We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.
מבחני דיגיטליים הם שיטות חזקות המאפשרות זיהוי של תאים וספירה של מולקולות חומצות גרעין בודדות נדירים. עם זאת, מבחני דיגיטליים עדיין לא מיושמים באופן שיגרתי, בשל העלות והציוד ספציפי הקשורות לשיטות זמינות מסחרי. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה לקריאת נתונים של מבחני אגל דיגיטליים באמצעות מכשיר PCR בזמן אמת קונבנציונלי למדוד הקרינה בתפזורת של מבחני דיגיטליים מבוסס טיפה.
אנו מאפיינים את הביצועים של assay קריאת הנתונים בתפזורת באמצעות תערובות אגל סינתטיות וassay אגל דיגיטלי הגברה עקירה מרובה (מד"א). מד"א כמותי יתרונות במיוחד מפורמט דיגיטלי תגובה, אבל השיטה החדשה שלנו חלה על כל assay דיגיטלי. לפרוטוקולי assay דיגיטליים הוקמו כגון PCR הדיגיטלי, בשיטה זו משמשת כדי לזרז ולפשט קריאת נתוני assay.
המתודולוגיה קריאת הנתונים בתפזורת שלנו מביאה את היתרונות של partitioneמבחני ד ללא הצורך במכשור מיוחד קריאת נתונים. המגבלות העיקריות של המתודולוגיה קריאת נתונים בתפזורת מופחתות טווח דינמי בהשוואה לפלטפורמות אגל-ספירה ואת הצורך במדגם סטנדרטי, למרות שהדרישות לתקן זה הן פחות תובעניות מאשר לניסוי קונבנציונלי בזמן אמת. ההגברה הגנום כולו כמותי (WGA) משמשת לבדיקת מזהמים בתגובות WGA והיא הדרך הכי רגישה כדי לזהות הנוכחות של שברי DNA עם רצפים ידועים, נותנת הבטחה הגדולה השיטה בתחומי יישומים שונים, כולל בקרת איכות תרופות ואסטרוביולוגיה.
מבחני דיגיטליים לכימות חומצות גרעין (PCR הדיגיטלי) 1-4 ובסיס הזמנה (רצף) הם מאוד משפיעים על מדעי החיים ורפואה. מבחני דיגיטליים מספקים כימות של ספירה מולקולרית בקנה מידה מוחלט (לא ביחס לשליטה), מתן רגישות גבוהה, המאפשרת השוואות שטחיות על פני ניסויים, ומכריע, המאפשר הבנייה של מסדי נתונים גדולים המכילים נתונים דומים 5 (טבלה 1).
במהלך 15 השנים האחרונות, ההגברה הגנום כולו (WGA) יצאה לצד PCR ככלי כללי להגברת חומצות גרעין. כמו PCR, WGA היא שימושית עבור יישומים אנליטיים וpreparative על ידי הגברת אלמנטי מדגם דקות עד לרמה שניתן לאתר או המשמש לניתוחים שלאחר מכן כמו רצף בסיס בקלות. שלא כמו ה- PCR, WGA היא לא ספציפית למוקד ה- DNA מסוים, ולא מאפשרת הגברה של כל הרצפים במדגם, כוללים רצפים ידועים.הבדל מהותי זה בין PCR וWGA הופך את השיטות משלימות זו לזו ויוצר אתגרים שונים ביישומם.
התשואה הגבוהה של תגובות WGA 6 מאפשרת הגברה שגרתית של הדנ"א הגנומי ממולקולות בודדות 7, 8 תאים בודדים ודגימות נמוכות ביומסה אחרות 9 לכימות או ניתוח נוסף. האתגרים המרכזיים הקשורים לכימית WGA הם רגישותו הקיצונית למזהמים וההגברה אחידה על פני מולקולות תבנית בודדות 6. פופולריות עם זאת, WGA צובר כרצף תא בודד התפתחה כ" יישום הרוצח "של WGA טכנולוגיה 10, וכימות תבנית על ידי WGA הוא חשוב בתחומים רבים של יישום 7.
מכשור לכימות חומצות גרעין דיגיטלית תואר בעבר במגוון Valved ופורם microfluidic valvelessTS 11-14, כולל מבחני מבוססי אגל 15,16 (טבלה 2). עם זאת, מערכות מייקרו-נוזליות מסחריות לניתוח דיגיטלי דורשות ציוד מיוחד להתקנת תגובה וזיהוי מוצר 17. מיקרופלואידיקה מותאמת אישית valved גמישה, אך דורשת microfabrication דיוק ומערכות בקרה פנאומטי 18. אמנם זה יחסית פשוט לעשות מיקרו-טיפות monodisperse למבחנים דיגיטליים מבוסס תחליב 19,20, צג דיגיטלי הוא מבחינה טכנית מעיק, הדורש גם הדמיה רחב בתחום בקנה מידה גדולה (בדומה לטכנולוגיות רצף של הדור הבא פופולריות) 21,22 או במהירות גבוהה זרימה מבוססת זיהוי אגל 23-25. באופן אידיאלי, assay דיגיטלי יהיה פשוט מהגדרה לreadout, הקטנת צורך המכשור מורכב ומאפשר למספר גדול של דגימות כדי לקרוא במהירות. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה לקריאת נתונים של מבחני אגל דיגיטליים המשתמשת בזמן אמת קונבנציונלי PCR אניnstrument למדוד הקרינה בתפזורת של מבחני דיגיטליים מבוסס טיפה.
בעוד הגישה החדשה ניתן ליישם מבחני PCR דיגיטליים, זה יתרון במיוחד עבור מבחני WGA דיגיטליים לאנלוגיים שמבחני הגברה בזמן אמת (שנותנים תוצאות מצוינות לPCR) הם בעייתיים. WGA מיושם בדרך כלל לדגימות עם מולקולות תבנית שהטרוגנית ברצף, אורך, ותוכן בסיס. מולקולות תבנית שונות אלה מוגברים בשיעורים שונים 6, המחייבות את השימוש בהתייחסות ("סטנדרטי") מדגם עם מאפייני התאמה. לעתים קרובות, לא סטנדרטי כגון זמין, או המאפיינים של הדגימות הנכנסות אינם ידועים. ההטרוגניות של חומר ההזנה ורכוש אורך תלוי של chemistries WGA 26 גם לסבך את הפרשנות של תוצאות על ידי יצירת עמימות במה שלכמת – מסת הקלט, קלט מספר המולקולות, שילוב של השניים, או לא. Finally, רצף שאינו ספציפי הופך הגברה עקירה מרובה כמותית (מד"א) רגישה יותר לזיהום מאשר PCR כמו מאז מולקולות מזהמים של כל רצף יש פוטנציאל להפריע. מבחני דיגיטליים microfluidic לטפל זיהום על ידי הפרדת מולקולות תבנית וצמצום נפחי תגובה כזאת שפחות מזהם נדגמים.
כאן אנו משתמשים בשיטה פופולרית בידוד תרמי WGA, 27 מד"א. ראוי לציין, כמה chemistries WGA אחר כולל PicoPlex וMALBAC 28 תלוי באופן מכריע על צעדי עקירת גדיל בידוד תרמי ראשוניים. צעדי Isothermal להחמיר את האתגר של יישום מבחני אנלוגיים בזמן אמת לWGA כמותיים. WGA אינו יכול למנוע לחלוטין במהלך התקנה, שמוביל להגברה מראש משתנה לא רצויה, ולא discretized ("רכב על אופניו") באופן שבו שכפול של מולקולות הטרוגנית יכול להיות מונע להשלמה ועצר לפני המחזור הבא כמו 11 PCR </sup> (איור 1). פורמט assay דיגיטלי לWGA מסתגל נהלי התקנת תגובה אופייניים בשל ההפרדה של כל מולקולה לספירה בנקודת סיום assay (כך מראש הגברה אינה משפיעה על התוצאות) פירוש קריאת נתונים מקוריים דיוק יהיה בלתי תלוי בעיקר שינוי ביעילות הגברה.
Assay תלוי בטיפי שמן שהופקו בעם כמויות אחידות, כאות לרמת טיפה בנקודת סיום assay תהיה תלוי בטיפת הנפח, ואנחנו לא רוצים את העקביות של תוצאות תלויות בממוצע על פני חלוקת גדלי אגל. מה שהופך את טיפות monodisperse הוא כעת הליך סטנדרטי (כ -3,500 מסמכי אגל monodisperse פורסמו מאז 2013), אבל דורש מכשור microfluidic 25. למעשה, יותר משש חברות פיתחו מוצרים מסחריים עצמאיים המסתמכים על ייצור של טיפות כגון, ושבבי מייקרו-נוזליים קבלת אגל הםזמינים מסחרי 23,29. במחקר זה, השתמשנו מכשירי microfluidic מותאם אישית מיוצרים בבית (ראה פרוטוקול). מזרק משאבות לנהוג זרימה דרך המכשירים זמינים גם באופן מסחרי, אך לחלופין, ניתן להחליף עם מזרק חד פעמי יחיד לזרימה מונע ואקום כדי להפחית את העלויות 30.
מבחני דיגיטליים הם שיטות חזקות המאפשרות זיהוי של תאים נדירים וספירה של פרט של מולקולות חומצות גרעין. עם זאת, מבחני דיגיטליים עדיין לא מיושמים באופן שיגרתי במעבדות אנליטיות, נובעים בחלקו את העלות של ציוד מיוחד הקשורים לשיטות זמינות מסחרי. כאן אנו מתארים assay דיגיטלי נק…
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.
Evagreen Dye | Biotium | 31000 | |
Bovine serum albumin | New England Biotechnologies | B9000S | |
Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer | New England Biotechnologies | B0269S | Vortex periodically until aggregate dissolves |
Lambda DNA | New England Biotechnologies | N3011S | Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution |
Randomized MDA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-NNNNN*N-3' | |
PCR primers | Integrated DNA Technologies | 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’ | |
UltraPure Nuclease-free water | Life Technologies | 10977-015 | UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional) |
ROX reference dye | Life Technologies | 12223-012 | |
PCR optical strip caps | Life Technologies | 4323032 | |
PCR tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
dNTP (25uM each) | Agilent Technologies | 200415 | |
Thermocycler – Mx3000P qPCR system | Agilent Technologies | 401403 | |
Barrier pipette tips | VWR | 89003-046 | |
Bio-rad oil for evagreen | Bio-rad | 186-4005 | |
JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893-100RXN |