Abstract
Svelg mesoderm av utviklings embryoer bidrar til brede regioner i hode og hjerte muskulatur. Vi har utviklet en ny metode for å studere hode og hjerte stamcelle utvikling med svelget buer (også kjent som branchial buer) ex vivo. Ved hjelp av denne metoden, har vi nylig beskrevet at andre svelg erke inneholder selvfornyende hjerte stamfedre og fungerer som en mikromiljøet for utvidelse av forfedrene under muse hjerte utvikling. De stamceller forblir udifferensiert og ekspansiv inne i buen, men raskt bli funksjonelle kardiomyocytter som de vandrer ut av buen. Vi rapporterte også at første svelget bue inneholder muskelstamfedre som gir opphav til myotubes etter forlate buen. Her demonstrerer vi prosedyren for disseksjon og ex vivo kultur av første og andre svelget buer fra utviklingsmuseembryoer. Metoden gjør det mulig å studere hode og hjerte stamfar / muskel development, inkludert cardiomyocyte og myotube dannelse i detalj ex vivo.
Introduction
Svelget mesoderm celler gi opphav til deler av hjertet og svelg muskler. Under embryonal utvikling, multipotente hjerte stamceller fra andre hjerte-feltet migrere fra svelget mesoderm og befolke hjerte utstrømningen veiene og høyre hjertekammer, og deres unormal utvikling er nært forbundet med medfødt hjertesykdom-den ledende årsak til fødselsskader og fødsel uten feil dødsfall hos mennesker 1-3. Nyere studier har vist at svelget mesoderm bidrar til hodet muskler, i tillegg til hjertet, noe som gjør mesoderm en kritisk del av cardio-kraniofaciale utvikling 4. Dermed utviklingsprosesser inkludert induksjon, spredning og differensiering av hode og hjerte stamfedre i svelg mesoderm er under aktiv etterforskning 5-7.
Inntil nylig, forble det ukjent om hjerte stamceller gjennomgå utvidelse withoUT differensiering, delvis på grunn av mangel på informasjon om deres mobilmiljø. Vår fersk studie antyder at svelget buer tjene som en mikromiljøet for fornyelse av hjerte- og muskelstamfedre, og kan dyrkes ex vivo over flere uker 8. Dette eksplantat metoden gir en ny og unik mulighet til å studere utviklingen av hjerte-kraniofacial stamfedre ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus ble opprettholdt på et American Association for akkreditering av Laboratory Animal Care (AAALAC) -accredited Dyreavdelingen ved Johns Hopkins University og plassert i samsvar med de prosedyrer som er skissert i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) godkjent alle eksperimentelle protokoller.
1. Experimental Forberedelse
- Coat 12-brønners plate med 10% føtalt bovint serum (FBS) i fosfat-bufret oppløsning (PBS) i 60 min.
- Fjern beleggoppløsning og tilsett 200 ul av serum-fritt medium (SFM). Snurre plate for å sørge for at en film av media dekker hele overflaten.
2. kirurgiske prosedyrer
- Avlive drektige mus ved hjelp av institusjonens dyr omsorg komité-godkjent protokollen følges ved halshugging for å sikre fullstendig aktiv dødshjelp.
- Spray og rense magen regionen av musen med 70%etanol. Opprettholde strenge sterile teknikker for å unngå forurensning.
- Bruk pinsett og saks for å lage en 0,5 cm 2 snitt ved navlen regionen.
- Bruk fingrene til å klemme / ta tak i huden over og under snittet og trekk forsiktig på huden i motsatte retninger (hode og hale).
- Bruk pinsett og saks til å foreta en innledende snitt i membranen på navlen regionen. Forsiktig kuttet membranen i V-form fra navlen til eggstokkene på hver side (2 x 1,5 cm 2), og dermed avsløre livmoren.
- Bruk pinsett til å klemme oviduct forbinder livmoren til eggstokken og saks for å klemme oviduct på eggstokken side, og dermed frigjøre livmoren fra eggstokken.
- Trekk forsiktig opp i livmoren ved oviduct med pinsett og kutte livmoren fri fra blæren regionen med saks.
- Trekk livmoren ytterligere opp av egglederen med tang, og kuttet med tuber med saks på den andre siden, for derved å frigjøre livmoren fra mOuse.
- Overfør livmoren til et 50 ml rør og tilsett 20 ml kald steril PBS med Ca2 + og Mg2 +. PBS må inneholde Ca 2+ og Mg 2+ under embryo disseksjon.
- Rist røret i 10 sekunder for å vaske livmoren for blod.
- Overfør livmoren fra røret med pinsett og legg den i en 10 ml tallerken og tilsett 5 ml kald PBS på toppen av livmoren.
- Sett fatet med livmoren under en stereomikroskop.
Merk: Trinn 02.13 til 02.19 krever en stereomikroskop. - Bruk to par pinsett til å åpne forsiktig livmor og dissekere ut fosterblærer med embryoer fra livmor en etter en.
- Bruk to par pinsett til å nøye åpne fostervann sac som omgir fosteret, klemme sac med en pinsett og forsiktig fjerne den fra embryo, bruke de andre tang for å klippe og slipp fostersekken fra embryo. Hvis en bestemt genotype nødvendig, holde fostervann sac for genotyping.
- Plasser embryo på siden og bruke tang for å klippe den 1. og 2. bue baktil til hjertet mellom buen og svelg posen (figur 1A '').
- Forsiktig snu embryo til den andre siden og bruke tang for å klippe den første og andre bue baktil til hjertet mellom buen og svelg posen.
- Bruk pinsett til å kutte hjerte utstrømningen kanalen som fortsatt forbinder 1 og 2. svelget buene til embryoet. Fjern buene, som fortsatt er festet sammen i form av en sommerfugl (figur 1B), fra embryo.
- Bruk pinsett til å klemme og slippe en st svelget buer fra de resterende hjerte utstrømningen veiene og forutgående endoderm (Figur 1B '' indikert med stiplet linje og *).
- Bruk pinsett til å klemme og slippe 2. svelget buer fra de resterende hjerte utstrømningen skriftog forutgående endoderm (Figur 1B '' indikert med stiplet linje og **).
- Overføre hvert par av buer separat ved hjelp av pinsett og plasserer begge buer i midten av en utpekt brønnen. Plate 1 og 2. svelget buer i separate brønner. Sørg for at buene er i kontakt med filmen av media lagt i trinn 1.2. Det er avgjørende at buene ikke omfattes av medium, som de trenger for å komme i kontakt med overflaten av brønnen for feste i denne perioden.
3. Inkubasjon og bildebehandling
- Inkuber buer belagt i 12-brønns plate i 37 ° C / 5% CO 2 for 2 timer for buer å feste til godt areal.
- Tilsett 200 ul av 37 ° C SFM ned på siden av brønnen. Sørg for at buene fortsatt festet og ruge O / N.
- Neste dag, visuelt sjekke at svelget buene er festet og tilsett 200 ul 37 ° C SFM ned på siden avgodt. Hvis bueganger er igjen fristilt og flytende, forsiktig fjerne medier med en pipette uten å fjerne buer til bare en film av media er igjen. Bruk pipettespissen å plassere buer i midten av brønnen og gjenta trinn 3.1.
- Overvåke daglig; legge ~ 100-200 mL av media hver andre dag for å erstatte eventuelle fordampet medier.
Merk: 24-48 timer etter trekkende celler vises rundt buen og vil spre seg og migrere fra bue over de neste 5-8 dagene. Etter 36-72 timer dannelsen av juling cardiomyocytes kan observeres fra 2. svelg bue (figur 2B). Myotube dannelse kan observeres fra en st svelget erke 3-7 dager etter vedlegg (Figur 2A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under utviklingen kan ansikts muskel og hjerte forfedre spores som de sprer og migrere fra 1. og 2. svelget bue, for å bli hode og hjerte muskulatur, henholdsvis (figur 1A, A 'og A' '). Dyrking svelget buer tilbyr en unik måte å studere hjerte og muskelutvikling i detalj ex vivo. Etter disseksjon og feste av svelg buer, kan migrere celler fra vedlagte buer observeres innen 24-48 timer av kultur. Innen 3 dager kultur myotube dannelse kan observeres fra en st svelget buer og cardiomyocyte formasjon fra 2 nd svelget buer (figur 2a og 2b). Cardiomyocyte dannelse kan visuelt bekreftet av spontant kontrahering klynger av migrerende celler og / eller analyse av bestemte cardiomyocyte markører (f.eks Cardiac troponin T). Myotuvære / ansiktsmusklene Dannelse kan observeres visuelt ved lange langstrakt (opp til 500 mikrometer i lengde) spontant rykninger celler og / eller analyse av spesifikke muskel markører (f.eks Myogenin). Ved hjelp av CRE-lox system i mus, kan mesoderm avkom spores av fluorescerende reportere på CRE-uttrykk under ex vivo kultur (Figur 2A 'og 2B). På samme måte, med denne metoden er det mulig å studere skjebnen til avkommet, karakterisert ved at et spesielt gen av interesse er betinget slått ut eller overuttrykt, noe som ellers ville resultere i tidlig embryonisk letalitet som vi tidligere beskrevet 8.
Figur 1: Mouse embryo (Mesp1 CRE, Ai9) 9,5 dager etter befruktning (E.9.5 >). (A) Venstre side av embryo. (PA: Faryngeal Arch, OT: Avløp veiene, LV:.. Venstre ventrikkel (A ') Mesp1 linage-spor; RFP markerer Mesp1 + celler og deres avkom Arrow indikerer RFP + Mesp1-avkom i PA2 som er kontinuerlig med OT. (A '') Stiplet linje viser hvor du skal kutte PA1 og PA2 posterior til hjertet (B) Butterfly-like til høyre og venstre PA1 og PA2 etter disseksjon fra embryo FE:.. forutgående endoderm (B. ') RFP merkene Mesp1 avkom . i PA1 og PA2 (B '') * og ** sammen med de stiplede linjene indikerer hvor du skal klippe og slipp PA1 og PA2 fra OT og FE Skala:.. 500 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
laste / 52876 / 52876fig2.jpg "/>
Figur 2:. Dyrkede svelget buer (A) Cultured PA1 (3 dager med kultur). (A ') RFP markerer Mesp1 avkom i PA1. Piler og * indikerer tidlig myotube formasjon. (A '') Overlay av RFP uttrykk i PA1. (B) Cultured PA2 (8 dager med kultur). (B ') RFP merkene Mesp1 avkom i PA2. Piler og ** indikerer slo området kardiomyocytter (modifisert fra Shenje et al. 8). (B '') Overlay av RFP uttrykk i PA2. Skala:. 250 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne videoen viser vi hvordan å isolere og kultur første og andre svelget buer av 9,5 dager gamle museembryoer. Svelget buene er forbigående, segmentert buler som vises på craniolateral siden av utviklings embryo 9, som inneholder flere potente hjerte stamceller-byggesteiner for å gjøre hjertet under embryogenese 10,11 -i andre buer og hodet muskel forfedre i første buer 8 .
Disseksjon av svelget buer krever avanserte mus embryo disseksjon ferdigheter. Når buene har blitt dissekert ved hjelp av denne trinnvise protokoll og overført til pre-belagte brønner, er det kritisk at buene feste til bunnområdet. I denne protokoll har vi belegge brønner med 10% FBS, etterfulgt av kultur i SFM resulterer i festing og vekst av> 75% av buer, men andre beleggmaterialer kan brukes (Matrigel, gelatin, fibronektin etc.) samt serum containing medier.
Svelg buer fungerer som primordia for et mangfold av strukturer under utvikling. Etter innledende dannelsen av svelg buer (8 dager etter befruktning i mus), CPC ekspandere i PA2 og vandrer inn i hjerte utstrømningen kanalen hvor de differensiere i hjerteceller, og dermed tjene som en fornybar CPC som leverer celler som trengs for å opprettholde hjerte vekst. Som svelg buene er timelige utviklingsmessige strukturer (E8-11.5) og migrasjon av CPC i utstrømningen kanalen skjer fra ca E8-E10) dette gir visse begrensninger i teknikken. For CPC studier, anbefaler vi å bruke svelget buer dissekert mellom E9-10, på dette stadiet hver PA2 inneholde ca 5-800 RFP + celler (Mesp1 linage trace).
Med selvlysende merking, lar dette ex vivo kulturen oss å overvåke utviklings forfedre og deres differensiering i å slå cardiomyocytes eller myotubes In sanntid. I tillegg kan denne ex vivo kultursystem bli anvendt for å studere rollen til celle-autonome og microenvironmental faktorer som påvirker hjerte- / muskelstamcelle proliferasjon, migrering og differensiering ved bruk av eksisterende Cre / loxP linjer. Som sådan er dette systemet forventes å lette hjerte / muskel stamfar-nisje studier, som kan føre til en bedre forståelse av hjerte / muskel-formasjonen og sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| PBS + Ca2 + Mg2 | Corning | 21-030-CV | |
| 10 cm Petri plates | Fishersci | FB0875712 | |
| Scissor | |||
| Dissection forceps | |||
| Serum Free Media: | |||
| IMDM | Cellgro | 15-016-CV | |
| Ham’s F12 | Cellgro | 10-080-CV | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| B27-retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| 10% BSA (in PBS) (Invitrogen Cat#. P2489) | Life Sciences | P2489 | |
| 100x Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081) | Gibco | 35050-61 | |
| 100x Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063) | Gibco | 15140-122 |
References
- Kelly, R. G.
- Congenital Heart Defects. , CDC. Available from: http://www.cdc.gov/ncbddd/heartdefects/index.html (2013).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Tzahor, E., Evans, S. M. Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis. Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).
- Uosaki, H., et al. Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells. PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140, 2587-2596 (2013).
- Kwon, C., et al. A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate. Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, e02164 (2014).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).
- Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis. Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).
- Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy. Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).
