Ionekanaler uttrykt i nyretubuli epitel spille en betydelig rolle i patologi polycystisk nyresykdom. Her beskriver vi eksperimentelle protokollene som brukes til å utføre patch-clamp analyse og intracellulær kalsium nivå målinger ved cystisk epitel fersk isolert fra gnager nyrer.
Cyste initiering og ekspansjon i løpet av polycystisk nyresykdom er en kompleks prosess som kjennetegnes ved unormaliteter i rørformet celleproliferasjon, luminal væskeopphopning og ekstracellulær matrisedannelse. Aktivitet av ionekanaler og intracellulær kalsium signalisering er sentrale fysiologiske parametere som bestemmer funksjonene rørformet epitel. Vi utviklet en metode som passer for sanntids observasjon av ionekanaler aktivitet med patch-clamp teknikken og registrering av intracellulær Ca 2+ nivå i epitelmonolag nyisolerte fra nyrecyster. PCK rotter, en genetisk modell av autosomal recessiv polycystisk nyresykdom (ARPKD), ble brukt her for ex vivo analyse av ionekanaler og kalsium flux. Beskrevet her er en detaljert trinn-for-trinn fremgangsmåte er utformet for å isolere cystisk monolagene og ikke-utvidede rørelementer fra PCK eller normale Sprague Dawley (SD) rotter, og overvåke enkeltkanalaktivitet og intracellulære Ca 2 + dynamikk.Denne metoden krever ikke enzymatisk behandling og lar analyse i en innfødt innstilling av nystekte isolert epitel enkeltlag. Dessuten er denne teknikk meget følsom for endringer i den intracellulære kalsium og genererer bilder med høy oppløsning for nøyaktige målinger. Endelig kan isoleres cystisk epitel videre brukes for farging med antistoffer eller fargestoffer, fremstillingen av primærkulturer og rensing av forskjellige biokjemiske analyser.
Ionekanaler spille en betydelig rolle i mange fysiologiske funksjoner, inkludert cellevekst og differensiering. Autosomal dominant og recessive Polycystisk nyre sykdommer (ADPKD og ARPKD, henholdsvis) er genetiske lidelser preget av utviklingen av nyrevæskefylte cyster av røret epitelcelle opprinnelse. ADPKD er forårsaket av mutasjoner av PKD1 eller PKD2 gener som koder polycystins 1 og 2, membranproteiner som er involvert i regulering av celleproliferasjon og differensiering. PKD2 av seg selv eller som et kompleks med PKD1 også fungere som en Ca2 + -permeable kation kanal en. Mutasjoner i genet som koder for fibrocystin PKHD1 (a cilia-assosiert reseptor-lignende protein som er involvert i tubulogenesis og / eller vedlikehold av polariteten til epitel) er genetisk drivkraften i ARPKD 2. Cyste veksten er et komplekst fenomen akkompagnert med forstyrret spredning 3,4, angiogenese 5, dedifferentiation og tap av polarligheten av rørformede celler 6-8.
Defekt reabsorpsjon og utvidet sekresjon ved cystisk epitel bidra til væskeansamling i lumen og cyste utvidelse 9,10. Nedsatt strømningsavhengige [Ca2 +] signalering er også knyttet til cystogenesis under PKD 11-15.
Her beskriver vi en fremgangsmåte egnet for patch-clamp målinger av enkeltkanalaktivitet og intracellulære Ca 2 + nivåer i pasienter med cystisk epitelmonolag isolert fra PCK rotter. Denne metoden ble anvendt med hell ved oss å karakterisere aktiviteten av epiteliale Na + kanal (ENaC) 10 og [Ca2 +] -avhengige prosesser som induseres av Ca 2 + -permeable TRPV4 og purinergiske signalkaskade 13.
I disse studiene har vi brukt PCK rotter, en modell av ARPKD forårsaket av en spontan mutasjon i PKHD1 genet. Den PCK stammen var originally avledet fra Sprague-Dawley (SD) rotter som 16 derved SD-rotter blir anvendt som en egnet kontroll for sammenligning med PCK belastning. Som et resultat kan både SD rotte nevronet segmenter og ikke-utvidede oppsamlingskanaler isolert fra samme PCK rotter tjener som to forskjellige sammenligningsgrupper for eksperimenter med cystisk epitel.
Vi beskrev her anvendelser av konvensjonell patch-clamp teknikken og epifluorescence kalsium bildebehandling til cystisk epitelmonolag avledet fra en murine genetisk modell av ARPKD. Protokollen består av tre trinn, hvorav den mest oppmerksomhet bør rettes mot isolering av cyster (trinn 1.5 av protokoller delen) og til de elektrofysiologiske studier. Disse nøkkel prosedyrer krever omfattende opplæring og tålmodighet, og leseren bør ikke være frustrert på en gang.
Først av alt, bør …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) og Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) for utmerket teknisk assistanse med mikroskopi eksperimenter. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health gir R01 HL108880 (til AS), R01 DK095029 (til OPO) og K99 HL116603 (til TSP), National Kidney Foundation IG1724 (til TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (til OPO) og Ben J. Lipps Stipendiat fra American Society of Nefrologi (til DVI).
Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
Flou-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
Shaker | Boekel Scientific | 260350 | |
Light source | Sutter Instrument Co | Lambda XL | with integrated shutter/filter wheel driver |
Neutral density filters | Nikon | ND4, ND8 | |
Objective | Nikon | SFluo | 40/1.3 DIC WD 0.22 oil |
Camera | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
Nikon microscope (inverted) | Nikon | Nikon Eclipse TE2000-S | |
Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
Diamond pencil | Fisher Scientific | 22268912 | |
Image acquisition software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
Image analysis software | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format |
Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
Binocular stereomicroscope | Nikon | SMZ745 | |
Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
Other basic reagents | Sigma-Aldrich |