex vivo-kultur-systemet anvendes til at studere roller celle-autonome og microenvironmental faktorer, der påvirker hjerte- / muskel progenitorcelle proliferation, migration og differentiering under anvendelse af eksisterende Cre / loxP linjer. Som sådan forventes dette system for at lette kardiale / muskel stamfader-niche undersøgelser, som kan føre til en bedre forståelse af hjerte / muskel dannelse og sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| PBS + Ca2 + Mg2 | Corning | 21-030-CV | |
| 10 cm Petri plates | Fishersci | FB0875712 | |
| Scissor | |||
| Dissection forceps | |||
| Serum Free Media: | |||
| IMDM | Cellgro | 15-016-CV | |
| Ham’s F12 | Cellgro | 10-080-CV | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| B27-retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| 10% BSA (in PBS) (Invitrogen Cat#. P2489) | Life Sciences | P2489 | |
| 100x Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081) | Gibco | 35050-61 | |
| 100x Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063) | Gibco | 15140-122 |
References
- Kelly, R. G.
- Congenital Heart Defects. , CDC. Available from: http://www.cdc.gov/ncbddd/heartdefects/index.html (2013).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Tzahor, E., Evans, S. M. Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis. Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).
- Uosaki, H., et al. Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells. PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140, 2587-2596 (2013).
- Kwon, C., et al. A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate. Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, e02164 (2014).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).
- Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis. Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).
- Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy. Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).
