咽頭アーチのex vivo培養は、ハートと筋前駆細胞とそのニッチを研究します

Abstract

発生中の胚の咽頭中胚葉は、頭と心筋組織の広範な地域に貢献しています。我々は、ex vivoで （も鰓のアーチと呼ばれる）咽頭弓で頭と心前駆細胞の発達を研究するための新規な方法を開発しました。この方法を使用して、我々は最近、第二の咽頭弓が自己複製心臓前駆細胞が含まれており、マウスの心臓の開発中に前駆細胞の拡大のための微小環境として機能することを記載しています。前駆細胞は、アーチの内側未分化と広大なままであるが、すぐに彼らはアーチの外に移動するような機能心筋細胞になります。また、最初の咽頭弓は弓を離れた後の筋管を生じさせる筋肉前駆細胞が含まれていることを報告しました。ここでは、解剖とマウス胚の開発からの第1および第2の咽頭弓のex vivo培養のための手順を示しています。この方法は、頭と心前駆/ devの筋肉を研究することを可能ex vivoで詳細に心筋細胞および筋管形成を含むelopment、。

Introduction

咽頭中胚葉細胞は、心臓の部品や咽頭の筋肉を生じさせます。胚発生の間に、第2の心臓フィールドから多能心臓前駆細胞は、咽頭中胚葉から移行し、心臓流出路および右心室を移入し、それらの異常な発達は密接先天性心疾患、先天性欠損症の主な原因と出生defect-に関連付けられていますヒト^1-3関連死。最近の研究では、咽頭中胚葉が中胚葉心臓頭蓋顔面の開発⁴の重要な部分作る、心臓に加えて、筋肉を頭に寄与することを実証しました。このように、誘導、増殖、および咽頭中胚葉で頭と心前駆細胞の分化を含む発達プロセスは、活発な調査^5-7中です。

最近まで、心臓前駆細胞は、拡張withoを受けるかどうかは不明のままで部分的には、それらの細胞環境に関する情報の欠如UT分化。我々の最近の研究では、咽頭のアーチは、心臓や筋肉前駆細胞の更新のための微小環境として機能し、数週間かけて⁸ ex vivoで培養することができることを示唆しています。この外植法は心臓頭蓋顔面前駆細胞ex vivoでの開発を研究するための新規かつユニークな機会を提供しています。

Protocol

すべてのマウスは、ジョンズ·ホプキンス大学の動物施設を-accredited実験動物管理の認定のためのアメリカ協会（AAALAC）に維持し、実験動物の管理と使用に関するガイドに概説された手順に従って飼育しました。制度動物実験委員会（IACUC）は、すべての実験プロトコールを承認しました。

1。実験の準備

1. リン酸緩衝液中の10％ウシ胎児血清（FBS）（PBS）を用いてコート12ウェルプレートで60分間。
2. コー​​ティング溶液を除去し、無血清培地（SFM）の200μlを添加します。メディアのフィルムは、表面領域全体を覆っていることを確認するために、プレートを振り回します。

2.外科的処置

1. 完全な安楽死を確実にするために、頸椎脱臼に続いて、金融機関の動物管理委員会が承認したプロトコルを使用して妊娠マウスを安楽死させます。
2. スプレーし、70％のマウスの腹の領域をきれいにエタノール。汚染を避けるために、厳密な無菌技術を維持しています。
3. へその領域で0.5 cm ^2の切開を作るために鉗子やハサミを使用してください。
4. /ピンチ切開の上および下の皮膚をつかみ、ゆっくりと反対方向（ヘッドとテール）に皮膚を引っ張って指を使用してください。
5. へその領域における膜内の最初の切開を作るために鉗子やハサミを使用してください。ゆっくりそれによって子宮を明らかに、それぞれの側の卵巣にへそからV字状に（2×1.5 cm ²で）膜をカット。
6. このように卵巣から子宮を解放し、卵巣側の卵管を挟ま卵巣およびはさみに子宮を接続卵管を挟ま鉗子を使用してください。
7. 優しく鉗子で卵管によって子宮をプルアップし、はさみで膀胱領域のない子宮を切りました。
8. ピンセットで卵管によってさらにアップ子宮を引き出し、それによってMから子宮を解放する、反対側にハサミで卵管をカットウーズ。
9. 50mlのチューブに子宮を転送およびCa ²⁺およびMg ²⁺との無菌冷PBS 20mlのを追加します。 PBSは、胚の解剖中のCa ²⁺およびMg ²⁺を含まれている必要があります。
10. ゆっくり血を子宮を洗浄するために10秒間チューブを振ります。
11. 鉗子で管から子宮を移し、10mlの皿にそれを置き、子宮の上に冷PBSを5ml加えます。
12. 実体顕微鏡下での子宮で皿を置きます。
    注：2.13から2.19には実体顕微鏡を必要とする手順。
13. 静かに子宮を開き、子宮一つ一つからの胚で羊膜嚢を解剖するために鉗子の二組を使用してください。
    1. 慎重に、胚を囲む羊膜を開く1鉗子で嚢をつまんで優しく胚から削除し、胚から羊膜を切断し、解放するために他の鉗子を使用するために鉗子の二組を使用してください。特定の遺伝子型は、必要に応じて、遺伝子型決定のための羊膜を維持します。
14. 側に胚を配置し、 ^第 1および^第 2の切断に鉗子を使用^NDアーチと咽頭嚢（ 図1A ''）との間の心に後方アーチ。
15. 静かに反対側に胚を反転し、アーチや咽頭嚢の間心に後方に1番目と2番目のアーチをカットする鉗子を使用しています。
16. まだ胚に1 ^番目と2 ^番目の咽頭弓を接続している心臓の流出路を切断するために鉗子を使用してください。胚から、まだ蝶（ 図1B）の形で一緒に取り付けられているアーチを、削除します。
17. ピンチする鉗子を使用し、残りの心臓の流出路と前腸内胚葉から1 ^番目の咽頭弓を解放します（ 図1（b） '' *破線で示すと）。
18. ピンチする鉗子を使用し、残りの心臓の流出路から2 ^番目の咽頭弓をリリースと前腸内胚葉（ 図1B ''破線で示し、**）。
19. ピンセットを用いて別々のアーチの各ペアを移し、よく指定の途中で両方のアーチを配置します。別々のウェルでプレート1 ^番目と2 ^番目の咽頭弓。アーチは、ステップ1.2で追加されたメディアのフィルムに接触していることを確認してください。彼らは、この期間中に取り付けるためのウェルの表面と接触する必要があるように、それは、アーチが媒体によって覆われていないことが重要です。

3.インキュベーションとイメージング

1. ウェル表面領域に取り付けるためのアーチのために2時間、37℃/ 5％CO ₂で12ウェルプレートにプレーティングアーチをインキュベートします。
2. ゆっくりウェルの側面の下、37℃SFMの200μlを添加します。アーチが取り付けられたままとO / Nをインキュベートすることを確認します。
3. 翌日、視覚的に咽頭弓が接続されていることを確認し、穏やか側下37°C SFMの200μlのを追加よく。アーチが取り付けられていないとフローティング残っている場合、メディアの膜のみが残っているまで、静かにアーチを除去せずにピペットでメディアを削除します。よく繰り返しステップ3.1の中央にアーチを配置するピペットチップを使用してください。
4. 毎日の監視;任意の蒸発したメディアを交換するごとに2日目のメディアの〜100〜200μlを添加します。
   注：細胞を移行した後24〜48時間は、アーチの周りに表示され、増殖し、次の5-8日にわたって弓から移行されます。拍動心筋細胞の36から72時間の形成は、2 ^番目の咽頭弓（ 図2B）から観察することができます後。筋管形成は、3-7日付着（ 図2A）した後、 ^第 1 ^の咽頭弓から観察することができます。

Representative Results

彼らは増殖し、1 ^番目と2 ^番目の咽頭弓からの移行のように、開発時には、顔の筋肉や心臓前駆細胞は（ 図1A、A 'とA' '）は、それぞれ、頭と心の筋肉組織になるために、追跡することができます。咽頭弓を培養すると、ex vivoで詳細に心臓や筋肉の発達を研究するためのユニークな方法を提供しています。解剖と咽頭弓の付着した後、添付のアーチからの移行細胞は、培養の24〜48時間以内に観察することができます。培養筋管形成の3日以内に1 ^回目の咽頭弓と2 ^番目の咽頭弓からの心筋細胞の形成（ 図2Aおよび図2B）から観察することができます。心筋細胞の形成が視覚的に自然に移動する細胞および/ ​​または心筋細胞特異的マーカー（ 例えば、心筋トロポニンT）の分析のクラスタを縮小することにより確認することができます。 Myotu/顔面筋肉の形成は、視覚的に自然発生的に細胞および/ ​​または特定の筋肉のマーカー（ 例えば、ミオゲニン）の分析をけいれん、長い伸長（長さは最大500ミクロン）により観察することができること。マウスでCRE-lox系を使用することにより、中胚葉の子孫は、ex vivo培養（ 図2A 'および2B'）中にCRE-発現時に蛍光レポーターによって追跡することができます。同様に、この方法では、目的の特定の遺伝子を条件付きで、我々は以前に^8に記載されているようにそうでなければ初期胚致死をもたらすであろう、ノックアウトまたは過剰発現される子孫の運命を調査することが可能です。

図1：マウス胚（Mesp1の^{CRE、Ai9）9.5}日後に受精（E.9.5 >）。 （A）胚の側面を残しました。 （PA：咽頭アーチ、OT：流出路、LV：左心室（A '）Mesp1の行数トレース; RFPがMesp1 ⁺細胞およびその子孫をマーク矢印が示すRFP ⁺ OTと連続しているPA2でMesp1-子孫。 （A ''）の破線は、心臓にPA1とPA2の後部をカットする場所を示す胚から解剖後（B）蝶のような左右のPA1とPA2 FE：。。。前腸内胚葉（B '）RFPのマークが子孫をMesp1 PA1とPA2における（B ''）*、**は点線と一緒にどこOTとFEからPA1とPA2をカットし、解放するために示しているスケールバー：。。。500μmで、このの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図。

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図2：培養咽頭弓（A）培養PA1（3日間の培養）。 （A '）RFPは、PA1にMesp1子孫をマーク。矢印と*は、初期の筋管形成を示しています。 （A ''）PA1におけるRFP発現のオーバーレイ。 （B）培養PA2（培養8日）。 （B '）RFPマークがPA2に子孫をMesp1。矢印と**は（Shenje らから変更^。8）心筋細胞の鼓動領域を示します。 （B ''）PA2におけるRFP発現のオーバーレイ。スケールバー：250μmで、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

Discussion

このビデオでは、我々は9.5日の咽頭弓古いマウス胚第一および第二の単離および培養する方法を示します。咽頭のアーチは、最初のアーチ^8を第二のアーチとヘッド筋前駆細胞-in胚^10,11の間に心臓をするために、マルチ強力な心臓前駆細胞ビルディングブロックを含む発生中の胚⁹のcraniolateral側に表示されるバルジを過渡セグメント化されています。

咽頭弓の解剖は、高度なマウス胚の解剖のスキルが必要です。アーチが正常にこの段階的なプロトコルを使用して解剖し、するためにプレコーティングされたウェルに転送された後は、アーチが底部領域に付着することが重要です。このプロトコルでは、アーチの> 75％で付着及び成長をもたらすSFM中で培養し、10％FBSを有するコートウェルが、他のコーティング材料は、（マトリゲル、ゼラチン、フィブロネクチンなど ）、ならびに血清コンタを使用することができiningメディア。

咽頭のアーチは、開発中の構造の多数のための原基として機能します。咽頭弓（8日は、マウスでは受精後）の初期形成した後、クリック単価はPA2に拡張し、彼らは心臓細胞に分化心臓流出路内に移動し、それによって心を維持するために必要な細胞を提供するCPCの再生可能な供給源となります成長。咽頭のアーチは、時間的発達の構造（E8-11.5）と流出路へのCPCのマイグレーション約E8-E10から発生する）であるように、これは技術に一定の制限をもたらします。 CPC研究のために、我々は、E9-10の間解剖咽頭弓を使用することをお勧めしますこの段階で各PA2は、約5から800 RFP ⁺細胞（Mesp1 LINAGEトレース）が含まれています。

蛍光標識で、このex vivoでの文化は、私たちは、心筋細胞や筋管私を破っに前駆細胞およびそれらの分化を開発し監視することができますnはリアルタイム。また、このエクスビボ培養システムは、既存のCre / loxP配列のラインを使用して、心臓/筋肉前駆細胞の増殖、遊走、及び分化に影響する細胞自律的および微小環境因子の役割を研究するために使用することができます。このように、このシステムは、心臓/筋肉形成と疾患のよりよい理解につながる、心臓/筋肉前駆·ニッチの研究を促進することが期待されます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FBS	Hyclone	SH30071.03
PBS + Ca2 + Mg2	Corning	21-030-CV
10 cm Petri plates	Fishersci	FB0875712
Scissor
Dissection forceps
Serum Free Media:
IMDM	Cellgro	15-016-CV
Ham’s F12	Cellgro	10-080-CV
N2-SUPPLEMENT	Gibco	17502-048
B27-retinoic acid	Gibco	12587-010
10% BSA (in PBS) (Invitrogen Cat#. P2489)	Life Sciences	P2489
100x Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081)	Gibco	35050-61
100x Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063)	Gibco	15140-122