Terapia Fotodinâmica com Blended polímero condutor / Fullerene Nanoparticle Fotossensibilizadores
Summary
This protocol describes a method for the fabrication of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene. These nanoparticles were investigated for their potential use as a next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT).
Abstract
In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT) is reported. The nanoparticles are formed by hydrophobic interaction of the semiconducting polymer MEH-PPV (poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene]) with the fullerene PCBM (phenyl-C61-butyric acid methyl ester) in the presence of a non-compatible solvent. MEH-PPV has a high extinction coefficient that leads to high rates of triplet formation, and efficient charge and energy transfer to the fullerene PCBM. The latter processes enhance the efficiency of the PDT system through fullerene assisted triplet and radical formation, and ultrafast deactivation of MEH-PPV excited stated. The results reported here show that this nanoparticle PDT sensitizing system is highly effective and shows unexpected specificity to cancer cell lines.
Introduction
Em Terapia Fotodinâmica (PDT) fotossensibilizantes são administrados para atingir o tecido, e após a exposição à luz do fotossensibilizador gera espécies reativas de oxigênio (ROS). ROS espécies, tais como oxigénio atómico e superóxido pode induzir estresse oxidativo e danos estruturais após a células e tecidos 1-4. Devido à sua facilidade de aplicação desse método tem sido activamente investigados e ensaios clínicos foram realizados 5,6. No entanto, os problemas significativos tais como toxicidade no escuro dos sensibilizadores, a sensibilidade do doente a luz (devido a uma distribuição não selectiva do sensibilizador), e hidrofobicidade dos sensibilizadores (o que leva à redução da biodisponibilidade e potencial toxicidade aguda) permanecem.
Relatamos aqui um método para a fabricação e in vitro de avaliação da realização de nanopartículas de polímero misturado com fulereno como os fotossensibilizadores próxima geração para PDT. As nanopartículas são formadas por auto-agregação deo polímero semicondutor MEH-PPV (poli [2-metoxi-5- (2-ethylhexyloxy) -1,4-fenilenovinileno]) com o PCBM fulereno (fenil-C 61 éster metílico do ácido butírico), quando estes materiais dissolvidos numa compatível solvente são rapidamente injectadas num solvente não-compatível (Figura 1A). A escolha de MEH-PPV como o polímero hospedeiro é motivada pelo seu elevado coeficiente de extinção que leva a altas taxas de formação de tripleto, e ao mesmo tempo eficiente e ultra-rápida de carga e energia transferência para o PCBM fulereno 7. Estas propriedades são ideais para a sensibilização de oxigénio atómico e formação de superóxido no PDT.
Fulereno tem de facto sido aplicado no PDT, tanto na forma molecular e nanopartículas de 8-13. No entanto, a citotoxicidade grave tem dificultado o desenvolvimento adicional 12. Aqui nós mostramos que encapsular o fulereno em uma matriz hospedeira de MEH-PPV para produzir nanopartículas compostas MEH-PPV / PCBM resultados em um material de sensibilização PDT que inão é citotóxico intrinsecamente, mostra especificidade para células cancerosas devido ao tamanho das nanopartículas e carga superficial, e os rendimentos de tratamento altamente eficaz na TFD doses baixas de luz devido às propriedades fotofísicas acima mencionados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para conseguir a absorção de nanopartículas, foi necessário manter algumas medidas críticas enquanto a fabricação das nanopartículas. Uma solução de M MEH-PPV 10 -6 (misturado com 50% em peso PCBM) em THF foi preparada para injectar água Dl, uma vez que foi observado que a concentração desta solução desempenha um papel importante na determinação do tamanho das nanopartículas sendo formada. A concentração foi verificada por espectroscopia de Uv-vis. Note-se que no passo 2.1.3 protocolo foi …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge the National Science Foundation (NSF) for financial support of this work through a CAREER award (CBET-0746210) and through award CBET-1159500. We would like to thank Dr. Turkson (Univ. of Hawaii Cancer Center) and Dr. Altomare (Univ. of Central Florida College of Medicine) for assistance with cell culture.
Materials
| Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) | Sigma Aidrich | 536512-1G | average Mn 150,000-250,000 |
| [6,6]-Phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) | Sigma Aidrich | 684449-500MG | > 99.5% |
| Tetrahydrofuran (THF) | EMD | TX0284-6 | Drisolv |
| 1 ml syringe | National Scientific Company | 37510-1 | For filtration of MEH-PPV solution |
| Syringe filter | VWR | 28145-495 | 25 mm, 0.2 µm, PTFE |
| 1 ml syringe | Hamilton Company | 81320 | For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) | Corning (VWR) | 45000-350 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS) | Quality Biological (VWR) | 10128-740 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium (DPBS) | Corning (VWR) | 45000-436 | |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS) | Corning (VWR) | 45000-736 | |
| Trypsin EDTA 1X 0.25% | Corning (VWR) | 45000-664 | Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS |
| DAPI | Biotium VWR | 89139-054 | Nuclear stain |
| 5 ml pipettes | VWR | 82050-478 | |
| 75 cm2 culture flask | VWR | 82050-856 | for culturing cells |
| 96-well plates | VWR | 82050-771 | for MTT assays |
| Tissue Culture Dishes with Vents | Greiner Bio-One (VWR) | 82050-538 | |
| Propidium iodide | Molecular probes | P3566 | |
| Annexin V FITC | Invitrogen | A13199 | dye for apoptosis |
| Celltiter 96 non-R 1000 assays | Promega (VWR) | PAG4000 | MTT |
| CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection | Invitrogen | C10444 | For ROS detection |
| UV-vis spectrometer | Agilent 8453 | ||
| Fluorescence spectrometer | NanoLog HoribaJobin Yvon | ||
| Dynamic light scattering | PD2000DLS, Precision detector | ||
| Incubator | NuAir DH Autoflow | ||
| Confocal microscope | Zeiss Axioskop2 | 63X oil immersion objective lens | |
| Epiluminescence microscope | Olympus IX71 | 60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera | |
| Solar Simulator | Newport 67005 Oriel Instruments | ||
| Reference solar cell | Oriel | VLSI Standards Incorporated | |
| Microplate reader | BioTek Ex808 | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific Partnership | 3200 | For counting cells |
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