Ионные каналы, выраженные в почечных канальцев эпителия играют важную роль в патологии поликистоза почек. Здесь мы опишем экспериментальные протоколы, используемые для выполнения анализа и внутриклеточный уровень кальция измерения патч-зажим в эпителии кистозной свежевыделенными от грызунов почек.
Киста инициирование и расширение во поликистоза почек представляет собой сложный процесс характеризуется нарушениями пролиферации клеток, трубчатой просвета накопление жидкости и формирования внеклеточного матрикса. Активность ионных каналов и внутриклеточной сигнализации кальция являются ключевыми физиологические параметры, которые определяют функции эпителия канальцев. Мы разработали метод, подходящий для реального времени наблюдения деятельности ионных каналов с техникой патч-зажим и регистрации внутриклеточного Са 2+ уровня в эпителиальных монослоев свежевыделенных от кист почек. PCK крысы, генетическая модель аутосомно-рецессивный поликистоз почек (ARPKD), были использованы для экс здесь естественных анализа ионных каналов и потока кальция. Описанный здесь подробно, шаг за шагом процедуры предназначены для изоляции кистозные монослоев и нерасширенном канальцев из PCK или нормальных Спрэг Dawley (SD) крыс, и контролировать деятельность одного канала и внутриклеточные Са 2+ динамику.Этот метод не требует ферментативной обработки и позволяет анализировать в родном установки свежевыделенными эпителия монослоя. Кроме того, этот метод является очень чувствительным к изменениям внутриклеточных кальциевых и генерирует изображений с высоким разрешением для точных измерений. Наконец, изолированный кистозной эпителий может быть дополнительно использован для окрашивания с антителами или красители, подготовка первичных культурах и очистки для различных биохимических анализов.
Ионные каналы играют важную роль во многих физиологических функций, в том числе рост и дифференцировку клеток. Аутосомно доминантные и рецессивные поликистоз заболевания почек (ADPKD и АРПКБП, соответственно) генетические нарушения, характеризующиеся развитием почечной заполненных жидкостью кисты трубчатого эпителиальных клеток происхождения. ADPKD вызвано мутациями PKD1 или PKD2 генов, кодирующих polycystins 1 и 2, мембранные белки, участвующие в регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки. PKD2 сам по себе или в виде комплекса с PKD1 также функционировать в качестве Ca 2+ -permeable катионов канала 1. Мутации гена, кодирующего PKHD1 fibrocystin (рецептор, как белка ресничек ассоциированных участие в тубулогенеза и / или поддержания полярности эпителия) являются генетическая стимулом ARPKD 2. Рост кисты является сложным явлением, сопровождается распространением нарушенной 3,4, ангиогенез 5 дедифференцировки и потери полярныхность трубчатых клеток 6-8.
Неисправный реабсорбции и секреции в дополненной кистозной эпителия способствуют накоплению жидкости в просвет кисты и расширения 9,10. Нарушение потока зависит [Са 2+] сигнализации я был также связан с cystogenesis во ДОК 11-15.
Здесь мы опишем метод, подходящий для измерения патч-зажим одной активности канала и внутриклеточных Са 2+ уровня в кистозных эпителиальных монослоев, выделенных из PCK крыс. Этот метод был успешно применен нами для характеристики деятельности эпителиальных Na + канала (ENaC) 10 и [Са 2+] я -зависимые процессов, вызванных Ca 2+ -permeable TRPV4 и пуринергической сигнального каскада 13.
В этих исследованиях мы использовали ФКК крыс, модель ARPKD вызванной спонтанной мутации в гене PKHD1. Штамм был ФКК originallу получены из Sprague-Dawley (SD) крыс SD 16, таким образом, крыс, используемых в качестве соответствующего контроля для сравнения со штаммом ФКК. В результате, оба SD крыс сегменты нефрон и нерасширенном сбора каналы, выделенные из тех же крыс ФКК может служить двум разным группам сравнения для экспериментов по кистозного эпителия.
Мы описали здесь приложения обычным способом патч-зажим и изображений эпифлуоресцентной кальция кистозным эпителиальных монослоев, полученных из мышиного генетической модели АРПКБП. Протокол состоит из трех этапов, из которых наибольшее внимание должно быть уделено изоляции кист (ш…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Глена Slocum (Медицинский колледж штата Висконсин) и Колин А. Lavin (Nikon Instruments Inc) за отличную техническую помощь с микроскопии экспериментов. Это исследование было поддержано Национальными Институтами Здоровья предоставляет R01 HL108880 (как), R01 DK095029 (в ОПГ) и К99 HL116603 (для ТСП), Национальный фонд почек IG1724 (для ТСП), Американской кардиологической ассоциации 13GRNT16220002 (в ОПГ) и Бен Дж Липпс исследовательский грант от американского общества нефрологии (к DVI).
Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
Flou-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
Shaker | Boekel Scientific | 260350 | |
Light source | Sutter Instrument Co | Lambda XL | with integrated shutter/filter wheel driver |
Neutral density filters | Nikon | ND4, ND8 | |
Objective | Nikon | SFluo | 40/1.3 DIC WD 0.22 oil |
Camera | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
Nikon microscope (inverted) | Nikon | Nikon Eclipse TE2000-S | |
Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
Diamond pencil | Fisher Scientific | 22268912 | |
Image acquisition software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
Image analysis software | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format |
Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
Binocular stereomicroscope | Nikon | SMZ745 | |
Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
Other basic reagents | Sigma-Aldrich |