Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Fotodynamisk terapi med Blended ledende polymer / fulleren Nanopartikel Fotosensibilisatorer

doi: 10.3791/53038 Published: October 28, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I Fotodynamisk terapi (PDT) fotosensibilisatorer indgives til målvæv, og ved udsættelse for lys fotosensibilisatoren genererer reaktive oxygenarter (ROS). ROS arter såsom singlet oxygen og superoxid kan inducere oxidativt stress og efterfølgende strukturel skade på celler og væv 1-4. På grund af sin lette anvendelsen af denne metode har været aktivt undersøgt og kliniske forsøg har fundet sted 5,6. Der er dog væsentlige emner som mørketoksicitet af sensibilisatorer, patientens følsomhed over for lys (som følge af ikke-selektiv fordeling af sensibilisator), og hydrofobicitet sensibilisatorer (som fører til nedsat biotilgængelighed og potentiel akut toksicitet) forbliver.

Her rapporterer vi en fremgangsmåde til fremstilling og in vitro evaluering af ledende polymer nanopartikler blandet med fulleren som den næste generation fotosensibilisatorer til PDT. Nanopartiklerne dannes ved selvaggregering afhalvledende polymer MEH-PPV (poly [2-methoxy-5- (2-ethylhexyloxy) -1,4-phenylenevinylene]) med fulleren PCBM (phenyl-C 61 -smørsyremethylester), når disse materialer opløses i en kompatibel Opløsningsmidlet hurtigt injiceres i et ikke-kompatibelt opløsningsmiddel (figur 1A). Valget af MEH-PPV som vært polymer er motiveret af sin høje ekstinktionskoefficient, der fører til høje triplet dannelse, og både effektiv og ultrahurtig ladning og energi overførsel til fulleren PCBM 7. Disse egenskaber er ideelle til sensibilisering af singlet oxygen og superoxid dannelse i PDT.

Fulleren faktisk er blevet anvendt i PDT i både molekylære og nanopartikel formular 8-13. Imidlertid har alvorlige cytotoksicitet hæmmet videreudvikling 12. Her viser vi, at indkapsle fulleren i et væld matrix af MEH-PPV at give sammensatte MEH-PPV / PCBM nanopartikler resulterer i en PDT sensibiliserende materiale, som jeger ikke uløseligt cytotoksisk, viser specificitet mod kræftceller grund nanopartikel størrelse og overfladeladning, og udbyttet meget effektiv PDT behandling ved doser svagt lys på grund af de førnævnte fotofysiske egenskaber.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Kulturcenter cellelinier

  1. Thaw TE 71 (mus thymusepitelceller), MDA-MB-231 (human brystcancer-celler), A549 (human lunge kræftceller) og OVCAR3 (humanovarie tumorceller) ved at holde det kryogene hætteglas i varmt vand i mindre end 2 min . Der tilsættes 10 ml DMEM-medium suppleret med 10% FBS til hver cellelinie og centrifugeres i 6 minutter ved 106 x g.
  2. Aspirere suspensionen og tilføj 3 ml medier til pelleten. Bland cellerne ordentligt ved pipettering flere gange. Tilføj denne celle løsning på foropvarmede 7 ml DMEM-medium suppleret med 10% FBS i T75 kolber og holde kolberne i fugtig atmosfære af 95% luft / 5% CO2 ved 37 ° C. Mærk denne kolbe som Passage 0.
  3. Når konfluens på cellerne når 80%, høste cellerne ved at inkubere dem med 0,05% trypsin i 10 minutter. Neutralisere trypsin ved tilsætning af lige så stor mængde medier. Centrifuger denne opløsning i 6 minutter ved 106 x g. Fjern suspensionen, og der tilsættes 3 ml til det friske medier. Bland welll og overføre lille mængde (100 pi) til en kultur kolbe indeholdende 7 ml medium. Inkuber kulturen kolben i inkubator. Mærk kolben Passage 1.
  4. Kultur cellelinierne indtil passagen 11 eller 12.

2. Fremstilling af nanopartikler

  1. Udarbejdelse af ~ 10 -6 M (korrigeret) ufortyndet MEH-PPV stamopløsning
    1. I et hætteglas tilføje 1 mg Poly [2-methoxy-5- (2-ethylhexyloxy) -1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) med en molekylvægt (gennemsnitlig Mn) 150,000-250,000 g / mol og 3 ml tetrahydrofuran (THF) . Blandingen omrøres i 2 timer under opvarmning ved 80 ° C på en varmeplade.
    2. Foretage den ovennævnte opløsning i et nyt hætteglas under anvendelse af en 0,2 um sprøjtefilter. Mærk denne løsning som "ufortyndet MEH-PPV stamopløsning«. Denne løsning vil blive inddraget i udarbejdelsen nanopartikel efter finjustering af koncentrationen som beskrevet i trin 2.1.3 og 2.1.4.
    3. Der tilsættes 50 pi af den ufortyndede MEH-PPV stamopløsning i 3 ml THF. Mærk denne løsning som "fortyndet MEH-PPV stamopløsning«. Overføres til en 1 cm kuvette og kvarts måle absorbansen ved 495 nm ved UV-VIS spektroskopi.
    4. Hvis absorbansen af ​​den fortyndede MEH-PPV stamopløsning er højere end 0,17, fortyndes den ufortyndede MEH-PPV stamopløsning ved at tilføje mere THF 1 ml ad gangen, og gentag trin 2.1.3, indtil den målte absorbans ved 495 nm er i spænder fra 0,13 til 0,17.
    5. Beregn molariteten af ​​den fortyndede MEH-PPV stamopløsning ved hjælp af Lambert-Beer som vist nedenfor. Her 0,15 absorbans bruges som et eksempel for resten af protokollen (dvs.., Justere alle følgende beregninger baseret på observerede absorbans), den MEH-PPV ekstinktionskoefficient anvendes, er 10 7 M -1 cm-1 og vejlængden anvendte 1 cm.
      A = ε xbxc (Eqn 1)
      (ε - den molære ekstinktionskoefficient, A - absorbans, b - vejlængde, c - opløsningens koncentration)
      0.15 = 10 7 M -1 cm -1 x 1 cm xc (Eqn 2)
      c = 1,5 x 10 -8 M (Eqn 3)
      Brug denne koncentration at finde koncentrationen af ​​den ufortyndede MEH-PPV stamopløsning som følger:
      M 1 V 1 = M 2 V 2 (Eqn 4)
      0,15 x 10 -7 M x 3050 pi = M 2 x 50 pi (Eqn 5)
      M 2 = 9,15 x 10 -7 M (Eqn 6)
      Dette er den koncentration af "justeret ufortyndet MEH-PPV stamopløsning«.
  2. Beregning masse af MEH-PPV i den justerede ufortyndet MEH-PPV stamopløsning
    1. Beregn massen af MEH-PPV i 1 ml af den justerede ufortyndet stamopløsning som vist nedenfor anvendelse af forbindelsen opnået i afsnit 2.1.4 molaritet og molekylvægten (Mw) af MEH-PPV, hvilket er 10 6 g / mol.
      M = n / V (n -. Nej af mol, V - volumen i L) (Eqn 7)
      Således massen af ​​MEH-PPV i 1 ml justeret undiluted stamopløsning er 9.15 x 10 -4 g.
  3. Blander PCBM i MEH-PPV
    1. Beregn massen af phenyl-C 61 -smørsyremethylester (PCBM), der skal tilsættes til papirmassen MEH-PPV løsning for at gøre 50 vægt-% PCBM doteret MEH-PPV løsning, hvor 50 vægt% PCBM er defineret med hensyn til massen af MEH-PPV (dvs. halvdelen af massen af MEH-PPV). Ved at bruge vægten af ​​MEH-PPV opnået i afsnit 2.2.
      Masse af PCBM / 9,15 x 10 -4 g MEH-PPV x 100% = 50 vægt% PCBM (Eqn 8)
      Masse af PCBM = 4,57 x 10 -4 g (Eqn 9)
    2. 1 mg PCBM afvejes i et hætteglas og tilsæt 500 pi THF. Beregn koncentrationen af ​​PCBM i denne opløsning ved hjælp af molekylvægten af ​​PCBM som 910,88 g / mol
      Molariteten af ​​PCBM opløsning = 0,001 g / (910,88 g / mol * 500 pi) (Eqn 10)
      Molariteten af PCBM opløsning = 2,19 x 10 -9 mol / pl (Eqn 11)
    3. Beregn rumfanget af PCBM løsning nødvendig for at føje til den justerede ufortyndet MEH-PPV stamopløsning til opnåelse af 50 vægt% PCBM doteret MEH-PPV-opløsning i THF ved hjælp af molariteten beregnet i trin 2.3.2
      4,57 x 10 -4 g PCBM x 1 mol / 910,88 gx 1 pl / 2,19 x 10 -9 mol = 229 pi (Eqn 12)
      Tilføj 229 pi af PCBM opløsningen i 1 ml ufortyndet justeret MEH-PPV stamopløsning og bland godt.
  4. Fremstilling af nanopartikler ved genudfældning fremgangsmåde
    1. Overfør 1 ml af den blandede MEH-PPV / PCBM løsning i 1 ml sprøjten med kanylen knyttet til den.
    2. Hurtigt injiceres 1 ml af den blandede MEH-PPV / PCBM opløsningen i 4 ml demineraliseret vand under omrøring ved 1200 rpm. Stop omrøring umiddelbart efter injektion. Brug disse nanopartikler uden yderligere forarbejdning.

3. Inkubation af cellelinjer med Nanopartikler for Imaging

BEMÆRK: Alle de billeddannende forsøg blev afsluttet i 35 mm petriskåle

  1. Optagelse af nanopartitøjer i cellelinjer
    1. Kultur cellelinier op til 12 th passage. Ved 12 passage dyrkningsceller th i 35 mm petriskåle. Juster koncentration af tilsatte celler til 35 mm petriskåle således at der efter 24 timer er cellerne 40% konfluente.
    2. På dette stadium fjerne DMEM-medium suppleret med 10% FBS fra petriskåle, vaske cellerne med 1x DPBS to gange, og der tilsættes 100 pi af nanopartikler suspensionen i 2 ml DMEM til petriskåle.
    3. Efter 24 timer fjernes DMEM / nanopartikler suspensionen fra petriskåle og vask af cellerne med 1x DPBS 3 gange. Derefter fikseres cellerne ved inkubation med 4% paraformaldehyd i 10 min. Vask to gange med DPBS. Farv cellerne med 300 nM DAPI ved inkubering med farvestoffet i 2 minutter. Vask to gange med DPBS. Derefter holde cellerne i DPBS til billeddannelse.
  2. Påvisning af ROS
    1. Kultur A549 og OVCAR3 cellelinjer i petriskåle, 6 pr cellelinje, som forklaret i afsnit 3.1.1. MærkPetriskåle som vist i tabel 1.
    2. Tilsættes 100 pi af nanopartikel suspensionen i 2 ml DMEM til tre af de petriskåle som vist i tabel 1 og inkuberes i 24 timer. For petriskåle, der vil modtage lys doser, vaske cellerne efter 24 timer og suspendere cellerne i HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Dye frie medier.
    3. Varm op lampen af ​​sol simulator i 15 min. Placer UV-filter foran lampen at bortfiltrere UV-lys. Kalibrere lampe med en reference solcelle ved at justere lampens effekt for at opnå 0,5 solen (50 mW / cm2) intensitet ved overfladen af petriskålen. I denne særlige opsætning denne betingelse blev opnået med 218 W strøm til lampen.
    4. Placer petriskåle under lampen (låg åbent) i 60 minutter, hvilket resulterer i en lysdosis på 180 J / cm2, som vist i nedenstående beregninger:
      50 mW / cm 2 x 3.600 sec / 1.000 = 180 J / cm2
    5. Fjern HBSS og uden vask yderligere tilsættes 2 ml DMEM-medium suppleret med 10% FBS til de petriskåle. Inkubér cellerne i yderligere 2 timer.
    6. For den positive kontrol inkuberes cellerne med 100 uM hydrogenperoxid (H 2 O 2) i 30 min.
    7. Farv cellerne i alle petriskåle med en endelig koncentration på 5 uM af ROS påvisningsreagens ved at inkubere cellerne med farvestoffet i 30 minutter ved 37 ° C.
    8. Fikseres cellerne ved inkubation med 4% paraformaldehyd i 10 min. Vask to gange med DPBS. Farv cellerne med 300 nM DAPI ved inkubering med farvestoffet i 2 minutter. Vask to gange med DPBS. Derefter holde cellerne i DPBS til billeddannelse.
  3. Apoptose og nekrose af PI og annexin V FITC
    1. Kultur hver cellelinie i 5 petriskåle. Tre af disse petriskåle vil være for eksperimentet, mens de resterende 2 petriskåle bliver kontrolprøver. Inkubér 3 petriskåle til eksperimentere med nanopartikler som explained i afsnit 3.1.2. Kontrolprøverne ikke inkuberet med nanopartikler.
    2. Efter 24 timers inkubation følge trin 3.2.3.
    3. Placer de 3 eksperimentelle petriskåle under lampen (låg åbent) og fjerne en ved 20 min, en på 40 minutter og en ved 60 minutter. Dette giver tre prøver der blev udsat for lys doser på 60, 120 og 180 J / cm2, henholdsvis (beregning i afsnit 3.2.4). Dernæst blev en 180 J / cm2 lysdosis administrere et af de kontrol petriskåle. Dette er kontrollen med lysdosis anvendes i mangel af nanopartikler. Påfør ikke lysdosis til den resterende kontrolprøven (ingen nanopartikler og intet lys dosis anvendes).
    4. Erstatte HBSS med DMEM-medium suppleret med 10% FBS og holde petriskåle i inkubatoren i 4 timer.
    5. Farv cellerne i den eksperimentelle og kontrol petriskåle med 20 pi annexin V FITC ved at inkubere cellerne med farvestoffet i 15 minutter. Vask to gange med DPBS. Farv calen med 300 nM DAPI samt 300 nM PI (propidiumiodid) ved inkubering med farvestoffer til 2 min. Vask to gange med DPBS. Derefter holde cellerne i DPBS til billeddannelse.

4. Iboende Cytotoksicitet af nanopartikler

  1. Tælle celler og dyrkning i 96-brønds plader
    1. Cellerne høstes fra dyrkningskolber ved at fjerne mediet og vaske cellerne to gange med DPBS efterfulgt af inkubation af cellerne med 0,05% trypsin i 10 minutter. Tilsæt 2 ml DMEM-medium suppleret med 10% FBS til den resulterende celle opløsning. Bland opløsningen korrekt at adskille celleklynger i singlets.
    2. Tag 100 pi af cellesuspensionen og føje til 900 pi DMEM medium suppleret med 10% FBS. Bland godt. Placer 10 pi af denne suspension på et hæmocytometer. Tæl celler under anvendelse hæmocytometeret og justere koncentrationen af cellesuspensionen i 4.1.1 til 5 x 10 4 celler / ml.
    3. Take 5 plader med 96 brønde mærket som 0 time, 24 timerR, 48 timer, 72 timer og 96 timer. Der tilsættes 50 pi af 5 x 10 4 celler / ml-løsninger (TE 71 og A549) i brøndene, som vist i tabel 2, således podning 2.500 celler / brønd. Gør det samme procedure for OVCAR3 og MDA-MB-231-cellelinjer.
    4. Efter 24 timer vaskes brøndene med 1x DPBS, og der tilsættes 50 pi af stigende koncentrationer af nanopartikler i brøndene som vist i tabel 2. Forbered forskellige nanopartikler koncentrationer ved tilsætning af 20, 100, og 180 pi nanopartikel suspension fra 2.4.2 til DMEM til opnåelse af et slutvolumen på 2 ml, som giver nanopartikler koncentrationer på 0,4 x 10 -4 mg / ml, 2,0 x 10 -4 mg / ml, og 3,6 x 10 -4 mg / ml hhv. Hver cellelinje har triplikater for hver koncentration af nanopartikler.
  2. Måling af cellelevedygtighed i mørke
    1. Tilsæt 10 pi MTT til 0 VV-plade umiddelbart efter tilsætning nanopartikler. Inkubér pladen i 4 timer for formazan krysals til at danne. Der tilsættes 50 pi solubilisering opløsning i brøndene. Inkubér pladen i 6 timer for at opløse formazan-krystaller.
    2. Måle cellelevedygtighed af 0 VV-plade ved at optage absorbansen ved 570 nm med mikropladelæser.
    3. I 24 timer pladen, vaskes cellerne med 1x DPBS og der tilsættes 50 pi medier i hver brønd efter 24 timers inkubation med nanopartikler. Tilføj MTT og læse pladen som forklaret i 4.2.1 og 4.2.2.
    4. For 48 timer, 72 timer, og 96 timers-plader, vaske cellerne med 1x DPBS og tilsæt 50 ul medier i brøndene efter 24 timers inkubation med nanopartikler. Inkubér cellerne for de resterende perioder.
    5. 4.2.5) Mål cellelevedygtigheden ved den særlige tidspunkter som forklaret i punkt 4.2.1 og 4.2.2.
    6. Gentag den komplette eksperiment 3 gange (n = 3)

5. målecelle levedygtigheden efter PDT

  1. Tælle celler og dyrkning i 96-brønds plader.
    1. Mærke et sæt af 96-brønds plader som vist i tabel 3, både for TE 71 + A549 plader og OVCAR3 + MDA-MB-231 plader. Layoutet af pladerne vil være den samme som vist i 4.1.3.
    2. Seed de 96 brønde som forklaret i afsnit 4.1 med samme layout som vist i tabel 2 i afsnit 4.1.2.
    3. Efter 24 timer tilsættes nanopartikler til pladerne som beskrevet i 4.1.4.
    4. 24 timer efter tilsætning af nanopartikler vaske cellerne med 1x DPBS og tilsættes 50 pi HBSS til hver brønd.
    5. Bestråle pladerne med de respektive lysdoser som forklaret i 3.2.3.
    6. Erstatte HBSS med 50 pi DMEM-medium suppleret med 10% FBS og inkuberes pladerne i de respektive tidsperioder efter PDT.
    7. Efter hver tidsperiode måle cellelevedygtighed som forklaret i 4.2.1 og 4.2.2.

6. Fluorescens mikroskopi

  1. Optagelse af nanopartikler
    1. Tænd lygterne i mikroskopet ennd laseren 30 minutter før billeddannelse. Sæt petriskål, der indeholder de faste celler (som forklaret i afsnit 3.1) på scenen af ​​mikroskopet.
    2. Opsaml fluorescens fra nanopartikler og DAPI ved hjælp filtre som vist i tabel 4. Overlejre fasekontrast, nanopartikel og DAPI billeder i ImageJ software.
  2. Påvisning af ROS
    1. Tænd lygterne i mikroskopet 30 minutter før billeddannelse. Sæt petriskål indeholdende celler (som forklaret i afsnit 3.2) på scenen af ​​mikroskopet.
    2. Opsaml fluorescens fra nanopartikler, DAPI, og ROS påvisningsreagens ved hjælp filtre som vist i tabel 4. Overlejre fasekontrast, nanopartikel, DAPI og ROS påvisningsreagens billeder i ImageJ software.
  3. Apoptose og nekrose af PI og annexin V FITC
    1. Tænd lygterne i mikroskopet 30 minutter før billeddannelse. Sæt petriskålen indeholdende cellerne (som forklaret iafsnit 3.3) på scenen af ​​mikroskopet.
    2. Opsaml fluorescens fra nanopartikler, DAPI, PI, og Annexin V FITC ved hjælp filtre som vist i tabel 4. Overlejre fasekontrast, nanopartikel, DAPI, PI og Annexin V FITC billeder i ImageJ software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Optagelse og iboende cytotoksicitet af nanopartikler

De 50 vægt-% blandede MEH-PPV / PCBM nanopartikler blev inkuberet med TE 71, MDA-MB-231, A549 og OVCAR3 cellelinier. Den PCBM blanding niveau blev valgt som 50 vægt% PCBM, som har vist sig at give ideelle ladning og energi overføre egenskaber mellem konjugerede polymerer og fullerener 14. Fluorescensbilleder af nanopartikel optagelse er vist i figur 1B. Cellerne blev inkuberet i 24 timer med nanopartikler at sikre nanopartikel optagelse. Cellerne blev derefter fikseret med 4% paraformaldehyd før billeddannelse og farvet med DAPI for at påvise celler og placeringen af ​​kernen. For at billeddata tilstrækkeligt separerede celler 40% konfluens blev opretholdt. Fluorescensbilleder med tilsvarende fase kontrast billeder viser, at der er fortrinsret optagelse af nanopartikler ved A549 og OVCAR3 kræft cellelinjer. Ingen påviselig fluorescens kan ses i TE 71 kontrolog MDA-MB-231 cancer cellelinjer, hvilket indikerer begrænset optagelse. På den anden side, A549 og OVCAR3 cancercellelinier udviser signifikant nanopartikel optagelse. Intrinsic cytotoksicitet (mørketoksicitet) blev vurderet ved inkubation af 50 vægt-% blandede MEH-PPV / PCBM nanopartikler med TE 71, MDA-MB-231, A549 og OVCAR3 cellelinier og kvantificere cellelevedygtigheden ved MTT assay. MTT data i figur 1C viser normale proliferation af cellelinier.

Nanopartikler, som kilden til ROS

For at sikre, at nanopartiklerne er kilden til ROS, og kun efter udsættelse for lys, blev ROS-dannelse evalueret med et ROS påvisningsreagens kit. Data for OVCAR3 er vist i figur 2 Fravær af grøn emission i figur 2A -. C angiver ROS dannes ikke for kontrolprøverne. Observeres lysegrønne emission fra ROS påvisningsreagens for prøver behandlet med nanopartikler og udsatfor lys som vist i figur 2D og E (umiddelbart efter PDT og 2 timer efter PDT), bekræfter, at ROS genereres under PDT.

PDT

Udførelsen af ​​MEH-PPV / PCBM nanopartikler i PDT blev kvantificeret ved MTT-analysen umiddelbart efter PDT, og efter 4 og 12 timer efter inkubationsperioder. Dataene er vist i figur 3 for 4 timer efter inkubationsperioden. A549 og OVCAR3 cancercellelinier udviser signifikant celledød efter PDT-behandling: op til 60% for A549 og 100% for OVCAR-3. TE 71 kontrol og MDA-MB-231 cancercellelinier viser begrænset virkning. TE71 er en normal kontrol cellelinie og forventes ikke at internalisere nanopartikler. Kun lave ikke-specifik optagelse af nanopartikler af TE-71 observeres eksperimentelt. Lav nanopartikel optagelse er også observeret for MDA-MB-231, som er i dette tilfælde på grund af den lavere stofskifte sammenlignet med de andre cancercellelinier. PDT data viserat de MEH-PPV / PCBM nanopartikler er meget effektive PDT sensibilisatorer, og at PDT effektivitet skalaer med nanopartikel-optagelse. Forskellene i PDT resultater mellem de cancercellelinier denne forbindelse er på grund af forskellen i aggressivitet (metabolisme og hastigheden af ​​endocytose) mellem disse cellelinier.

Progression af PDT-induceret celledød

Levende / døde dobbelt farvning med PI og Annexin V FITC indeholder oplysninger om nekrotiske og apoptotiske mekanismer celledød. Denne farvning ordning blev anvendt til cellen linjer studerede her efter PDT for at lære mere om PDT-celledød veje. Figur 4 viser epiluminescence billeder af TE 71and OVCAR3 cellelinjer farvet med Annexin V FITC, PI og DAPI. Dataene viser, at der ikke er nogen virkning af PDT på TE 71 kontrol cellelinje, i overensstemmelse med ubetydelig optagelse af nanopartikler. Det samme blev lavet til MDA-MB-231 (data ikke vist). Når OVCAR3 gennemgik PDT ved 60 og 120 J / cm2 dobbelt farvning af PI (lilla) og Annexin V FITC (grøn) blev observeret. Ved 180 J / cm2 kun PI pletten blev observeret, hvilket tyder på akut nekrotisk celledød under denne betingelse.

Figur 1
Figur 1. (A) Fremstilling af nanopartikler ved genudfældning fremgangsmåde, (B) TE 71, MDA-MB-231, A549 og OVCAR3 cellelinjer inkuberet med nanopartikler. Nanopartiklerne er vist i grøn farve, er kernen vist i blå farve. De fluorescensbilleder overlejres med fasekontrast billeder, målestok = 20 um, (C) Iboende cytotoksicitet af nanopartikler evalueret ved måling af cellelevedygtighed for hver cellelinie op til 96 timer. Celle- levedygtighed sammenlignes med dosis styring af nanopartikler (0 mg / ml) ved at sætte levedygtigheden af ​​control prøver på 100% (ikke vist). Fejlsøjler er de standardafvigelser for resultater fra 3 separate forsøg (n = 3). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Påvisning af ROS i OVCAR3 cellelinje med ROS påvisningsreagens. (A) ingen nanopartikler, intet lys eksponering, (B) ingen nanopartikler, der udsættes for 180 J / cm2 lys, (C) 2 x 10 -4 mg / ml nanopartikler, intet lys eksponering, (D) med nanopartikler og eksponering for 180 J / cm2 lys, taget umiddelbart efter behandlingen, (E) 2 timer efter PDT, (F) med 100 ul H 2 O 2 som positiv kontrol. Den lyse grønne emission i DF i s fra ROS påvisningsreagens bekræfter ROS formation. Skala bar = 30 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Cell levedygtighed TE 71, MDA-MB-231, A549 og OVCAR3 cellelinier administreret med stigende doser af nanopartikler og bestrålet med 120 J / cm2 lysdosis. Den post-PDT inkubationstiden er 4 timer. Doserne nanopartikler i legenden er i 10 -4 mg / ml. Fejlsøjler er de standardafvigelser for resultater fra 3 separate forsøg (n = 3). Klik her for at se en større version af dette tal.

igur 4 "src =" / files / ftp_upload / 53038 / 53038fig4.jpg "/>
Figur 4. Levende / døde farvning af TE 71 og OVCAR3 cellelinier med annexin V FITC og PI. Grøn emission svarer til annexin V FITC, svarer lilla emission til PI (rød, blandet med blå DAPI emission) og blå emission svarer til DAPI nuklear farvning. Billeder er den overlejring af fase kontrast og epiluminescence billeder. Skala bar = 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. solsimulator setup for eksponering af celler med kalibreret lys. En reference solcelle blev anvendt til kalibrering, er vist i det indsatte registrering 0,5 sol lysintensitet (50 mW / cm2)./53038/53038fig5large.jpg "Target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Negative kontroller Ingen NP'er, intet lys Ingen NP'er, med lys Ingen lys, med nationale parlamenter
Positiv kontrol 100 pi H 2 O 2 (No NP, intet lys) --- ---
Eksperimentel 0 timer efter PDT (NP'er og lys) 2 timer efter PDT (NP'er og lys) ---

Tabel 1: Eksperimentel design til påvisning af ROS.

0 VV-plade Medier TE 71 A549 Medier
Ingen behandling
0 mg / ml
0,4 x 10 -4 mg / ml
2,0 x 10 -4 mg / ml
3,6 x 10 -4 mg / ml

Tabel 2: Opstilling af 96-brønds plade til inkubation af nanopartikler til at evaluere iboende cytotoksicitet af nanopartikler / PDT virkning

Platte nr. Lysdosis (J / cm2) Indlæg PDT tid (timer)
1 60 0
2 60 4
3 60 12
4 120 0
5 120 4
6 120 12
7 180 0
8 180 4
9 180 12

Tabel 3: mærkning af 96-brønds plader for PDT evaluering.

Fluorophor Excitationsfilter Dichroic spejl Emissionsfilter Mikroskopi Excitationskilde
Nanopartikel 488/10 500 LP 510 LP Konfokal Ar-ion laser Kr
DAPI 350/52 405 LP 450/20 Epiluminescence Kviksølvlampe
PI 543/22 562 592/40 Epiluminescence Kviksølvlampe
Annexin V FITC 483/30 505 LP 535/40 Epiluminescence Kviksølvlampe
ROS påvisningsreagens 491/10 510 DCLP 525/50 Epiluminescence Kviksølvlampe

Tabel 4. Mikroskopi konfiguration til billeddannelse eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For at opnå nanopartikel optagelse var det nødvendigt at opretholde nogle kritiske foranstaltninger samtidig fremstilling af nanopartikler. En 10 -6 M MEH-PPV løsning (blandet med 50 vægt-% PCBM) i THF var indstillet på at tilføre DI vand, da det blev observeret, at koncentrationen af denne løsning spiller en vigtig rolle i fastsættelsen af størrelsen af nanopartikler dannes. Koncentration blev kontrolleret ved UV-vis spektroskopi. Bemærk, at i protokol trin 2.1.3 det var nødvendigt at fortynde det oprindeligt forberedt MEH-PPV-opløsning (ufortyndet MEH-PPV stamopløsning), inden der gøres UV-vis spektra idet denne opløsning har en absorbans meget større end 1. Hastigheden af ​​injektion spiller også en kritisk rolle i at afgøre størrelsen af ​​nanopartiklerne og skal være så hurtigt som muligt under kraftig omrøring DI vand. Langsom injektion vil resultere i større nanopartikler. Desuden bør omrøringen standses umiddelbart efter injektion for at undgå yderligere aggregering. Mens indsprøjtningopløsningen i vand er det nødvendigt at holde nålen nær den indre overflade af hætteglasset, medens kanylen helt ind i opløsningen for at undgå bobledannelse, hvilket vil påvirke størrelsen af ​​nanopartiklerne. I vores eksperimenter nanopartikler størrelser opnåede var 61,5 ± 23,3 nm som målt ved DLS. DLS blev valgt i stedet for TEM som det er hurtig, billig, pålidelig for denne størrelse og let tilgængelige. Zeta-potentialet på disse nanopartikler viste sig at være -9,66 ± 8,12 mV, dvs. lidt negativ til neutral overfladeladning.

Det var vigtigt at tælle celler, mens bedømmelsen af ​​selve cytotoksicitet af nanopartikler og kvantificere PDT resultater, da disse teknikker er baseret på MTT-assayet som tilvejebringer en kvantitativ måling af cellelevedygtighed. Det er vigtigt at starte forsøget med det samme antal celler i hver brønd af 96-brønds plade, som giver mulighed for sammenligning af cellelevedygtighed i forhold til dosis af nanoparticles og lys samt kontroleksperimenter.

En solsimulator blev anvendt til at bestråle prøverne. Opsætningen er vist i figur 5 og består af lyskilden, et UV-filter, og en reference solcelle. Med denne belysning ordning kunne opnås en høj grad af kontrol med de spektrale egenskaber og intensitet af lyskilden, hvilket resulterede i meget reproducerbare resultater. Det er meget vigtigt at indse, at de fleste lyskilder ikke giver en ensartet intensitet profil. Solsimulatoren imidlertid kan justeres for at opnå nær ensartet intensitet i området for belysning. Dette blev bekræftet ved en reference solcelle i forskellige områder af det belyste område. Vi tog også omhu for altid at placere pladerne i samme region i den lysplet og i samme orientering i forhold til yderligere at minimere virkningerne af variation i intensitet. Lyskilden at prøve afstand angivet i figur 5 forsynet os med 50mW / cm2 (0,5 solen) af intensitet under en elektrisk lampe effekt på 218 W. Til disse eksperimenter HBSS farvestof frie medier blev anvendt for at undgå absorption af lys ved indikatorfarvestoffer. Efter PDT, blev cellerne igen inkuberet i visse tidsperioder ved 37 ° C (post-PDT inkubering) at observere forløbet af PDT.

Farvning af celler, der kræves nogle trial and error at finde den korrekte koncentration af det pågældende farvestof. Dette opnås ved at gentage forsøget samtidig øge farvestofkoncentrationen støt indtil de nødvendige resultater blev opnået.

Fremgangsmåden har også et par begrænsninger, især med hensyn til nanopartikel, og PDT-behandling. Da nanopartikler fremstilles ved genudfældning fremgangsmåde der er en vis variation i den opnåede nanopartikel størrelsen fra parti til parti, og nogle polydispersitet i nanopartikel størrelse eksisterer der ikke kan styres. Det har heller ikke været muligt at nanoparticles mindre end 20 nm i størrelse. Disse begrænsninger kan være udfordringer i udvikling af små størrelse monodisperse nanopartikler, der kan anvendes in vivo. Endvidere in vitro PDT kræver eksperimentet cellerne at ligge uden for inkubatoren i en længere tid, hvilket kan indføre nogle stress på cellerne.

Den heri beskrevne metode til PDT er væsentlig med hensyn til de nuværende metoder. PDT under anvendelse af små molekyler sensibilisatorer og overfølsomhed doteret nanopartikler har haft begrænset klinisk anvendelse på grund af væsentlige problemer med mørketoksicitet af sensibilisatorer, patientens følsomhed over for lys (som følge af ikke-selektiv fordeling af sensibilisator), og hydrofobicitet sensibilisatorer (som fører til reduceret biotilgængelighed og potentiel akut toksicitet). I kirurgi, selv hvis tumoren fjernes fra kroppen, forbliver et par cancerceller og kan resultere i remission. I strålebehandling og kemoterapi normalt væv påvirkes også.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) Sigma Aidrich 536512-1G average Mn 150,000-250,000
[6,6]-Phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) Sigma Aidrich 684449-500MG >99.5%
Tetrahydrofuran (THF) EMD TX0284-6 Drisolv
1 ml syringe National Scientific Company 37510-1 For filtration of MEH-PPV solution
Syringe filter VWR 28145-495 25 mm, 0.2 µm, PTFE
1 ml syringe Hamilton Company 81320 For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) Corning (VWR) 45000-350
Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS) Quality Biological (VWR) 10128-740
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x without calcium and magnesium (DPBS) Corning (VWR) 45000-436
Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS) Corning (VWR) 45000-736
Trypsin EDTA 1x 0.25% Corning (VWR) 45000-664 Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences  15710 16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS
DAPI  Biotium VWR 89139-054 Nuclear stain
5 ml pipettes VWR 82050-478
75 cm2 culture flask VWR 82050-856 for culturing cells
96-well plates VWR 82050-771 for MTT assays
Tissue Culture Dishes with Vents Greiner Bio-One (VWR) 82050-538
Propidium iodide Molecular probes P3566
Annexin V FITC Invitrogen A13199 dye for apoptosis
Celltiter 96 non-R 1000 assays Promega (VWR) PAG4000 MTT
CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection Invitrogen C10444 For ROS detection
UV-vis spectrometer Agilent 8453
Fluorescence spectrometer NanoLog HoribaJobin Yvon
Dynamic light scattering PD2000DLS, Precision detector
Incubator NuAir DH Autoflow
Confocal microscope Zeiss Axioskop2 63X oil immersion objective lens
Epiluminescence microscope Olympus IX71 60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera
Solar Simulator Newport 67005 Oriel Instruments
Reference solar cell Oriel  VLSI Standards Incorporated
Microplate reader BioTek Ex808
Hemocytometer Hausser Scientific Partnership 3200 For counting cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dolmans, D., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3, (5), 380-387 (2003).
  2. Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. J Natl Cancer Inst. 90, (12), 889-905 (1998).
  3. Ferrari, M. Cancer nanotechnology: Opportunities and challenges. Nat Rev Cancer. 5, (3), 161-171 (2005).
  4. Oleinick, N. L., Morris, R. L., Belichenko, T. The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why, and how. Photochem Photobiol Sci. 1, (1), 1-21 (2002).
  5. Ormond, A., Freeman, H. Dye Sensitizers for Photodynamic Therapy. Materials. 6, (3), 817-840 (2013).
  6. Pass, H. I. Photodynamic Therapy in Oncology - Mechanisms and Clinical Use. J Natl Cancer Inst. 85, (6), 443-456 (1993).
  7. Sariciftci, N. S., Smilowitz, L., Heeger, A. J., Wudl, F. Photoinduced electron transfer from a conducting polymer to buckminsterfullerene. Science. 258, (5087), 1474-1476 (1992).
  8. Sperandio, F. F., et al. Photoinduced electron-transfer mechanisms for radical-enhanced photodynamic therapy mediated by water-soluble decacationic C-70 and C84O2 Fullerene Derivatives. Nanomed-Nanotechnol. 9, (4), 570-579 (2013).
  9. Fan, J. Q., Fang, G., Zeng, F., Wang, X. D., Wu, S. Z. Water-Dispersible Fullerene Aggregates as a Targeted Anticancer Prodrug with both Chemo- and Photodynamic Therapeutic Actions. Small. 9, (4), 613-621 (2013).
  10. Grynyuk, I., et al. Photoexcited fullerene C-60 disturbs prooxidant-antioxidant balance in leukemic L1210 cells. Materialwiss Werkstofftech. 44, (2-3), 139-143 (2013).
  11. Liu, X. M., et al. Separately doped upconversion-C-60 nanoplatform for NIR imaging-guided photodynamic therapy of cancer cells. Chem Commun. 49, (31), 3224-3226 (2013).
  12. Trpkovic, A., Todorovic-Markovic, B., Trajkovic, V. Toxicity of pristine versus functionalized fullerenes: mechanisms of cell damage and the role of oxidative stress. Arch Toxicol. 86, (12), 1809-1827 (2012).
  13. Chen, Z. Y., MA, L. J., Liu, Y., Chen, C. Y. Applications of Functionalized Fullerenes in Tumor Theranostics. Theranostics. 2, (3), 238-250 (2012).
  14. Park, S. H., et al. Bulk heterojunction solar cells with internal quantum efficiency approaching 100%. Nat Photonics. 3, (5), 297-302 (2009).
Fotodynamisk terapi med Blended ledende polymer / fulleren Nanopartikel Fotosensibilisatorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Doshi, M., Gesquiere, A. J. Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers. J. Vis. Exp. (104), e53038, doi:10.3791/53038 (2015).More

Doshi, M., Gesquiere, A. J. Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers. J. Vis. Exp. (104), e53038, doi:10.3791/53038 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter