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Chemistry

मिश्रित पॉलिमर / Fullerene Nanoparticle photosensitizers के संचालन के साथ Photodynamic थेरेपी

doi: 10.3791/53038 Published: October 28, 2015

Introduction

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Photodynamic थेरेपी में (पीडीटी) photosensitizers ऊतक लक्षित करने के लिए प्रशासित रहे हैं, और photosensitizer प्रकाश के संपर्क पर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पन्न करता है। ऐसे स्वेटर ऑक्सीजन और सुपरऑक्साइड के रूप में आरओएस प्रजातियों ऑक्सीडेटिव तनाव और कोशिकाओं और ऊतकों को 1-4 करने के बाद संरचनात्मक क्षति के लिए प्रेरित कर सकते हैं। कारण आवेदन के अपने आसानी के लिए इस विधि को सक्रिय रूप से जांच की गई है और क्लिनिकल परीक्षण जगह 5,6 ले लिया है। हालांकि, इस तरह के (कम जैव उपलब्धता और संभावित तीव्र विषाक्तता की ओर जाता है) sensitizers के अंधेरे sensitizers की विषाक्तता, प्रकाश के लिए (कारण sensitizer की गैर चयनात्मक वितरण करने के लिए) रोगी संवेदनशीलता, और hydrophobicity के रूप में महत्वपूर्ण मुद्दों पर बने हुए हैं।

यहाँ हम निर्माण के लिए और इन विट्रो पीडीटी के लिए अगली पीढ़ी के photosensitizers के रूप में फुलरीन के साथ मिश्रित बहुलक नैनोकणों के संचालन के मूल्यांकन के लिए एक विधि की रिपोर्ट। नैनोकणों के आत्म-एकत्रीकरण से बनते हैंsemiconducting बहुलक MEH-पीपीवी (पाली [2-methoxy-5- (2-ethylhexyloxy) -1,4-phenylenevinylene]) इन सामग्रियों को एक संगत में भंग कर दिया जब फुलरीन PCBM (फिनाइल-सी 61 -butyric एसिड मिथाइल एस्टर) के साथ विलायक तेजी से एक गैर-संगत विलायक (चित्रा 1 ए) में इंजेक्ट किया जाता है। मेजबान बहुलक के रूप में MEH-पीपीवी के चुनाव त्रिक गठन की उच्च दर की ओर जाता है कि इसकी उच्च विलुप्त होने के गुणांक से प्रेरित है, और फुलरीन PCBM 7 के लिए कुशल और ultrafast प्रभारी और ऊर्जा हस्तांतरण दोनों है। इन गुणों के स्वेटर ऑक्सीजन और पीडीटी में सुपरऑक्साइड गठन को संवेदनशील बनाने के लिए आदर्श होते हैं।

Fullerene वास्तव में दोनों आणविक और nanoparticle प्रपत्र 8-13 में पीडीटी में लागू किया गया है। हालांकि, गंभीर cytotoxicity आगे के विकास के लिए 12 बाधा उत्पन्न की है। यहाँ हम MEH-पीपीवी के एक मेजबान मैट्रिक्स में फुलरीन encapsulating एक पीडीटी संवेदनशील सामग्री में समग्र MEH-पीपीवी / PCBM नैनोकणों परिणाम है कि पता चलता है कि मैंआंतरिक रूप से साइटोटोक्सिक नहीं है, कारण ऊपर उल्लिखित photophysical गुणों के कैंसर nanoparticle आकार और सतह के प्रभारी की वजह से कोशिकाओं, और कम रोशनी मात्रा में पैदावार अत्यधिक प्रभावी पीडीटी उपचार की दिशा में विशिष्टता से पता चलता है।

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Protocol

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1. संवर्धन सेल लाइन्स

  1. कम से कम 2 मिनट के लिए गर्म पानी में cryogen शीशियों धारण करके पिघलना ते 71 (माउस थाइमिक उपकला कोशिकाओं), एमडीए MB-231 (मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं), A549 (मानव फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं) और OVCAR3 (मानव डिम्बग्रंथि ट्यूमर कोशिकाओं) । 106 x जी पर 6 मिनट के लिए प्रत्येक कोशिका लाइन और सेंट्रीफ्यूज के लिए 10% FBS के साथ पूरक 10 मिलीलीटर DMEM मीडिया जोड़ें।
  2. निलंबन Aspirate और गोली के लिए 3 एमएल मीडिया जोड़ें। ठीक से कई बार pipetting द्वारा कोशिकाओं मिलाएं। इस सेल समाधान T75 बोतल में 10% FBS के साथ पूरक 7 मिलीलीटर DMEM मीडिया गर्म पूर्व में जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 95% हवा / 5% सीओ 2 के humidified माहौल में बोतल रखने के लिए। पारित होने के 0 के रूप में इस कुप्पी लेबल।
  3. कोशिकाओं के confluency 80% तक पहुँच जाता है, 10 मिनट के लिए 0.05% trypsin के साथ उन्हें incubating द्वारा कोशिकाओं फसल। मीडिया के बराबर राशि जोड़कर trypsin बेअसर। अपकेंद्रित्र 106 x जी पर 6 मिनट के लिए इस समाधान। निलंबन निकालें और इसे करने के लिए 3 मिलीलीटर ताजा मीडिया जोड़ें। Wel के मिक्सएल और 7 मिलीलीटर मीडिया वाले एक संस्कृति फ्लास्क छोटी राशि (100 μl) हस्तांतरण। इनक्यूबेटर में संस्कृति फ्लास्क सेते हैं। मार्ग 1 के रूप में कुप्पी लेबल।
  4. पारित होने के 11 या 12 तक संस्कृति सेल लाइनों।

नैनोकणों 2. निर्माण

  1. ~ 10 -6 एम (समायोजित) undiluted MEH-पीपीवी स्टॉक समाधान की तैयारी
    1. एक शीशी में 1mg पाली आणविक वजन के साथ [2-methoxy-5- (2-ethylhexyloxy) -1,4-phenylenevinylene] (MEH-पीपीवी) (औसत करोड़) 150,000-250,000 जी / मोल और 3 मिलीग्राम tetrahydrofuran (THF) जोड़ने । एक गर्म थाली पर 80 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करने, जबकि 2 घंटे के लिए मिश्रण हिलाओ।
    2. 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर एक नई शीशी में ऊपर समाधान फ़िल्टर। 'Undiluted MEH-पीपीवी शेयर समाधान' के रूप में इस समाधान लेबल। कदम 2.1.3 और 2.1.4 में वर्णित के रूप में यह समाधान एकाग्रता के ठीक ट्यूनिंग के बाद nanoparticle तैयारी में शामिल किया जाएगा।
    3. 3 मिलीग्राम THF में undiluted MEH-पीपीवी शेयर समाधान के 50 μl जोड़ें। 'पतला MEH-पीपीवी शेयर समाधान' के रूप में इस समाधान लेबल। यूवी की तुलना स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा 495 एनएम पर absorbance एक 1 सेमी क्वार्ट्ज क्युवेट के लिए स्थानांतरण और उपाय।
    4. पतला MEH-पीपीवी शेयर समाधान के absorbance 0.17 से अधिक है, तो एक समय में अधिक THF 1 मिलीलीटर जोड़कर undiluted MEH-पीपीवी शेयर समाधान पतला, और 495 एनएम पर मापा absorbance में है जब तक कदम 2.1.3 दोहराने 0.13-0.17 लेकर।
    5. नीचे के रूप में दिखाया लैम्बर्ट बीयर कानून का उपयोग करके पतला MEH-पीपीवी शेयर समाधान के molarity गणना। यहां 0.15 absorbance के प्रोटोकॉल के शेष के लिए एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया जाता है (यानी। मनाया absorbance के आधार पर सभी निम्नलिखित गणना समायोजित) का उपयोग किया MEH-पीपीवी विलुप्त होने के गुणांक 10 7 एम -1 सेमी इस्तेमाल किया पथ की लंबाई -1 और है 1 सेमी।
      एक = ε xbxc (eqn 1)
      (Ε - दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक, एक - absorbance, बी - पथ की लंबाई, सी - समाधान की एकाग्रता)
      0।15 = 10 7 एम -1 -1 सेमी एक्स 1 सेमी XC (eqn 2)
      सी = 1.5 x 10 -8 एम (eqn 3)
      इस प्रकार के रूप undiluted MEH-पीपीवी स्टॉक समाधान की एकाग्रता के लिए यह एकाग्रता का उपयोग करें:
      एम 1 वी 1 = 2 एम वी 2 (eqn 4)
      0.15 x 10 -7 एम एक्स 3050 μl = एम 2 एक्स 50 μl (eqn 5)
      एम 2 = 9.15 x 10 -7 एम (eqn 6)
      इस 'समायोजित undiluted MEH-पीपीवी शेयर समाधान' की एकाग्रता है।
  2. समायोजित undiluted MEH-पीपीवी शेयर समाधान में MEH-पीपीवी की बड़े पैमाने पर गिना जा रहा है
    1. खंड 2.1.4 में प्राप्त molarity और 10 6 ग्राम / मोल है जो MEH-पीपीवी की आणविक वजन (एम डब्ल्यू), का उपयोग कर नीचे दिखाया गया के रूप में समायोजित undiluted शेयर समाधान के 1 मिलीलीटर में MEH-पीपीवी के द्रव्यमान की गणना।
      एम = n / वी (एन -। कोई मोल्स की, वी - एल में मात्रा) (eqn 7)
      इस प्रकार, 1 मिलीलीटर में MEH-पीपीवी की बड़े पैमाने पर अंड समायोजित कीiluted शेयर समाधान 9.15 x 10 -4 जी है।
  3. MEH-पीपीवी में सम्मिश्रण PCBM
    1. फिनायल-सी 61 -butyric एसिड मिथाइल एस्टर (PCBM) के द्रव्यमान की गणना 50% wt PCBM बड़े पैमाने पर करने के लिए सम्मान के साथ परिभाषित किया गया है, जहां 50% wt PCBM डाल दिया गया MEH-पीपीवी समाधान बनाने के लिए शेयर MEH-पीपीवी समाधान में जोड़े जाने के लिए MEH-पीपीवी की (यानी, MEH-पीपीवी के आधे मास)। धारा 2.2 में प्राप्त MEH-पीपीवी के वजन का उपयोग करके।
      MEH-पीपीवी x 100% = 50% wt PCBM की PCBM / 9.15 x 10 -4 जी का मास (eqn 8)
      PCBM = 4.57 x 10 -4 जी का मास (eqn 9)
    2. एक शीशी में 1 मिलीग्राम PCBM वजन और 500 μl THF जोड़ें। 910.88 छ / मोल के रूप में PCBM की आणविक वजन का उपयोग कर इस समाधान में PCBM की एकाग्रता की गणना
      PCBM समाधान = 0.001 ग्राम / (910.88 छ / मोल * 500 μl) के molarity (eqn 10)
      PCBM समाधान के molarity = 2.19 x 10 -9 मोल / μl (eqn 11)
    3. PCBM समाधान की मात्रा की गणना के लिए समायोजित करने के लिए जोड़ने की जरूरत एमई undilutedएच-पीपीवी शेयर समाधान कदम 2.3.2 में गणना molarity का उपयोग करके THF में 50% wt PCBM डाल दिया गया MEH-पीपीवी समाधान प्राप्त करने के लिए
      4.57 एक्स PCBM एक्स 1 मोल / 910.88 GX 1 μl / 2.19 x 10 -9 मोल = 229 μl के 10 -4 जी (eqn 12)
      समायोजित undiluted MEH-पीपीवी शेयर समाधान के 1 मिलीलीटर में PCBM समाधान के 229 μl जोड़ें और अच्छी तरह मिला लें।
  4. Reprecipitation विधि द्वारा नैनोकणों की तैयारी
    1. स्थानांतरण से जुड़ी यह सुई के साथ 1 मिलीलीटर सिरिंज में मिश्रित MEH-पीपीवी / PCBM समाधान के 1 मिलीलीटर।
    2. तेजी से 1,200 आरपीएम पर सरगर्मी डि पानी के 4 मिलीलीटर में मिश्रित MEH-पीपीवी / PCBM समाधान के 1 मिलीलीटर इंजेक्षन। इंजेक्शन के बाद तुरंत सरगर्मी बंद करो। आगे की प्रक्रिया के बिना इन नैनोकणों का प्रयोग करें।

इमेजिंग के लिए नैनोकणों के साथ सेल लाइनों की 3. ऊष्मायन

नोट: सभी इमेजिंग प्रयोगों 35 मिमी पेट्री डिश में पूरा किया गया

  1. Nanoparti की तेजसेल लाइनों में Cles
    1. 12 वें पारित होने के लिए अप संस्कृति सेल लाइनों। 35 मिमी पेट्री डिश में 12 वें पारित होने संस्कृति कोशिकाओं पर। 24 घंटे के बाद कोशिकाओं को 40% मिला हुआ हैं कि इस तरह के 35 मिमी पेट्री डिश में जोड़ा कोशिकाओं की एकाग्रता को समायोजित करें।
    2. इस स्तर पर, पेट्री डिश से 10% FBS के साथ पूरक DMEM मीडिया को दूर दो बार 1x DPBS के साथ कोशिकाओं को धोने, और पेट्री डिश के लिए 2 मिलीलीटर DMEM में नैनोकणों निलंबन के 100 μl जोड़ें।
    3. 24 घंटे के बाद पेट्री डिश से DMEM / नैनोकणों निलंबन हटाने और 1x DPBS 3 बार के साथ कोशिकाओं को धो लें। फिर 10 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के साथ incubating द्वारा कोशिकाओं को ठीक। DPBS के साथ दो बार धोएं। 2 मिनट के लिए डाई के साथ incubating द्वारा 300 एनएम DAPI साथ कोशिकाओं दाग। DPBS के साथ दो बार धोएं। फिर इमेजिंग के लिए DPBS में कोशिकाओं रखें।
  2. आरओएस की जांच
    1. संस्कृति A549 और धारा 3.1.1 के रूप में समझाया पेट्री डिश, सेल लाइन के अनुसार 6, में OVCAR3 सेल लाइनों। लेबल करेंपेट्री डिश के रूप में तालिका 1 में दिखाया गया है।
    2. तालिका 1 में दिखाया गया है और 24 घंटे के लिए सेते के रूप में पेट्री डिश में से तीन को 2 मिलीलीटर DMEM में nanoparticle निलंबन के 100 μl जोड़ें। , प्रकाश खुराक प्राप्त 24 घंटे के बाद कोशिकाओं को धोने और HBSS (हांक बैलेंस्ड नमक समाधान) में कोशिकाओं को निलंबित स्वतंत्र मीडिया डाई होगा कि पेट्री डिश के लिए।
    3. 15 मिनट के लिए सौर सिम्युलेटर के दीपक को गर्म। यूवी प्रकाश को फिल्टर करने के लिए दीपक के सामने यूवी फिल्टर रखें। पेट्री डिश की सतह पर 0.5 सूरज (50 मेगावाट / 2 सेमी) तीव्रता प्राप्त करने के लिए दीपक शक्ति का समायोजन करके एक संदर्भ सौर सेल के साथ दीपक जांचना। इस विशेष सेटअप में शर्त यह है कि दीपक को आपूर्ति की 218 डब्ल्यू शक्ति के साथ हासिल की थी।
    4. 180 जम्मू नीचे गणना के रूप में दिखाया / 2 सेमी की एक प्रकाश खुराक में जो परिणाम 60 मिनट के लिए दीपक (ढक्कन खुला) के तहत पेट्री डिश रखें:
      50 मेगावाट / 2 सेमी एक्स 3,600 सेकंड / 1000 = 180 जम्मू / 2 सेमी
    5. HBSS हटाने और धोने के बिना आगे पेट्री डिश के लिए 10% FBS के साथ पूरक 2 मिलीलीटर DMEM मीडिया जोड़ें। एक और 2 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
    6. सकारात्मक नियंत्रण के लिए 30 मिनट के लिए 100 माइक्रोन हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 22) के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
    7. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए डाई के साथ कोशिकाओं incubating द्वारा आरओएस का पता लगाने अभिकर्मक के 5 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के साथ सभी पेट्री डिश में कोशिकाओं दाग।
    8. 10 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के साथ incubating द्वारा कोशिकाओं को ठीक करें। DPBS के साथ दो बार धोएं। 2 मिनट के लिए डाई के साथ incubating द्वारा 300 एनएम DAPI साथ कोशिकाओं दाग। DPBS के साथ दो बार धोएं। फिर इमेजिंग के लिए DPBS में कोशिकाओं रखें।
  3. पीआई और Annexin वी FITC द्वारा apoptosis और नेक्रोसिस
    1. संस्कृति 5 पेट्री डिश में प्रत्येक कोशिका लाइन। शेष 2 पेट्री डिश नियंत्रण के नमूने हो जाएगा, जबकि इन पेट्री डिश में से तीन प्रयोग के लिए किया जाएगा। ई के रूप में नैनोकणों के साथ प्रयोग के लिए 3 पेट्री डिश सेतेखंड 3.1.2 में xplained। नियंत्रण के नमूने नैनोकणों के साथ incubated नहीं कर रहे हैं।
    2. 24 घंटा ऊष्मायन के बाद कदम 3.2.3 का पालन करें।
    3. दीपक (ढक्कन खुला) के तहत 3 प्रयोगात्मक पेट्री डिश में रखें और 20 मिनट, 40 मिनट में एक और 60 मिनट में एक-एक को हटा दें। यह 60, 120 और 180 के आलोक खुराक जम्मू / 2 सेमी, क्रमशः (धारा 3.2.4 में गणना) से अवगत कराया गया है कि तीन नमूने अर्जित करता है। इसके बाद, नियंत्रण पेट्री डिश में से एक के लिए एक 180 जम्मू / 2 सेमी प्रकाश खुराक प्रशासन। यह नैनोकणों के अभाव में लागू प्रकाश खुराक के साथ नियंत्रण है। प्रकाश शेष नियंत्रण नमूना करने के लिए खुराक (कोई नैनोकणों और लागू कोई प्रकाश खुराक) लागू नहीं है।
    4. 10% FBS के साथ पूरक DMEM मीडिया के साथ HBSS बदलें और 4 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में पेट्री डिश में रहते हैं।
    5. 15 मिनट के लिए डाई के साथ कोशिकाओं incubating द्वारा प्रयोगात्मक और Annexin वी FITC के 20 μl के साथ नियंत्रण पेट्री डिश में कोशिकाओं दाग। DPBS के साथ दो बार धोएं। ग दाग2 मिनट के लिए रंगों के साथ incubating द्वारा 300 एनएम DAPI के साथ ही 300 एनएम पीआई (propidium आयोडाइड) के साथ एल। DPBS के साथ दो बार धोएं। फिर इमेजिंग के लिए DPBS में कोशिकाओं रखें।

नैनोकणों 4. आंतरिक cytotoxicity

  1. 96 अच्छी तरह से प्लेट में कोशिकाओं और संवर्धन की गिनती
    1. मीडिया को दूर करने और 10 मिनट के लिए 0.05% trypsin के साथ कोशिकाओं के ऊष्मायन द्वारा पीछा DPBS के साथ कोशिकाओं को दो बार धोने से संस्कृति बोतल से कोशिकाओं फसल। जिसके परिणामस्वरूप सेल के समाधान के लिए 10% FBS के साथ पूरक 2 मिलीलीटर DMEM मीडिया जोड़ें। Singlets में सेल समूहों को अलग करने के लिए ठीक से समाधान मिलाएं।
    2. सेल निलंबन के 100 μl ले लो और 10% FBS के साथ पूरक 900 μl DMEM मीडिया में जोड़ें। अच्छी तरह से मलाएं। एक hemocytometer पर इस निलंबन के 10 μl रखें। Hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना और 4.1.1 4 10 एक्स 5 के लिए कोशिकाओं / एमएल में सेल निलंबन की एकाग्रता को समायोजित।
    3. 5 96 अच्छी तरह प्लेटें 0 घंटा, 24 घंटे के रूप में चिह्नित कर लोआर, 48 घंटा, 72 घंटा और 96 घंटा। इस प्रकार अच्छी तरह / 2500 कोशिकाओं बोने, 2 टेबल के रूप में दिखाया कुओं में 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं / एमएल सेल के समाधान के 50 μl (ते 71 और A549) जोड़ें। OVCAR3 और एमडीए MB-231 सेल लाइनों के लिए एक ही प्रक्रिया है।
    4. 24 घंटे के बाद 1x DPBS के साथ कुओं धोने और तालिका 2 में दिखाया गया है कुओं में नैनोकणों की सांद्रता बढ़ के 50 μl जोड़ें।, 20 से 100 जोड़कर अलग nanoparticle सांद्रता तैयार करें, और DMEM को 2.4.2 से nanoparticle निलंबन के 180 μl के लिए क्रमश: एक अंतिम 0.4 x 10 -4 मिलीग्राम / एमएल के nanoparticle सांद्रता जो पैदावार 2 मिलीलीटर की मात्रा, 2.0 एक्स 10 -4 मिलीग्राम / एमएल, और 3.6 x 10 -4 मिलीग्राम / एमएल प्राप्त करते हैं। प्रत्येक कोशिका लाइन नैनोकणों के प्रत्येक एकाग्रता के लिए triplicates है।
  2. अंधेरे में सेल व्यवहार्यता मापने
    1. तुरंत नैनोकणों जोड़ने के बाद 0 घंटा प्लेट के लिए 10 μl MTT जोड़ें। Formazan क्रिस्टल के लिए 4 घंटे के लिए थाली सेतेए एल एस के रूप में। कुओं में 50 μl solubilization के समाधान जोड़ें। Formazan क्रिस्टल भंग करने के लिए 6 घंटे के लिए थाली सेते हैं।
    2. Microplate रीडर के साथ 570 एनएम पर absorbance रिकॉर्डिंग से 0 घंटा थाली के सेल व्यवहार्यता का आकलन करें।
    3. 24 घंटा थाली के लिए, 1x DPBS के साथ कोशिकाओं को धोने और नैनोकणों के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक के बाद 24 घंटा ऊष्मायन में 50 μl मीडिया जोड़ें। MTT जोड़ें और के रूप में 4.2.1 और 4.2.2 में समझाया प्लेट पढ़ा।
    4. 48 घंटा, 72 घंटा, 96 घंटा प्लेटों के लिए, 1x DPBS के साथ कोशिकाओं को धोने और नैनोकणों के साथ 24 घंटा ऊष्मायन के बाद कुओं में 50 μl मीडिया जोड़ें। शेष समय अवधि के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
    5. 4.2.1 और 4.2.2 के रूप में समझाया 4.2.5) विशेष रूप से समय बिंदुओं पर सेल व्यवहार्यता का आकलन करें।
    6. (एन = 3) 3 बार के लिए पूरा प्रयोग को दोहराने

5. पीडीटी के बाद सेल व्यवहार्यता मापने

  1. कोशिकाओं की गिनती और 96 अच्छी तरह प्लेटों में संवर्धन।
    1. 9 का एक सेट लेबलते 71 + A549 प्लेटें और OVCAR3 + एमडीए MB-231 प्लेटों के लिए दोनों तालिका 3 में दिखाया गया है 6 अच्छी तरह प्लेटें,। 4.1.3 के रूप में दिखाया प्लेटों के लेआउट में ही किया जाएगा।
    2. खंड 4.1.2 में तालिका 2 में दिखाया गया के रूप में ही लेआउट के साथ धारा 4.1 के रूप में समझाया 96 अच्छी तरह प्लेटें बीज।
    3. 24 घंटा प्लेटों के लिए नैनोकणों जोड़ने के बाद 4.1.4 के रूप में समझाया।
    4. नैनोकणों के अलावा के बाद 24 घंटा 1x DPBS के साथ कोशिकाओं को धोने और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 50 μl HBSS जोड़ें।
    5. 3.2.3 के रूप में समझाया संबंधित प्रकाश खुराक के साथ प्लेटों चमकाना।
    6. 10% FBS के साथ पूरक 50 μl DMEM मीडिया के साथ HBSS बदलें और पीडीटी के बाद संबंधित समय अवधि के लिए प्लेटें सेते हैं।
    7. 4.2.1 और 4.2.2 के रूप में समझाया हर समय अवधि के बाद सेल व्यवहार्यता को मापने।

6. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

  1. नैनोकणों के तेज
    1. माइक्रोस्कोप एक के दीपक को चालू करेंएन डी इमेजिंग से पहले लेजर 30 मिनट। माइक्रोस्कोप के मंच पर (धारा 3.1 के रूप में समझाया) तय की कोशिकाओं से युक्त पेट्री डिश में डाल दिया।
    2. तालिका 4 में दिखाया गया है फिल्टर का उपयोग करके नैनोकणों और DAPI से प्रतिदीप्ति लीजिए ImageJ सॉफ्टवेयर में चरण विपरीत, nanoparticle और DAPI ओवरले छवियों।
  2. आरओएस की जांच
    1. इमेजिंग से पहले माइक्रोस्कोप 30 मिनट के लैंप पर बारी। माइक्रोस्कोप के मंच पर (धारा 3.2 में बताया) कोशिकाओं से युक्त पेट्री डिश में डाल दिया।
    2. तालिका 4 में दिखाया गया है फिल्टर का उपयोग करके अभिकर्मक का पता लगाने के नैनोकणों, DAPI, और आरओएस से प्रतिदीप्ति लीजिए ImageJ सॉफ्टवेयर में चरण विपरीत, nanoparticle, DAPI और आरओएस का पता लगाने अभिकर्मक ओवरले छवियों।
  3. पीआई और Annexin वी FITC द्वारा apoptosis और नेक्रोसिस
    1. इमेजिंग से पहले माइक्रोस्कोप 30 मिनट के लैंप पर बारी। के रूप में समझाया (कोशिकाओं से युक्त पेट्री डिश रखोमाइक्रोस्कोप के मंच पर धारा 3.3)।
    2. तालिका 4 में दिखाया गया है फिल्टर का उपयोग करके नैनोकणों, DAPI, पीआई, और Annexin वि FITC से प्रतिदीप्ति लीजिए ImageJ सॉफ्टवेयर में चरण विपरीत, nanoparticle, DAPI, पीआई और Annexin वि FITC ओवरले छवियों।

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Representative Results

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तेज और नैनोकणों के आंतरिक cytotoxicity

50 भार% मिश्रित MEH-पीपीवी / PCBM नैनोकणों ते 71 के साथ incubated रहे थे, एमडीए MB-231, A549 और OVCAR3 सेल लाइनों। PCBM सम्मिश्रण स्तर संयुग्मित पॉलिमर और फुलरीन 14 के बीच आदर्श प्रभारी और ऊर्जा हस्तांतरण गुण प्रदान करने के लिए दिखाया गया है, जो 50% wt PCBM, के रूप में चुना गया था। Nanoparticle तेज की प्रतिदीप्ति छवियों चित्रा 1 बी में दिखाए जाते हैं। प्रकोष्ठों nanoparticle तेज सुनिश्चित करने के लिए नैनोकणों के साथ 24 घंटे के लिए incubated रहे थे। कोशिकाओं तो इमेजिंग से पहले 4% paraformaldehyde के साथ तय है, और कोशिकाओं और नाभिक के स्थान का पता लगाने के क्रम में DAPI साथ दाग रहे थे। छवि के लिए पर्याप्त रूप से अलग कोशिकाओं के क्रम में 40% confluency बनाए रखा गया था। इसी चरण विपरीत छवियों के साथ प्रतिदीप्ति छवियों A549 और OVCAR3 कैंसर कोशिका लाइनों से नैनोकणों के तरजीही तेज चलता है कि वहाँ। नहीं detectable प्रतिदीप्ति ते 71 नियंत्रण में देखा जा सकता हैऔर एमडीए MB-231 कैंसर कोशिका लाइनों, सीमित तेज का संकेत है। दूसरी ओर, A549 और OVCAR3 कैंसर कोशिका लाइनों महत्वपूर्ण nanoparticle तेज दिखा रहे हैं। आंतरिक cytotoxicity (अंधेरे विषाक्तता) ते 71 के साथ 50% wt मिश्रित MEH-पीपीवी / PCBM नैनोकणों के ऊष्मायन द्वारा मूल्यांकन किया गया था, एमडीए MB-231, A549 और OVCAR3 सेल लाइनों और MTT परख द्वारा सेल व्यवहार्यता बढ़ाता। चित्रा 1C में MTT डेटा सेल लाइनों के सामान्य प्रसार दिखा।

आरओएस के स्रोत के रूप में नैनोकणों

नैनोकणों आरओएस के स्रोत हैं, और केवल प्रकाश से संपर्क के बाद, आरओएस गठन एक आरओएस का पता लगाने अभिकर्मक किट के साथ मूल्यांकन किया गया था कि यह सुनिश्चित करने के लिए। । OVCAR3 के लिए डेटा चित्रा 2A में हरी उत्सर्जन की चित्रा 2 अभाव में दिखाए गए हैं - सी नियंत्रण के नमूने लिए गठित नहीं कर रहे हैं आरओएस इंगित करता है। आरओएस का पता लगाने अभिकर्मक से उज्ज्वल हरी उत्सर्जन नैनोकणों के साथ इलाज के नमूने के लिए मनाया जाता है और सामने आ रहा हैआंकड़े 2 डी और (तुरंत पीडीटी के बाद और पीडीटी के बाद 2 घंटा) में दिखाया गया के रूप में प्रकाश के लिए, आरओएस पीडीटी दौरान उत्पन्न कर रहे हैं कि इस बात की पुष्टि।

PDT

MEH-पीपीवी के प्रदर्शन / पीडीटी में PCBM नैनोकणों तुरंत पीडीटी के बाद MTT परख द्वारा मात्रा, और बाद में 4 और 12 घंटे के बाद ऊष्मायन अवधि गया था। डेटा 4 घंटे बाद ऊष्मायन अवधि के लिए 3 चित्र में दिखाया गया है। A549 और OVCAR3 कैंसर कोशिका लाइनों पीडीटी उपचार के बाद महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु का प्रदर्शन: A549 के लिए 60% और 100% तक OVCAR-3 के लिए। ते 71 नियंत्रण और एमडीए MB-231 कैंसर कोशिका लाइनों सीमित प्रभाव दिखा। TE71 एक सामान्य नियंत्रण सेल लाइन है और नैनोकणों internalize करने की उम्मीद नहीं है। ते-71 से नैनोकणों का ही निम्न गैर विशिष्ट तेज प्रयोगात्मक मनाया जाता है। कम nanoparticle तेज की वजह से भी अन्य कैंसर कोशिका लाइनों की तुलना में कम चयापचय दर को इस मामले में है, जो एमडीए MB-231, के लिए मनाया जाता है। पीडीटी डेटा शोMEH-पीपीवी / PCBM नैनोकणों पीडीटी प्रभावशीलता nanoparticle तेज के साथ तराजू पीडीटी sensitizers, और है कि अत्यधिक प्रभावी रहे हैं कि। यहाँ पर विचार कैंसर कोशिका लाइनों के बीच पीडीटी परिणामों में मतभेद इन सेल लाइनों के बीच आक्रामकता में अंतर (चयापचय और endocytosis की दर) के कारण हैं।

पीडीटी प्रेरित सेल मौत की प्रगति

पीआई और Annexin वि FITC के साथ लाइव / मृत डबल धुंधला कोशिका मृत्यु का परिगलित और apoptotic तंत्र के बारे में जानकारी प्रदान करता है। यह धुंधला योजना लाइनों पीडीटी प्रेरित कोशिका मृत्यु रास्ते के बारे में अधिक जानने के लिए पीडीटी के बाद यहां अध्ययन सेल करने के लिए लागू किया गया था। 4 से पता चलता Annexin वि FITC, पीआई और DAPI के साथ दाग ते 71and OVCAR3 सेल लाइनों की छवियों epiluminescence चित्रा। डेटा नैनोकणों नगण्य तेज के साथ संगत ते 71 नियंत्रण सेल लाइन पर पीडीटी का कोई प्रभाव नहीं है, वहाँ है कि दिखा। एक ही अवलोकन (नहीं दिखाया डेटा) एमडीए MB-231 के लिए बनाया गया था। जब OVCAR3 60 में पीडीटी कराना पड़ा और 120 जम्मू / सेमी (बैंगनी) पीआई और Annexin वि FITC (हरा) के 2 दोहरी धुंधला मनाया गया। 180 जम्मू में / 2 सेमी केवल पीआई दाग कि शर्त के तहत तीव्र परिगलित कोशिका मृत्यु, सुझाव मनाया गया।

चित्र 1
चित्रा reprecipitation विधि द्वारा नैनोकणों 1. (क) निर्माण, (बी) ते 71, एमडीए MB-231, A549 और OVCAR3 सेल लाइनों नैनोकणों के साथ incubated। नैनोकणों हरे रंग में दिखाया गया है, नाभिक नीले रंग में दिखाया गया है। प्रतिदीप्ति छवियों, चरण विपरीत छवियों के साथ पैमाने बार = 20 माइक्रोन, (सी) 96 घंटे तक के प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए सेल व्यवहार्यता को मापने के द्वारा मूल्यांकन नैनोकणों के आंतरिक cytotoxicity मढ़ा जाता है। सेल viabilities contr की व्यवहार्यता की स्थापना करके नैनोकणों के नियंत्रण खुराक (0 मिलीग्राम / एमएल) के साथ तुलना कर रहे हैं100% पर राजभाषा के नमूने () नहीं दिखाया। त्रुटि सलाखों 3 अलग प्रयोगों से परिणाम के लिए मानक विचलन कर रहे हैं (एन = 3)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
आरओएस अभिकर्मक का पता लगाने के साथ OVCAR3 सेल लाइन में आरओएस 2. जांच चित्रा। नैनोकणों और जोखिम के साथ (ए) 180 जम्मू / 2 सेमी प्रकाश के संपर्क में कोई नैनोकणों, कोई प्रकाश जोखिम, (ख) कोई नैनोकणों, (सी) 2 एक्स 10 -4 मिलीग्राम / एमएल नैनोकणों, कोई प्रकाश जोखिम, (डी) तुरंत उपचार के बाद लिया 180 जम्मू / 2 सेमी प्रकाश, (ई) 100 μl एच 22 के रूप में सकारात्मक नियंत्रण के साथ 2 घंटे बाद-पीडीटी, (एफ)। डीएफ मैं में चमकीले हरे उत्सर्जन आरओएस के गठन की पुष्टि आरओएस का पता लगाने अभिकर्मक से एस। स्केल बार = 30 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
ते 71 का आंकड़ा 3. सेल viabilities, एमडीए MB-231, नैनोकणों की खुराक में वृद्धि के साथ प्रशासित और 120 जम्मू / 2 सेमी प्रकाश खुराक। पोस्ट-पीडीटी ऊष्मायन समय 4 घंटा है साथ किरणित A549, और OVCAR3 सेल लाइनों। पौराणिक कथा में nanoparticle खुराक 10 -4 मिलीग्राम / एमएल में हैं। त्रुटि सलाखों 3 अलग प्रयोगों से परिणाम के लिए मानक विचलन कर रहे हैं (एन = 3)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Annexin वी FITC और पीआई के साथ चित्रा 4. ते 71 और OVCAR3 का लाइव / मृत धुंधला सेल लाइनों। हरी उत्सर्जन Annexin वी FITC से मेल खाती है, बैंगनी उत्सर्जन पीआई (लाल, नीले DAPI के उत्सर्जन के साथ मिश्रित) से मेल खाती है, और नीले रंग के उत्सर्जन DAPI से मेल खाती है परमाणु दाग। छवियाँ चरण विपरीत और epiluminescence छवियों के ओवरले हैं। स्केल बार = 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा calibrated प्रकाश के साथ कोशिकाओं के प्रदर्शन के लिए 5. सौर सिम्युलेटर सेटअप। एक संदर्भ सौर सेल 0.5 सूर्य के प्रकाश की तीव्रता (50 मेगावाट / 2 सेमी) के पंजीयन इनसेट में दिखाया गया है, जांच के लिए इस्तेमाल किया गया था।/53038/53038fig5large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नकारात्मक नियंत्रण कोई एनपीएस, कोई प्रकाश कोई एनपीएस, प्रकाश के साथ एनपीएस के साथ कोई प्रकाश,
सकारात्मक नियंत्रण 100 μl एच 22 (कोई एनपीएस, कोई प्रकाश) --- ---
प्रयोगात्मक 0 घंटे बाद पीडीटी (एनपीएस और प्रकाश) 2 घंटे बाद पीडीटी (एनपीएस और प्रकाश) ---

तालिका 1: आरओएस का पता लगाने के लिए प्रायोगिक डिजाइन।

0 घंटा प्लेट मीडिया ते 71 A549 मीडिया
कोई इलाज़ नहीं
0 मिलीग्राम / एमएल
0.4 x 10 -4 मिलीग्राम / एमएल
2.0 x 10 -4 मिलीग्राम / एमएल
3.6 x 10 -4 मिलीग्राम / एमएल

तालिका 2: नैनोकणों के ऊष्मायन के लिए 96 अच्छी तरह से थाली के लेआउट नैनोकणों के आंतरिक cytotoxicity मूल्यांकन करने के लिए / पीडीटी प्रभाव

प्लेट नंबर। हल्की खुराक (जम्मू / 2 सेमी) पोस्ट पीडीटी समय (मानव संसाधन)
1 60 0
2 60 4
3 60 12
4 120 0
5 120 4
6 120 12
7 180 0
8 180 4
9 180 12

तालिका 3: पीडीटी मूल्यांकन के लिए 96 अच्छी तरह प्लेटें लेबलिंग।

Fluorophore उत्तेजना फिल्टर Dichroic दर्पण उत्सर्जन फिल्टर माइक्रोस्कोपी उत्तेजना स्रोत
Nanoparticle 488/10 500 एल.पी. 510 एल.पी. Confocal अर-kr आयन लेजर
डीएपीआई 350/52 405 एल.पी. 450/20 Epiluminescence बुध दीपक
पीआई 543/22 562 592/40 Epiluminescence बुध दीपक
Annexin वि FITC 483/30 505 एल.पी. 535/40 Epiluminescence बुध दीपक
आरओएस का पता लगाने अभिकर्मक 491/10 510 DCLP 525/50 Epiluminescence बुध दीपक

इमेजिंग प्रयोगों के लिए तालिका 4. माइक्रोस्कोपी विन्यास।

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Discussion

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नैनोकणों fabricating जबकि nanoparticle तेज लक्ष्य को हासिल करने के लिए यह कुछ महत्वपूर्ण उपायों को बनाए रखने के लिए आवश्यक था। यह इस समाधान की एकाग्रता का गठन किया जा रहा नैनोकणों के आकार का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि मनाया गया THF में (50% wt PCBM के साथ मिश्रित) एक 10 -6 एम MEH-पीपीवी समाधान, डि पानी में इंजेक्षन करने के लिए तैयार किया गया था। एकाग्रता यूवी की तुलना स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा जाँच की थी। प्रोटोकॉल चरण में है कि यह पहली बार इस समाधान के बाद से यूवी विज़ स्पेक्ट्रा लेने से पहले शुरू में तैयार MEH-पीपीवी समाधान (undiluted MEH-पीपीवी शेयर समाधान) को कमजोर करने के लिए जरूरी हो गया था 2.1.3 नोट 1. इंजेक्शन की गति से भी बहुत अधिक से अधिक एक absorbance है यह भी नैनोकणों के आकार तय करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और सख्ती डि पानी सरगर्मी जबकि जितनी जल्दी हो सके हो गया है। धीरे इंजेक्शन बड़ा नैनोकणों में परिणाम होगा। इसके अलावा, सरगर्मी आगे एकत्रीकरण से बचने के लिए इंजेक्शन के बाद तुरंत रोका जाना चाहिए। इंजेक्शन लगाने जबकिसमाधान पानी में नैनोकणों के आकार को प्रभावित करेगा जो बुलबुला गठन से बचने के लिए समाधान में पूरी तरह से सुई डालने जबकि शीशी के अंदर की सतह के पास सुई रखने के लिए आवश्यक है। प्राप्त हमारे प्रयोगों nanoparticle आकार में डीएलएस द्वारा मापा 61.5 ± 23.3 एनएम थे। डीएलएस यह सस्ती, तेज इस आकार के लिए विश्वसनीय और आसानी से उपलब्ध है के रूप में के बजाय मंदिर के लिए चुना गया था। इन नैनोकणों पर जीटा संभावित यानी -9.66 ± 8.12 एम वी, तटस्थ सतह चार्ज करने के लिए थोड़ा नकारात्मक हो पाया था।

इन तकनीकों सेल व्यवहार्यता का एक मात्रात्मक माप प्रदान करता है जो MTT परख के आधार पर कर रहे हैं, क्योंकि यह नैनोकणों के आंतरिक cytotoxicity का मूल्यांकन करते हुए कोशिकाओं की गिनती और पीडीटी परिणाम यों के लिए जरूरी था। यह नेन की खुराक के संबंध में सेल व्यवहार्यता की तुलना के लिए अनुमति देता है जो 96 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक में अच्छी तरह से कोशिकाओं की एक ही नंबर के साथ प्रयोग शुरू करने के लिए आवश्यक हैoparticles और प्रकाश के रूप में अच्छी तरह से नियंत्रण प्रयोगों।

एक सौर सिम्युलेटर नमूने चमकाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। सेटअप चित्रा 5 में दिखाया गया है, और प्रकाश स्रोत, एक यूवी फिल्टर, और एक संदर्भ सौर सेल के होते है। अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों में हुई है, जो वर्णक्रम संपत्तियों के नियंत्रण और प्रकाश स्रोत की तीव्रता का एक उच्च डिग्री हासिल की जा सकती है इस रोशनी योजना के साथ। यह सबसे प्रकाश स्रोतों एक समान तीव्रता प्रोफ़ाइल प्रदान नहीं करते एहसास है कि बहुत महत्वपूर्ण है। सौर सिम्युलेटर, हालांकि, रोशनी के क्षेत्र में निकट वर्दी तीव्रता पूरा करने के लिए गठबंधन किया जा सकता है। इस प्रबुद्ध क्षेत्र के विभिन्न क्षेत्रों में एक संदर्भ सौर सेल द्वारा सत्यापित किया गया था। हम भी हमेशा आगे तीव्रता में भिन्नता के प्रभाव को कम करने के लिए प्रकाश स्थान के एक ही क्षेत्र में और एक ही ओरिएंटेशन में प्लेटों के लिए जगह ख्याल रखा। प्रकाश स्रोत चित्रा 5 में संकेत दूरी नमूने के लिए 50 के साथ हमें प्रदान कीHBSS डाई स्वतंत्र मीडिया सूचक रंगों द्वारा प्रकाश के अवशोषण से बचने के लिए के रूप में इस्तेमाल किया गया था कि इन प्रयोगों के लिए 218 डब्ल्यू के एक बिजली के दीपक सत्ता के अधीन तीव्रता का मेगावाट / 2 सेमी (0.5 सूर्य)। पीडीटी के बाद, कोशिकाओं को फिर से पीडीटी की प्रगति का निरीक्षण करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (पोस्ट-पीडीटी ऊष्मायन) पर निश्चित समय अवधि के लिए incubated रहे थे।

कोशिकाओं का धुंधला संबंधित डाई का सही एकाग्रता खोजने के लिए कुछ परीक्षण और त्रुटि की आवश्यकता है। यह उचित परिणाम प्राप्त किया गया जब तक तेजी से डाई एकाग्रता में वृद्धि करते हुए प्रयोग को दोहराने से हासिल की है।

विधि को भी विशेष रूप से nanoparticle प्रणाली और पीडीटी उपचार के बारे में, सीमाओं की एक जोड़ी है। नैनोकणों reprecipitation विधि द्वारा तैयार कर रहे हैं के बाद से वहाँ बैच से बैच के लिए प्राप्त nanoparticle आकार में कुछ परिवर्तनशीलता है, और nanoparticle आकार में कुछ polydispersity कि नियंत्रित नहीं किया जा सकता मौजूद है। यह भी nanopart बनाने के लिए संभव नहीं किया गया हैआकार में कम से कम 20 एनएम icles। इन सीमाओं विवो में लागू किया जा सकता है कि छोटे आकार monodisperse नैनोकणों के विकास में चुनौतियों का हो सकता है। इसके अलावा, इन-विट्रो पीडीटी प्रयोग कोशिकाओं पर कुछ तनाव लगा सकता है, जो समय की एक विस्तारित राशि के लिए इनक्यूबेटर के बाहर होने की कोशिकाओं की आवश्यकता है।

पीडीटी के लिए इस के साथ साथ चर्चा की विधि वर्तमान दृष्टिकोण के संबंध में महत्वपूर्ण है। छोटे अणु sensitizers और sensitizer डाल दिया गया नैनोकणों का उपयोग कर पीडीटी की वजह से होता है, जो sensitizers के अंधेरे sensitizers की विषाक्तता, प्रकाश के लिए रोगी संवेदनशीलता (कारण sensitizer की गैर चयनात्मक वितरण करने के लिए), और hydrophobicity (साथ महत्वपूर्ण मुद्दों तक सीमित नैदानिक ​​आवेदन देखा गया है कम हो जैव उपलब्धता और संभावित तीव्र विषाक्तता)। सर्जरी में, ट्यूमर शरीर से निकाल दिया जाता है, भले ही कुछ कैंसर की कोशिकाओं को रहने के लिए और छूट में परिणाम कर सकते हैं। रेडियोथेरेपी और कीमोथेरेपी सामान्य ऊतकों में भी प्रभावित होता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) Sigma Aidrich 536512-1G average Mn 150,000-250,000
[6,6]-Phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) Sigma Aidrich 684449-500MG >99.5%
Tetrahydrofuran (THF) EMD TX0284-6 Drisolv
1 ml syringe National Scientific Company 37510-1 For filtration of MEH-PPV solution
Syringe filter VWR 28145-495 25 mm, 0.2 µm, PTFE
1 ml syringe Hamilton Company 81320 For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) Corning (VWR) 45000-350
Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS) Quality Biological (VWR) 10128-740
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x without calcium and magnesium (DPBS) Corning (VWR) 45000-436
Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS) Corning (VWR) 45000-736
Trypsin EDTA 1x 0.25% Corning (VWR) 45000-664 Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences  15710 16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS
DAPI  Biotium VWR 89139-054 Nuclear stain
5 ml pipettes VWR 82050-478
75 cm2 culture flask VWR 82050-856 for culturing cells
96-well plates VWR 82050-771 for MTT assays
Tissue Culture Dishes with Vents Greiner Bio-One (VWR) 82050-538
Propidium iodide Molecular probes P3566
Annexin V FITC Invitrogen A13199 dye for apoptosis
Celltiter 96 non-R 1000 assays Promega (VWR) PAG4000 MTT
CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection Invitrogen C10444 For ROS detection
UV-vis spectrometer Agilent 8453
Fluorescence spectrometer NanoLog HoribaJobin Yvon
Dynamic light scattering PD2000DLS, Precision detector
Incubator NuAir DH Autoflow
Confocal microscope Zeiss Axioskop2 63X oil immersion objective lens
Epiluminescence microscope Olympus IX71 60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera
Solar Simulator Newport 67005 Oriel Instruments
Reference solar cell Oriel  VLSI Standards Incorporated
Microplate reader BioTek Ex808
Hemocytometer Hausser Scientific Partnership 3200 For counting cells

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References

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मिश्रित पॉलिमर / Fullerene Nanoparticle photosensitizers के संचालन के साथ Photodynamic थेरेपी
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Doshi, M., Gesquiere, A. J. Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers. J. Vis. Exp. (104), e53038, doi:10.3791/53038 (2015).More

Doshi, M., Gesquiere, A. J. Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers. J. Vis. Exp. (104), e53038, doi:10.3791/53038 (2015).

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